核酶PPT课件

核酶、反义核酸和小分子RNA（snRNA）是RNA修复的常用工具。 核酶是天然的具有催化能力的RNA分子，能特异性地催化RNA剪接。 经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意给定的RNA 分子。

利用核酶的剪接能力，可引入新的基因功能或修复已有的基因缺陷。
（三）在农业等其他领域的应用
意力已集中到最近发现的具有酶活性的RNA分子上。

1981年，Cech发现四膜虫rRNA的前体在没有蛋白质的情况下能专一 地催化寡聚核苷酸底物的切割与连接，具有分子内催化的活性。

1983年，Altman等发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，在 体外高浓度Mg2+存在下，与留下的RNA部分(M1 RNA)具有与全 酶相同的催化活性。
对Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依赖性 组氨酸，精氨酸促进催化活性
•
极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降低切割活性）
四、核酶的应用
（一）应用于生命起源的研究
• • •
生命的起源？ 新的观点：生命从RNA开始 体内选择技术的应用已经找到了一些催化基本生化反应（如 RNA剪切、连接、合成以及肽键合成等）的核酶，这些结果支

I类内含子
II类内含子
2. 剪切型核酶

这类核酶的作用是只剪不接，催化自身RNA或不同的RNA分
子 自身催化剪切型RNA 异体催化剪切型RNA：核糖核酸酶P(RNaseP)
（二）核酶的结构
•锤头结构 (Hammerhead) •发夹结构(Hairpin) •斧头结构(Axehead) •假结样结构(Pseudoknot-like)

1986年，Cech又证实rRNA前体的内含子能催化分子间反应。
T.Cech的工作
T.Cech的重要发现开始于1981年。 研究目的：细胞中DNA转录成rRNA后，rRNA中一些无意义的

序列，或“内含子”（intron），如何从RNA分子中剪切下来
的。根据过去传统的概念，这一过程必须要有蛋白质酶来完成。
3’
o
o
P
O
o G
Ao
+ o P-oG o
过渡态
C C C U C U
O
C C C U C U
2+ O Mg
o
P
O
OA
o G
o
Mg 2+
P
O
OA
o G
过渡态
金属离子催化
（四）核酸酶P（RNaseP）

RNase P功能：核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的5‘端，
除去多余的序列，形成3’-OH 和 5’-磷酸末端。
（三）核酶是一种金属依赖酶。
金属离子的作用：

特异的结构作用，或参与活性部位的化学过程 促进RNA的总体折叠 二价金属离子（如Mg 2+ ）与底物活性部位直接相互作用， 参与过渡中间复合物的形成
C C C U C U
O o P
OA
C C C U C U
O
C C C U C U
OH OA
+ HOG

IVS具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键。 相信rRNA前体能靠自己完成剪接过程。在一定条件下rRNA前体可以 按一定方式盘绕，进而自己切割自己，以后再把保留rRNA部分的末 端连接起来。即它是可以催化自由底物的具有酶活性的RNA。


RNA分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即 催化其他分子的反应。
(SidneyAltman)
（四）核酶发现的意义
1. 它突破了“酶是蛋白质”的传统概念。
现代的酶定义：酶由生物体内活细胞产生的、具有催化功能的生物大
分子。
2. 核酸性酶的发现对科学家们普遍感兴趣的生命的起源这一问题有了 新的认识，对生物前化学有重要贡献。
长期以来，人们认为所有的生命形式在冗长的相互依赖的循环中，信

过去都认为核酸酶P的催化作用由RNA和蛋白质共同完成的。

而该实验证明，核酸酶P的催化作用是由RNA完成的，而其中
的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用。
核酶的发现对于所有酶都是蛋白质的传统观念提出了挑战。1989年， 核酶的发现者T.Cech和S.Ahman被授予诺贝尔化学奖。
(Thomas Robert Cech)
持了在蛋白质产生以前核酶可能参与催化最初的新陈代谢的设
想。
（二）在医学领域中的应用
•
通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一
性强。
• • 免疫源性低，很少引起免疫反应 针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物， 也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。
RNA治疗——RNA的修复
（三） 核酶的发现
1968年Francis Crick在他的论文“基因密码的起源”一文中提到 “可能第一个酶是具有复制能力的RNA”时，没有人予以注意。


20年后，在1987年第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上Alan Weiner做会议总结时又重复了20年前Francis Crick的话，会议注
具有RNA切割活性； 具有DNA连接酶活性； 具有卟啉金属化酶和过氧化酶活性； 具有DNA水解活性；
具有DNA激酶活性；
具有N2糖基化活性； 具有DNA戴帽活性。
（三）脱氧核酶催化特征
• •
裂解位点为嘌呤、嘧啶连接 双链稳定性越高，酶活性越高
•
• •
结合臂的长度影响酶催化转换性 RNA-DNA 比 RNA-RNA 稳定性差。
1773年，意大利科学家斯帕兰扎尼（L.Spallanzani,1729—1799）设计 了一个巧妙的实验：将肉块放入小巧的金属笼中，然后让鹰吞下去。 过一段时间他将小笼取出，发现肉块消失了。于是，他推断胃液中一 定含有消化肉块的物质。但是什么，他不清楚。 1836年，德国科学家施旺（T.Schwann,1810—1882）从胃液中提取出 了消化蛋白质的物质。解开胃的消化之谜。

RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。 M1RNA具催化作用：375个碱基
体外：
蛋白质作为辅助因子：119个氨基酸残基
体内： M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的。
RNaseP底物的二级结构
（五）影响核酶活性的因素

pH值：pH7.0-7.5时核酶活性最高； 二价金属离子：如Mg 2+ Mn 2+； 抗生素：大多数为抑制效应； 变性剂：
息分子和功能分子是分离的。核酸是信息分子，而蛋白质是功能分子。
核酸性酶的发现给人们以启示，即RNA分子不但有复制的功能，含有
复制的信息，而且还有催化的功能。因此既是信息分子，又是功能分
子。这些新的概念无疑将对生物前化学的研究开辟新的思路。
二、核酶

核酶（ribozyme）泛指一类具有催化功能的RNA分子。一般是指 无需蛋白质参与或不与蛋白质结合，就具有催化功能的RNA分子。
核 酶
Ribozyme
一、概
述
（一） 对酶及生物催化剂的认识的发展
蛋白质类：天然酶 enzyme
极端酶 extremozyme 抗体酶 abzyme 生物催化剂 （Biocatalyst）
克隆酶 遗传修饰酶
生物工程酶
核酸类: Ribozyme
蛋白质工程新酶
Deoxyribozyme、
其它：模拟酶
（二） 酶的发现
S.Altman的研究工作
t-RNA分子的剪接过程。

研究目的：t-RNA分子的剪接过程。 研究发现：在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核糖核酸酶 P （ribonuclease P， RNase P ）中的 RNA能够切割tRNA前体的5’端。


核糖核酸酶P是一种核糖核蛋白, 含有一个单链RNA分子, 长度为375 个碱基，结合一个相对分子质量为20kDa的多肽(119个氨基酸残基)。
T.Cech的工作

研究对象：原生动物四膜虫，其含有一种RNA，其组成中除了核糖体 RNA外还有一个由413个核苷酸组成的插入序列（interveningsequenc， IVS）。

研究发现：转录产物rRNA前体很不稳定，在鸟苷和Mg2+存在下切除 自身的413个核苷酸的内含子（IVS），使两个外显子拼接起来，变成 成熟的rRNA分子。催化反应是在没有任何蛋白质酶的存在下发生的， 称为自我剪接。
（一）核酶（ribozyme）的分类
锤头核酶 发夹核酶 剪切型核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶
根据催化反应
剪接型核酶
RNaseP
I内含子 II内含子
1.剪接型核酶

定义：指RNA分子被磷酸二酯酶水解切割后，伴随着形成新的磷酸 二酯键，即磷酸二酯键的转移反应或称转酯反应。

作用机制：通过既剪又接的方式除去内含子。 分类：



1926年，美国科学家萨姆钠（J.B.Sumner,1887—1955）从刀豆 种子中提取出脲酶的结晶，并通过化学实验证实脲酶是一种蛋白质。

20世纪30年代，科学家们相继提取出多种酶的蛋白质结晶，并指 出酶是一类具有生物催化作用的蛋白质。
20世纪30年代
酶定义：酶是一类具有生物催化作用的蛋白质。
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防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多
价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克
隆等。
五、核酶技术面临的问题
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核酶催化切割反应的可逆性问题
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• • • •
提高催化效率
寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞 使核酶在细胞内有调控地高效表达 增强核酶在细胞内的稳定性 对宿主的损伤问题有待进一步考察