酪氨酸酚裂解酶的固定化与转化条件的优化

酪氨酸酚裂解酶的固定化与转化条件的优化马文静;周景文;徐国强【摘要】以欧文氏菌(Erwinia herbicola)来源的酪氨酸酚裂解酶的重组大肠埃希菌Escherichia coli BL21为研究对象,研究固定化大肠埃希菌生产L-酪氨酸的条件.以海藻酸钠为载体,采用单因素实验分别考察了载体材料、明胶浓度、反应时间、苯酚浓度和辅助剂(二氧化硅、硅藻土和碳酸钙)等因素对L-酪氨酸生产的影响,发现明胶浓度、反应时间、苯酚和碳酸钙等因素的影响较为显著,进而通过正交实验探索最优条件.结果表明,生产L-酪氨酸的最优条件:载体为4％海藻酸钠与6％明胶的混合载体,苯酚浓度0.08 mol/L,反应时间8 h,于载体中添加0.8％碳酸钙.此条件下,连续反应9次后L-酪氨酸的产量达到64.5 g/L,比优化前提高了451.3％.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2019(039)001【总页数】6页(P26-31)【关键词】L-酪氨酸;酪氨酸酚裂解酶;固定化技术;海藻酸钠【作者】马文静;周景文;徐国强【作者单位】江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122【正文语种】中文【中图分类】Q93-3L-酪氨酸是20种氨基酸中的一种，对人和动物的生长发育及新陈代谢起着重要作用，常作为营养增补剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸及以多巴、对羟基苯乙烯等医学化工产品的制备原料，广泛应用于食品、医药和日化等领域[1-2]。

酪氨酸也是构成甲状腺素的重要成分，酪氨酸与神经元的传递有重要关系[3]。

它常被用来治疗忧郁症，甲状腺机能降低，也有助于细胞长久保持年轻化，提高身体免疫力。

随着基因工程技术和酶工程技术的发展，生物合成L-酪氨酸将具有更加广阔的应用前景。

固定化细胞是将具有生理功能的微生物细胞包裹在水不容的载体里，使其可循环利用，不断反应发酵的一种技术，广泛应用于食品、医学、制药、化学分析、环境保护、能源开发等多种领域[4-5]。

1989年，赵景联[6]通过固定化大肠埃希菌来生产γ-氨基丁酸，可以使95%的谷氨酸被转化成γ-氨基丁酸，也有人以聚乙烯醇作为固定化载体生产α淀粉酶[7]，还有通过固定化来生产乳酸[8]，用2%的海藻酸钠固定乳杆菌，可以让固定化球保持150 h的完整性，没有破碎，使L-乳酸的产量达到45 g/L。

本研究采用固定化细胞的方式，用全细胞酶法技术，充分利用酶活以获得高产量的L-酪氨酸。

常用的固定化方法主要有吸附法、共价法、交联法和包埋法等[9-10]。

L-酪氨酸的制备方法有3种：一种是从含有蛋白质的物质(酪蛋白和玉米等)水解液中提取获得；一种是以葡萄糖为原料，以短杆菌突变育种发酵生产获得；最后一种是以苯酚、丙酮酸和氨为底物利用酪氨酸酚裂解酶进行酶法催化生产。

而最早对于酶法合成L-酪氨酸由Yamada和Kumagai进行了研究[11]。

酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase，TPL)，也称β-酪氨酸酶，是依赖于磷酸吡哆醛(PLP)的多功能酶，该酶能够催化一系列的反应。

TPL在生物体外可将丙酮酸、氨和苯酚转化产生L-酪氨酸，在生物体内可将L-酪氨酸催化生成氨、丙酮酸和苯酚。

该酶主要分布于肠细菌内，也存在于一些嗜热菌和节肢动物体中，其中酶活较高的微生物主要是弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)以及嗜热菌(Symbiobacterium thermophilum)等[12-13]。

关于酶法合成L-酪氨酸的研究已有较多报道[14-15]，另外，常俊俊等[16-17]利用TPL全细胞催化丙酮酸或者L-丝氨酸合成酪氨酸，以0.1 mol/L丙酮酸和0.1 mol/L苯酚为底物，反应24 h后，酪氨酸产量为16.17 g/L，转化率达78.6%。

本研究考虑到固定化细胞具有可循环利用、易于制备和分离等优势，将固定化细胞技术与酶法生产L-酪氨酸的过程结合在一起，减少了酶的活力损失，同时大大降低了成本，从而合成更多的L-酪氨酸。

分别用海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇及两者混合物为载体，通过优化载体浓度及发酵过程的条件，以期获得L-酪氨酸的高效生产。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种以欧文氏菌(Escherichia herbicola)为来源的酪氨酸酚裂解酶的重组大肠埃希菌E. coli BL21。

1.1.2 培养基 LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0；TB培养基：胰蛋白胨 12 g/L，酵母提取物 24 g/L，甘油 5 g/L，KH2PO4 2.31 g/L，K2HPO4 12.54 g/L，pH 7.0；固体培养基在此基础上添加2%琼脂粉。

1.1.3 仪器与设备酵母抽提物和蛋白胨，Oxoid公司；其余化学试剂，国药集团化学试剂有限公司。

FE20K pH计，瑞士Mettler-Toledo公司；Eppendorf 5424高速离心机，美国Eppendorf公司。

1.2 方法1.2.1 菌种培养从平板上挑取单菌落在LB种子培养基(kanamycin抗性)中培养10 h，将活化好的种子液以1%(体积比)接种量接入含25 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，培养基中含终质量浓度50 mg/L的氨苄霉素，37 ℃摇床培养2 h，加入终浓度0.2 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)，20 ℃诱导16 h。

培养结束后于7 000 r/min离心收集菌体细胞。

1.2.2 固定化技术将收集的菌体用生理盐水配成质量分数为10%的菌体悬液，与无菌海藻酸钠溶液按体积比为1∶1的比例混合均匀，制备好的菌悬液用电子蠕动泵滴落到配制好的无菌CaC12溶液中形成凝珠，将制好的固定化细胞4 ℃静置2 h后，过滤收集固定化细胞备用。

1.2.3 固定化细胞培养将以1 g湿菌体制作的凝胶球加入20 mL的反应体系：氯化铵 0.65 mol/L，苯酚 0.1 mol/L，丙酮酸钠 0.1 mol/L，磷酸吡哆醛0.15μmol/L，曲拉通(Triton X-100)质量分数为0.1%，氨水调节反应体系pH为8.0，20 ℃、220 r/min培养箱中培养10 h。

反应结束后加入10 mol/L氢氧化钠溶解L-酪氨酸，用高效液相色谱检测L-酪氨酸含量。

1.2.4 色谱条件色谱柱：WondaSil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：V(0.1 mmol/L醋酸钠溶液，醋酸调节pH=4.0)∶V(100%甲醇)= 9∶1；紫外检测波长：280 nm；流速：0.6 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。

1.2.5 正交试验在单因素实验的基础上，载体浓度、反应时间、苯酚浓度和碳酸钙4个因素对固定化细胞生产L-酪氨酸的影响较为显著，因此采用这4个因素进行L9(34)正交试验，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment水平因素载体浓度/%反应时间/h苯酚浓度/(mol·L-1)碳酸钙/%1480.060.426100.080.638120.10.8注：%表示质量分数2 结果与分析2.1 固定化细胞载体的选择用来做固定化细胞的载体有很多，考虑到价格、成本、危险性以及操作的难易程度，选择海藻酸钠、明胶和聚乙烯醇(polyvinylalcohol，PVA)等作为固定化细胞的载体，以戊二醛[18-20]为交联剂，采用包埋和交联结合的方法进行固定化。

分别制作以海藻酸钠、海藻酸钠-明胶和海藻酸钠-PVA为载体，以戊二醛为交联剂的固定化细胞，反应结果如图1。

从图1可以看出，载体中添加戊二醛固定化对TPL的影响较大，几乎没有目的产物L-酪氨酸的积累，而不添加戊二醛的载体中，混合载体海藻酸钠-明胶的效果比单一载体海藻酸钠好，总产量能够达到15.4 g/L。

2.2 固定化细胞载体浓度的选择制作以海藻酸钠和不同浓度明胶的混合载体为载体，分别取质量分数为6%、8%、10%、12%、14%的明胶与4%的海藻酸钠作为混合载体，结果如图2所示。

随着明胶浓度的增加，L-酪氨酸的产量开始提高，但明胶浓度继续增加时，L-酪氨酸的产量开始下降然后再上升，但上升的幅度不大，当6%浓度明胶与4%海藻酸钠为混合载体时，L-酪氨酸的产量达到最高为17.1 g/L，比4%海藻酸钠高13.3%。

图1 不同载体对固定化生产L-酪氨酸的影响Fig.1 The influence of different carrier on the immobilized production of L-tyrosine1:4%海藻酸钠+4%氯化钙；2:4%海藻酸钠+6%明胶+4%氯化钙；3:4%海藻酸钠+4%氯化钙+10%PVA+硼酸；4：4%海藻酸钠+10%PVA+4%氯化钙；5：4%海藻酸钠+4%氯化钙+10%明胶；%表示质量分数；2和4表示两种载体先混合再与菌体混合滴入氯化钙中，3和5表示单独海藻酸钠与菌体混合再滴入氯化钙成球后用明胶或PVA包裹成型1:4% sodium alginate + 4% calcium chloride； 2: 4% sodium alginate + 6% gelatin + 4% calcium chloride； 3: 4% sodium alginate + 4% calciumchloride + 10% PVA + boric acid； 4: 4% sodium alginate + 10% PVA + 4% calcium chloride； 5: 4% sodium alginate + 4% calcium chloride + 10% gelatin. % represents the quality score; 2 and 4 indicate that the two carriers were first mixed with bacteria and then dribbled into calcium chloride; 3 and 5 indicate that sodium alginate alone was mixed with bacteria and then dribbled into calcium chloride and formed into a ball, which was then coated with gelatin or PVA图2 载体浓度对固定化生产L-酪氨酸的影响Fig.2 The influence of carrier concentration on the immobilized production of L-tyrosine2.3 反应时间对发酵生产L-酪氨酸的影响分别制作以质量分数为4%海藻酸钠、4%海藻酸钠与6%明胶为混合载体的固定化细胞，取不同反应时间5、10、12 h，考察反应时间对固定化细胞生产L-酪氨酸的影响。