斑马鱼相关实验操作

斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育

一、实验目的

了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。

二、斑马鱼的生活和繁殖习性

斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。

斑马鱼具有下列特点：

1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。

2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。

3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。

4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。

5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。

6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本

结构。

因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。

三、实验器材和材料

斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。曝气水10L。性成熟雌、雄性斑马鱼。

四、实验内容和程序

实验前一天的准备：

1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。

2、曝气水

将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。

3、斑马鱼的选取和催产

雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。

选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。一般按2 : 1的比例选择健康的性成熟雄鱼和雌鱼用于交配。选择好的雌、雄鱼放到同一个水槽箱或水盆中，用隔板或者筛网栏隔离。

在养鱼房之外，可用黑布将整个塑料盆或者水槽箱盖住，使光线不能透过而进行黑暗处理。黑暗处理开始的时间根据第二天准备开始进行试验的时间和产卵的光周期而定，保证黑暗处理时间为10小时即可。例如22:00开始，第二天早上约8:00揭开黑布。

4、交配产卵

黑暗处理10小时后进行光照，撤去隔离筛使雌雄鱼混合，并加入金鱼藻作为产卵的鱼巢。雌、雄鱼在光照后很快出现交配追逐并开始产卵，发现产卵后，用胶头滴管将胚胎吸出放入有曝气水的培养皿中进行快速漂洗后，在曝气水中于28℃进行胚胎培养。随后立即观察和记录受精卵的变化和胚胎发育的变化过程和时序。

五、斑马鱼胚胎发育的观察的基本内容和作业

鱼类的卵是端黄卵，进行盘状卵裂，通过观察斑马鱼从受精卵发育成具有自主生活能力的个体的过程了解端黄卵受精后的变化过程和盘状卵裂类型胚胎卵裂和形态模式形成的特点和过程。具体内容包括观察、作图并记录下述发育过程和时序：

1、受精卵的变化和胚盘形成的过程；

2、卵裂的方式和多细胞胚胎——囊胚的形成；

3、原肠形态发生运动——囊胚细胞经过广泛的、全局性的定向细胞运动形成原肠胚和胚胎的基本形体模式的方式、特点和过程；

4、器官发生——脑、眼睛，循环系统，消化系统，骨骼，肌肉等主要器官和系统形成的过程和时序。

附录：斑马鱼胚胎发育图谱和时序（引自Kimmel等，1995）

参考文献：

Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn 1995; 203:253-310.

基因表达研究的显微操作技术

一、实验目的

通过显微操作将目标基因的DNA或者RNA分子注射到受精卵中，以观察其对胚胎发育的影响。这种显微操作技术是研究基因在胚胎发育中功能的重要手段。本实验的目的是了解和掌握显微操作的基本技术。

二、实验器材和材料

显微注射仪，体视镜，200ul移液器，100ul移液器，2.5ul移液器，注射试剂，封口膜，注射专用器皿，注射针，拉针仪。

三、实验内容和程序

1、体视镜操作：体视镜操作主要是通过调整焦距以及两个目镜之间的距离来保证视野内出现清晰且立体的景象。

2、注射仪的操作：注射仪是由定量控制器，显微注射器，手动操作仪以及固定支架等部分组成的精密仪器（图3-1）。控制器参数设置界面如图3-2。定量控制器与电源、显微注射器等的接口如图3-3。

图3-1：显微操作系统

图3-2：定量控制器面板

Output 1-4对应的信号输出端口，绿灯亮表示相应端口有信号输出；

I/W 注射/吸样；

VOLUME SET预设的注射或者吸入注射针的样品体积；

VOLUME COUNTER 实际注射进胚胎或者吸入注射针的样品体积；RATE设置的吸入或者注射速率；

DEVICE TYPE连接的仪器类型（本实验中设置为”K”）；

G/N/D 端口同时输出信号/不同时输出信号/禁用端口；

RUN/STOP 开始或者暂停工作。

图3-3定量控制器背面接口

POWER ON/OFF 开关；

RS232/FOOT SWITCH 外接控制器端口；

OUTPUT 信号输出端口，对应图2的OUTPUT 1-4。

手动操作仪主要用于控制注射针的移动和角度，操作方式如图3-4所示。