酪氨酸酚裂解酶的固定化与转化条件的优化

酪氨酸酚裂解酶的固定化与转化条件的优化

马文静;周景文;徐国强

【摘要】以欧文氏菌(Erwinia herbicola)来源的酪氨酸酚裂解酶的重组大肠埃希菌Escherichia coli BL21为研究对象,研究固定化大肠埃希菌生产L-酪氨酸的条件.以海藻酸钠为载体,采用单因素实验分别考察了载体材料、明胶浓度、反应时间、苯酚浓度和辅助剂(二氧化硅、硅藻土和碳酸钙)等因素对L-酪氨酸生产的影响,发现明胶浓度、反应时间、苯酚和碳酸钙等因素的影响较为显著,进而通过正交实验探索最优条件.结果表明,生产L-酪氨酸的最优条件:载体为4％海藻酸钠与6％明胶的混合载体,苯酚浓度0.08 mol/L,反应时间8 h,于载体中添加0.8％碳酸钙.此条件下,连续反应9次后L-酪氨酸的产量达到64.5 g/L,比优化前提高了451.3％.

【期刊名称】《微生物学杂志》

【年(卷),期】2019(039)001

【总页数】6页(P26-31)

【关键词】L-酪氨酸;酪氨酸酚裂解酶;固定化技术;海藻酸钠

【作者】马文静;周景文;徐国强

【作者单位】江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122

【正文语种】中文

【中图分类】Q93-3

L-酪氨酸是20种氨基酸中的一种，对人和动物的生长发育及新陈代谢起着重要作用，常作为营养增补剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸及以多巴、对羟基苯乙烯等医学化工产品的制备原料，广泛应用于食品、医药和日化等领域[1-2]。酪氨酸也

是构成甲状腺素的重要成分，酪氨酸与神经元的传递有重要关系[3]。它常被用来

治疗忧郁症，甲状腺机能降低，也有助于细胞长久保持年轻化，提高身体免疫力。随着基因工程技术和酶工程技术的发展，生物合成L-酪氨酸将具有更加广阔的应

用前景。固定化细胞是将具有生理功能的微生物细胞包裹在水不容的载体里，使其可循环利用，不断反应发酵的一种技术，广泛应用于食品、医学、制药、化学分析、环境保护、能源开发等多种领域[4-5]。1989年，赵景联[6]通过固定化大肠埃希

菌来生产γ-氨基丁酸，可以使95%的谷氨酸被转化成γ-氨基丁酸，也有人以聚乙烯醇作为固定化载体生产α淀粉酶[7]，还有通过固定化来生产乳酸[8]，用2%的

海藻酸钠固定乳杆菌，可以让固定化球保持150 h的完整性，没有破碎，使L-乳

酸的产量达到45 g/L。本研究采用固定化细胞的方式，用全细胞酶法技术，充分

利用酶活以获得高产量的L-酪氨酸。常用的固定化方法主要有吸附法、共价法、

交联法和包埋法等[9-10]。L-酪氨酸的制备方法有3种：一种是从含有蛋白质的物质(酪蛋白和玉米等)水解液中提取获得；一种是以葡萄糖为原料，以短杆菌突变育种发酵生产获得；最后一种是以苯酚、丙酮酸和氨为底物利用酪氨酸酚裂解酶进行酶法催化生产。而最早对于酶法合成L-酪氨酸由Yamada和Kumagai进行了研

究[11]。酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase，TPL)，也称β-酪氨酸酶，是依赖于磷酸吡哆醛(PLP)的多功能酶，该酶能够催化一系列的反应。TPL在生物体外

可将丙酮酸、氨和苯酚转化产生L-酪氨酸，在生物体内可将L-酪氨酸催化生成氨、丙酮酸和苯酚。该酶主要分布于肠细菌内，也存在于一些嗜热菌和节肢动物体中，其中酶活较高的微生物主要是弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)、草生欧文氏

菌(Erwinia herbicola)以及嗜热菌(Symbiobacterium thermophilum)等[12-13]。关于酶法合成L-酪氨酸的研究已有较多报道[14-15]，另外，常俊俊等[16-17]利

用TPL全细胞催化丙酮酸或者L-丝氨酸合成酪氨酸，以0.1 mol/L丙酮酸和0.1 mol/L苯酚为底物，反应24 h后，酪氨酸产量为16.17 g/L，转化率达78.6%。

本研究考虑到固定化细胞具有可循环利用、易于制备和分离等优势，将固定化细胞技术与酶法生产L-酪氨酸的过程结合在一起，减少了酶的活力损失，同时大大降

低了成本，从而合成更多的L-酪氨酸。分别用海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇及两者

混合物为载体，通过优化载体浓度及发酵过程的条件，以期获得L-酪氨酸的高效

生产。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种以欧文氏菌(Escherichia herbicola)为来源的酪氨酸酚裂解酶的重组大

肠埃希菌E. coli BL21。

1.1.2 培养基 LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，

pH 7.0；TB培养基：胰蛋白胨 12 g/L，酵母提取物 24 g/L，甘油 5 g/L，

KH2PO4 2.31 g/L，K2HPO4 12.54 g/L，pH 7.0；固体培养基在此基础上添加2%琼脂粉。

1.1.3 仪器与设备酵母抽提物和蛋白胨，Oxoid公司；其余化学试剂，国药集团化学试剂有限公司。FE20K pH计，瑞士Mettler-Toledo公司；Eppendorf 5424

高速离心机，美国Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种培养从平板上挑取单菌落在LB种子培养基(kanamycin抗性)中培养10 h，将活化好的种子液以1%(体积比)接种量接入含25 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，培养基中含终质量浓度50 mg/L的氨苄霉素，37 ℃摇床培养2 h，加入终浓度0.2 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)，20 ℃诱导16 h。培养结束后于7 000 r/min离心收集菌体细胞。

1.2.2 固定化技术将收集的菌体用生理盐水配成质量分数为10%的菌体悬液，与

无菌海藻酸钠溶液按体积比为1∶1的比例混合均匀，制备好的菌悬液用电子蠕动泵滴落到配制好的无菌CaC12溶液中形成凝珠，将制好的固定化细胞4 ℃静置2 h后，过滤收集固定化细胞备用。

1.2.3 固定化细胞培养将以1 g湿菌体制作的凝胶球加入20 mL的反应体系：氯

化铵 0.65 mol/L，苯酚 0.1 mol/L，丙酮酸钠 0.1 mol/L，磷酸吡哆醛0.15

μmol/L，曲拉通(Triton X-100)质量分数为0.1%，氨水调节反应体系pH为8.0，20 ℃、220 r/min培养箱中培养10 h。反应结束后加入10 mol/L氢氧化钠溶解

L-酪氨酸，用高效液相色谱检测L-酪氨酸含量。

1.2.4 色谱条件色谱柱：WondaSil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：V(0.1 mmol/L醋酸钠溶液，醋酸调节pH=4.0)∶V(100%甲醇)= 9∶1；紫外检测波长：280 nm；流速：0.6 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。

1.2.5 正交试验在单因素实验的基础上，载体浓度、反应时间、苯酚浓度和碳酸钙4个因素对固定化细胞生产L-酪氨酸的影响较为显著，因此采用这4个因素进行

L9(34)正交试验，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment水平因素载体浓度/%反应时间/h苯酚浓度/(mol·L-1)碳酸钙

/%1480.060.426100.080.638120.10.8