大蒜SOD的分离与提取
大蒜sod的提取分离和纯化
一、实习时间：２０１１.１２.２８二、实习地点：生科实验室４０８三．实验题目：大蒜中SOD 提取及分离纯化１.实验目的：（１）学习并掌握大蒜SOD 提取与纯化的方法及原理。
（２）学习并掌握邻苯三酚自氧化法测定SOD 酶活的方法。
（３）熟悉考马斯亮蓝测定蛋白含量的实验原理和方法。
２.实验原理：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD5)广泛存在于动植物及微生物体内，可催化细胞内超氧负离子( O 2-) 的歧化反应，使 O 2-转化为 H 2O 2 和 O 2。
因此，SOD 是一种具有抗脂质氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶及功能性酶，在医药、食品、化妆品等领域有着广阔的应用前景。
SOD 是一种亲水性的酸性酶蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，按照其结合的金属离子，主要可分为Fe-SOD 、Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 3种。
Cu/Zn-SOD 是分布最广而且是最重要的SOD ，主要存在于真核细胞的细胞浆内，分子量约为32KD ，一般由两个亚基组成。
SOD 对热、pH 以及某些理化性质有很强的稳定性，即使温度达到60℃，经短时处理酶活几乎无损失；同时，酶活性不受乙醇和氯仿影响，但Cu/Zn-SOD 对氰化物及过氧化氢均敏感。
SOD 不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
Cu/Zn-SOD 由于色氨酸含量低，其最大紫外吸收为258nm ，由于含铜，所以在可见光680nm 处有最大吸收。
国内测定SOD 活力一般采用邻苯三酚自氧化法或改良的邻苯三酚自氧化法。
在碱性条件下，邻苯三酚会迅速自养化生成有色中间产物，同时生成超氧负离子（O 2-）。
中间产物在325 nm 和420nm 波长处均有强烈的光吸收。
邻苯三酚的自氧化速率与O 2-的浓度有关。
当有SOD 存在时，由于它可催化超氧负离子(O 2-) 的歧化反应，生成氧和过氧化氢：222222O H O H O +=+-，从而抑制邻苯三酚的自氧化，阻止了中间产物的积累。
实验五大蒜SOD制备
实验五制备大蒜SOD实验题目：实验原理: 利用丙酮沉淀法，从大蒜汁中分离提取SOD实验原料：新鲜蒜瓣约20g实验仪器：离心机超声波细胞破碎分光光度计辅助仪器：电子天平、圆底烧瓶、烧杯、玻璃棒、真空泵、分液漏斗、研钵等实验试剂：50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)缓冲液、氯仿、乙醇、预冷丙酮、活性测定缓冲液参考书目：[1] 李永利,张众.邻苯三酚自氧化法测定活性 [J].中国卫生检验2000,12,10(6):673[2] 孙永君. 大蒜中SOD 的提取研究[J].化学与生物工程.2005,(10):23～25[3] 邹芝芳,刘佳佳.三种大蒜中提取SOD 的对比研究[J].食品科学2004,34(5)[4] 张丽,罗丽萍,谷力.大蒜SOD 的分离纯化及其低温胁迫下的酶活性[J].吉首大学学报 .2003,24(4)qtw-1操作记录：制备大蒜SOD 操作说明及结果记录：校正天平后，取新鲜蒜瓣 20g↓可以数组合并进行。
组织捣碎机处理10min。
↓合并破碎者，需要先分开，再进行相关操作。
加入50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)150ml 磷酸缓冲液，搅拌均匀。
↓超声破碎(5s+10s)40 times (冰水浴)↓搅拌浸提10min先用纱布过滤，再用漏斗过滤，得滤液↓60℃热变性20min过滤或离心去除沉淀，得上清液，测体积V1。
↓另取适量体积的(20ml)滤液，加2 倍体积的氯仿-乙醇(3：5)，于分液漏斗中振荡5min。
↓分离上层水相，加入等体积的预冷丙酮。
↓搅拌15 分钟，使沉淀完全。
4000rpm,15min 离心，收集沉淀↓注意先称离心管质量将沉淀称重，得产品，计算收率。
部分沉淀用活性测定缓冲液溶解，用于SOD 活性检测，计算总的酶活与得率。
qtw-2实验结果与分析数据整理：1、空离心管质量：第①组 4.131g第②组 4.056g粗体物与容器质量：第①组 4.265g第②组 4.223g产品质量：第①组 4.265-4.131=0.134g第②组 4.223-4.056=0.167g2、冰丙酮沉淀SODqtw-3冰丙酮加入溶液中后出现大量白色絮状沉淀，在10000rpm下高速离心出现淡黄色沉淀。
大蒜的化学实验报告
1. 学习超氧化物歧化酶（SOD）的提取和纯化方法。
2. 掌握SOD活性的测定方法。
3. 了解大蒜中SOD的分布及活性。
二、实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种广泛存在于生物体内的抗氧化酶，能清除体内的超氧阴离子自由基，保护细胞免受氧化损伤。
本实验通过提取大蒜中的SOD，并测定其活性，以了解大蒜中SOD的分布及活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜大蒜、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯酚、三氯乙酸、硫酸铜、盐酸、氢氧化钠、EDTA-Na2等。
2. 实验仪器：高速离心机、电子天平、电热恒温水浴锅、分光光度计、移液器、试管、烧杯等。
四、实验方法1. 大蒜SOD的提取（1）将新鲜大蒜蒜瓣洗净，去皮，捣碎。
（2）加入2倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨至浆状。
（3）在4℃下静置20min，使SOD充分溶解到缓冲液中。
（4）4℃、12,000r/min离心15min，取上清液。
（5）用苯酚法测定上清液中蛋白质含量，计算SOD蛋白浓度。
2. SOD活性的测定（1）在0.02mol/L pH7.4的磷酸缓冲液中，加入适量的NBT（硝基四氮唑蓝）、EDTA-Na2和牛血清白蛋白，配制成反应体系。
（2）取适量SOD样品，加入反应体系中，在波长560nm处测定吸光度。
（3）根据标准曲线计算SOD活性。
1. 大蒜SOD的提取通过高速离心，成功提取了大蒜中的SOD，上清液中的蛋白质含量为2.5mg/mL。
2. SOD活性的测定（1）标准曲线绘制：以不同浓度的SOD标准品为样品，测定吸光度，绘制标准曲线。
（2）样品活性测定：根据标准曲线，计算样品中SOD的活性。
结果：大蒜中SOD活性为20.5U/mg蛋白。
六、实验讨论1. 本实验成功提取了大蒜中的SOD，并测定了其活性。
结果表明，大蒜中含有较高的SOD活性，具有一定的抗氧化作用。
2. 在SOD的提取过程中，采用高速离心和苯酚法测定蛋白质含量，提高了实验的准确性和重复性。
大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定
大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定目的1．掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
2．了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
试剂大蒜，磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l)(PH8.3)，氯仿—乙醇混合液冷丙酮，邻苯三酚，浓盐酸方法1．SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mlPH7.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。
(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2.除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿－乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm 离心15min去沉淀，得粗酶液。
（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3.SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm 离心15min，得到SOD酶沉淀。
将沉淀先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml混匀。
6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。
取1ml备用，其余量取体积。
2. 大蒜SOD的提取液活性测定提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，1）溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50 ×粗酶液稀释:20 ×酶液稀释:10 ×蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280– 0.74A260) ×稀释倍数计算酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量) 总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力试验结果记录：1）2）蛋白质含量的测定：3）提取液：酶活力单位U/ml = 4.0总活力 U = 41.2蛋白质浓度（mg/ml）= 6.09比活力 U/mg = 0.6568粗酶液: 酶活力单位U/ml = 1.3总活力 U = 12.78蛋白质浓度（mg/ml）= 3.542比活力 U/mg = 0.3670酶液: 酶活力单位U/ml = 6.8总活力 U = 65.96蛋白质浓度（mg/ml）= 0.719比活力 U/mg = 9.45764）粗酶液: 纯化倍数 = 0.56回收率 = 0.31酶液: 纯化倍数 = 14.40回收率 = 1.60实验结果讨论：粗酶液的实验结果较为正确，操作较为得当，试剂添加较为合理。
大蒜中提取SOD提取
本科生课程论文封面课程名称 现代生化技术授课学期 学年至 学年第 学期学院 漓江学院专 业 生物技术组 员李翠200913007007王志远200913007008任课教师 刘晓灿老师交稿日期 2010年10月成绩阅读教师签名日 期广西师范大学大蒜细胞SOD的提取与分离【摘要】 SOD（超氧化物歧化酶）是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。
对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果。
超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化.抗衰老.抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可催化超氧负离子进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：。
大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用PH8.7的磷酸缓冲液。
由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
然后根据SOD抑制肾上腺素自氧化的效率，可间接测出SOD酶的活力。
【关键词】：超氧化物歧化酶歧化反应酶活力【引言】超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD）是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。
1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。
超氧化物歧化酶广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属酶类。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子（O2）是人体氧代谢产物，它在体内过多积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
【正文】本实验使用的是大蒜细胞中的超氧化物酶，利用SOD不溶于丙酮，可用丙酮将大蒜中的SOD 析出。
实验 大蒜细胞SOD的提取和分离
实验五大蒜细胞SOD的提取和活力测定一、实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。
大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。
由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
SOD酶活性测定原理：核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入氮蓝四唑（NBT）后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。
当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。
通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值。
二、材料和试剂1．提取试剂：（1）.新鲜蒜瓣（2）.0.05mol/L/0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）（3）.氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5（4）.丙酮：用前需预冷至4-10℃2．测活试剂：（1）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。
4℃冰箱中保存可用1～2d。
（2）7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。
4℃冰箱中保存可用2～3d。
（3）含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L核黄素溶液A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。
实验五-大蒜SOD制备
实验五制备大蒜SOD实验题目：实验原理: 利用丙酮沉淀法，从大蒜汁中分离提取SOD实验原料：新鲜蒜瓣约20g实验仪器：离心机超声波细胞破碎分光光度计辅助仪器：电子天平、圆底烧瓶、烧杯、玻璃棒、真空泵、分液漏斗、研钵等实验试剂：50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)缓冲液、氯仿、乙醇、预冷丙酮、活性测定缓冲液参考书目：[1] 李永利,张众.邻苯三酚自氧化法测定活性 [J].中国卫生检验2000,12,10(6):673[2] 孙永君. 大蒜中SOD 的提取研究[J].化学与生物工程.2005,(10):23～25[3] 邹芝芳,刘佳佳.三种大蒜中提取SOD 的对比研究[J].食品科学2004,34(5)[4] 张丽,罗丽萍,谷力.大蒜SOD 的分离纯化及其低温胁迫下的酶活性[J].吉首大学学报 .2003,24(4)qtw-1操作记录：制备大蒜SOD 操作说明及结果记录：校正天平后，取新鲜蒜瓣 20g↓可以数组合并进行。
组织捣碎机处理10min。
↓合并破碎者，需要先分开，再进行相关操作。
加入50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)150ml 磷酸缓冲液，搅拌均匀。
↓超声破碎(5s+10s)40 times (冰水浴)↓搅拌浸提10min先用纱布过滤，再用漏斗过滤，得滤液↓60℃热变性20min过滤或离心去除沉淀，得上清液，测体积V1。
↓另取适量体积的(20ml)滤液，加2 倍体积的氯仿-乙醇(3：5)，于分液漏斗中振荡5min。
↓分离上层水相，加入等体积的预冷丙酮。
↓搅拌15 分钟，使沉淀完全。
4000rpm,15min 离心，收集沉淀↓注意先称离心管质量将沉淀称重，得产品，计算收率。
部分沉淀用活性测定缓冲液溶解，用于SOD 活性检测，计算总的酶活与得率。
qtw-2实验结果与分析数据整理：1、空离心管质量：第①组 4.131g第②组 4.056g粗体物与容器质量：第①组 4.265g第②组 4.223g产品质量：第①组 4.265-4.131=0.134g第②组 4.223-4.056=0.167g2、冰丙酮沉淀SODqtw-3冰丙酮加入溶液中后出现大量白色絮状沉淀，在10000rpm下高速离心出现淡黄色沉淀。
比较大蒜实验报告
一、实验目的1. 了解大蒜中SOD的提取方法及其酶活力测定原理。
2. 掌握大蒜中SOD的提取与分离实验步骤。
3. 分析大蒜中SOD的提取效果及酶活力。
二、实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可催化超氧负离子进行歧化反应，从而降低细胞内的氧自由基浓度，保护细胞免受氧化损伤。
大蒜中含有丰富的SOD，本实验旨在通过提取和分离大蒜中的SOD，研究其酶活力，为后续研究提供实验数据。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜大蒜、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）、无水乙醇、氯仿、硫酸铵等。
2. 实验仪器：电子天平、高速冷冻离心机、超声波破碎仪、分光光度计、恒温培养箱等。
四、实验步骤1. 大蒜SOD的提取（1）称取150g新鲜大蒜蒜瓣，研磨2倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨至浆状。
（2）静置20min，使SOD充分溶解到缓冲液中。
（3）4℃下以8000r/min离心10min，取上清液。
2. 除杂蛋白（1）取上清液，加入硫酸铵至饱和，静置2h。
（2）4℃下以8000r/min离心10min，收集沉淀。
（3）用0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）溶解沉淀，透析过夜。
3. SOD的纯化（1）将透析后的溶液用氯仿-甲醇（体积比2:1）沉淀蛋白质，静置2h。
（2）4℃下以8000r/min离心10min，收集沉淀。
（3）用0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）溶解沉淀，透析过夜。
4. SOD酶活力测定（1）取一定量的SOD样品，加入0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）稀释至适当浓度。
（2）取0.1ml稀释后的SOD样品，加入0.1ml0.1mol/L邻苯三酚溶液，37℃下反应5min。
（3）立即加入0.1ml0.02mol/LHCl终止反应。
（4）在波长320nm下测定吸光度。
（5）计算酶活力。
五、实验结果与分析1. 大蒜SOD的提取效果根据实验结果，本实验成功提取了大蒜中的SOD，提取率约为0.5%。
实验四大蒜细胞SOD的提取和分离
实验四大蒜细胞SOD的提取和分离实验目的本实验的主要目的是通过对大蒜细胞中SOD的提取和分离，进一步了解SOD酶的性质和结构，为后续的研究奠定实验基础。
实验原理超氧化物歧化酶（SOD），是一种钴酶类的抗氧化酶，广泛存在于大多数细胞中，其主要作用是催化超氧自由基（O2.-）的消除反应，将其转化为氧气和过氧化氢。
SOD的主要作用是稳定细胞内部的氧气，保护细胞免遭氧化破坏，同时也具有防止免疫炎症、抗癌和减轻辐射损伤等多种生理功能。
大蒜细胞中含有多种酶类，其中包括超氧化物歧化酶。
为了提取大蒜细胞中的SOD酶，需要经过以下几个步骤：（1）细胞破碎细胞壁是细胞的第一道障碍。
由于大蒜细胞的细胞壁比较坚硬，所以在提取SOD酶之前，需要先将细胞壁破碎。
这可以通过在液氮中冻结蒜瓣，然后将其粉碎。
随后使用磨菇研钵将蒜瓣粉碎，直到细胞完全破碎。
（2）制备提取液对于大蒜细胞的SOD酶提取，最常用的缓冲液是磷酸盐缓冲液（pH 7.0-8.0）。
缓冲液可以促进酶的保持，并且可以调节溶液的酸碱度。
在制备提取液的过程中，加入组织抑制剂可以抑制其他酶的活性。
（3）离心在将破碎后的大蒜细胞加入提取液之前，需要先将其用离心机离心。
这样可以将细胞碎片和蛋白质分离，避免其与SOD结合并降低SOD的提取效率。
离心过程中，应将速度逐渐加快以分离出不同分子量的组分。
（4）氨基酸分析提取出的SOD酶含有不同的氨基酸成分，可以通过氨基酸分析的方法进一步判断其组成。
实验步骤（1）取5-10g鲜大蒜蒜瓣，进行清洗，切碎成小块；（2）将碎好的蒜瓣放入液氮中冷冻至-20℃，然后取出，加入50mL磷酸盐缓冲液中，并加入10μL组织抑制剂，使用研钵将蒜瓣磨碎至细胞裂解；（3）将混合液转入离心管中，用1000×g离心20min，分离上清液；（5）对提取出的SOD酶进行氨基酸分析，确定其化学组成。
实验结果与分析实验中成功提取出了大蒜细胞中的SOD酶，并进行了氨基酸分析。
大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定
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2．了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
试剂大蒜，磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l)(PH8.3)，氯仿—乙醇混合液冷丙酮，邻苯三酚，浓盐酸方法1．SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mlPH7.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。
(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2.除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿－乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。
（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3.SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。
将沉淀先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml混匀。
6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。
取1ml备用，其余量取体积。
2. 大蒜SOD的提取液活性测定提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，1）溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50 ×粗酶液稀释:20 ×酶液稀释:10 ×蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 – 0.74A260) ×稀释倍数计算酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量) 总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力试验结果记录：1）2）蛋白质含量的测定：3）提取液：酶活力单位U/ml = 4.0总活力 U = 41.2蛋白质浓度（mg/ml）= 6.09比活力 U/mg = 0.6568粗酶液: 酶活力单位U/ml = 1.3总活力 U = 12.78蛋白质浓度（mg/ml）= 3.542比活力 U/mg = 0.3670酶液: 酶活力单位U/ml = 6.8总活力 U = 65.96蛋白质浓度（mg/ml）= 0.719比活力 U/mg = 9.45764）粗酶液: 纯化倍数 = 0.56回收率 = 0.31酶液: 纯化倍数 = 14.40回收率 = 1.60实验结果讨论：粗酶液的实验结果较为正确，操作较为得当，试剂添加较为合理。
大蒜细胞SOD的提取与分离
实验四十五大蒜细胞SOD的提取与分离一. 实验目的学习超氧化物歧化酶的提取与分离方法二. 实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可催化超氧负离子（O2－）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2－＋H2＝＝O2＋H2O2。
大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取。
由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
三. 实验方法及步骤1．组织或细胞破碎称取5g左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。
2．SOD的提取将上述破碎的组织或细胞，加入2－3倍体积的0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000rpm，离心15min，弃沉淀，得提取液。
3．除杂蛋白提取液加入0.25倍体积的氯仿－乙醇混合溶剂搅拌15min，5000rpm离心15min，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。
4．SOD的沉淀分离将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,5000rpm离心15min，得SOD沉淀。
将SOD沉淀溶于0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液中，于55－60℃热15min,离心弃沉淀，得到SOD酶液。
将上述粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。
5．SOD活力测定取3根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液。
(ml)管不加），继续保温反应5min，然后立即测定各管在480nm处的光密度。
对照管与样品管的光密度值分别为A和B。
在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化的50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。
即：酶活力（单位）＝2·（A－B）·N/A式中N――样品稀释倍数；2――抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数（100%/50%）。
若以每毫升样品液的单位数表示，则按下式计算：酶活力单位/ml＝2·（A－B）·N/A ·V/V1＝26·（A－B）·N/A 式中V――反应液体积（6.5ml）；V1――样品液体积（0.5ml）。
最新大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定
大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定目的1．掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
2．了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
试剂大蒜，磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l)(PH8.3)，氯仿—乙醇混合液冷丙酮，邻苯三酚，浓盐酸方法1．SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mlPH7.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。
(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2.除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿－乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm 离心15min去沉淀，得粗酶液。
（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3.SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm 离心15min，得到SOD酶沉淀。
将沉淀先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml混匀。
6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。
取1ml备用，其余量取体积。
2. 大蒜SOD的提取液活性测定提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，1）溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50 ×粗酶液稀释:20 ×酶液稀释:10 ×蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280– 0.74A260) ×稀释倍数计算酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量) 总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力试验结果记录：1）2）蛋白质含量的测定：3）提取液：酶活力单位U/ml = 4.0总活力 U = 41.2蛋白质浓度（mg/ml）= 6.09比活力 U/mg = 0.6568粗酶液: 酶活力单位U/ml = 1.3总活力 U = 12.78蛋白质浓度（mg/ml）= 3.542比活力 U/mg = 0.3670酶液: 酶活力单位U/ml = 6.8总活力 U = 65.96蛋白质浓度（mg/ml）= 0.719比活力 U/mg = 9.45764）粗酶液: 纯化倍数 = 0.56回收率 = 0.31酶液: 纯化倍数 = 14.40回收率 = 1.60实验结果讨论：粗酶液的实验结果较为正确，操作较为得当，试剂添加较为合理。
大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定
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2．了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
试剂大蒜，磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l)(PH8.3)，氯仿—乙醇混合液冷丙酮，邻苯三酚，浓盐酸方法1．SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mlPH7.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。
(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2.除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿－乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。
（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3.SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。
将沉淀先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml混匀。
6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。
取1ml备用，其余量取体积。
2. 大蒜SOD的提取液活性测定提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，1）溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50 ×粗酶液稀释:20 ×酶液稀释:10 ×蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 – 0.74A260) ×稀释倍数计算酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量) 总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力试验结果记录：1）2）蛋白质含量的测定：3）提取液：酶活力单位U/ml = 4.0总活力 U = 41.2蛋白质浓度（mg/ml）= 6.09比活力 U/mg = 0.6568粗酶液: 酶活力单位U/ml = 1.3总活力 U = 12.78蛋白质浓度（mg/ml）= 3.542比活力 U/mg = 0.3670酶液: 酶活力单位U/ml = 6.8总活力 U = 65.96蛋白质浓度（mg/ml）= 0.719比活力 U/mg = 9.45764）粗酶液: 纯化倍数 = 0.56回收率 = 0.31酶液: 纯化倍数 = 14.40回收率 = 1.60实验结果讨论：粗酶液的实验结果较为正确，操作较为得当，试剂添加较为合理。
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大蒜SOD的提取与分离
第九组：赵曙光
李娜
刘鲁
实验目的
1.学习超氧物提取物的分离方法
2.通过大蒜细胞SOD的提取与分离
3.学习和掌握蛋白质和酶的提取与分离的基本原理和操作方法
实验原理
超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可催化超氧负离子（O 2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。
大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。
由于SOD 不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。
过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
由于超氧自由基（O ）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。
并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。
核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O ，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。
当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。
通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。
找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位（U）。
实验器材
冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒、胶头滴管、电子天平、移液管
实验药品
新鲜蒜瓣
0.05mol/L磷酸缓冲液（pH=8.2）Tris
氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5
丙酮：用前需预冷至4-10℃
0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2）
2mmol/L邻苯三酚
实验步骤
1、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。
2、SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。
3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。
4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。
将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60℃热处理15min，得到SOD酶液。
5、SOD活力测定
将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。
试剂空白管对照管样品管
pH=8.2碳酸缓冲液(Tris) 3.0 3.0 3.0
蒸馏水 2.0 1.8 1.7
样品液0 0 0.1
混合均匀静止室温20min
邻苯三酚0 0.2 0.2
加入邻苯三酚迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，在420nm测吸光值
实验结果
实验讨论
注意事项
1.酶液提取时，为了尽可能保持酶的活性，尽可能在冰浴中研磨，在低温中离心。
2.肾上腺素邻苯三酚容易被氧化，故操作时要尽量快。