紫外线对枯草芽孢杆菌诱变剖析
紫外诱变技术实验报告
一、实验目的1. 掌握紫外诱变技术的原理和方法。
2. 了解紫外诱变在微生物育种中的应用。
3. 通过实验，筛选出具有较高产酶能力的突变菌株。
二、实验原理紫外诱变技术是利用紫外线照射微生物，使微生物DNA发生突变，从而获得具有优良性状的菌株。
紫外线照射能导致DNA分子中碱基对的改变、缺失或插入，进而影响基因的表达，产生新的遗传性状。
三、实验材料1. 菌种：产淀粉酶枯草芽孢杆菌。
2. 器材：紫外线照射装置、超净工作台、电磁力搅拌器、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。
3. 培养基和试剂：无菌水、75%酒精、0.5％碘液、碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL、可溶性淀粉2g、牛肉膏1g。
四、实验方法1. 菌种活化：将产淀粉酶枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，得到活化菌种。
2. 菌悬液制备：将活化菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 振荡培养3小时，制成菌悬液。
3. 紫外诱变：将菌悬液置于紫外照射装置下，距离20~30cm，照射时间分别为1、2、3分钟，设置对照组（未照射）。
4. 细菌复苏：将照射后的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37℃培养24小时，观察菌落生长情况。
5. 初筛：挑选生长速度较快、菌落形态异常的菌落，进行进一步的淀粉酶活性测定。
6. 淀粉酶活性测定：将挑选的突变菌株接种于可溶性淀粉培养基中，37℃培养24小时，用碘液检测淀粉酶活性。
7. 验证与保存：对具有较高淀粉酶活性的突变菌株进行验证，并保存于甘油管中。
五、实验结果1. 紫外线照射时间对菌落生长的影响：照射1分钟时，菌落生长速度明显降低；照射2分钟时，菌落生长速度有所下降；照射3分钟时，菌落生长速度明显下降。
2. 淀粉酶活性测定结果：经过筛选，发现突变菌株A的淀粉酶活性最高，为对照组的1.5倍。
实验三 紫外线的诱变育种
实验三紫外线的诱变育种（学时：4）一、目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。
二、基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起的是DNA分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
三、菌种与仪器菌种：枯草芽孢杆菌；仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机四、操作步骤1.菌悬液的制备A、取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。
B、将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。
C、用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。
2.平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。
3.紫外线处理A、将紫外线灯开关打开预热约20分钟。
B、取直径9cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。
C、将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。
4.稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。
5.涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。
以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。
6.培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。
注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。
7.计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。
同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。
8.观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。
实验六 环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应
环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应生05 边晔 2010030026周四班同组成员：徐竞实验时间 2012年11月22日一、实验目的1.了解物理因素、化学因素及生物因素抑制或杀死微生物的作用及其试验方法。
2.了解紫外线诱变原理，并初步掌握紫外线诱变育种的方法。
3.练习单菌落划线分离微生物。
二、实验原理在自然界中，微生物分布极其广泛，几乎无处不在，微生物的生长发育受着环境因素的影响。
而不同的微生物及微生物不同的生理状态受环境因素影响的程度也不同，有的环境因素是微生物生长繁殖所必需的条件，有的表现为抑制作用，有的表现为杀菌作用。
温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞结构来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。
微生物群体生长、繁殖最快的温度为其最适生长温度，但它并不等于积累某一代谢产物的最适温度。
粘质沙雷氏菌能产生红色或紫红色色素，菌落表面颜色随着色素量的增加呈现出由橙黄到深红色逐渐加深的变化趋势。
常用的化学消毒剂主要包括重金属及其盐类、有机溶剂(酚、醇、醛等)、卤族元素及其化合物和表面活性剂等。
根据是杀死还是抑制微生物，可分为致死剂和抑制剂。
常用的3个指标：最低抑制浓度（MIC）、半致死剂量和最低致死剂量。
许多微生物在其生命活动过程中能产生某种特殊代谢产物如抗生素，具有选择性地抑制或杀死其他微生物的作用。
不同抗生素的抗菌谱是不同的，某些抗生素只对少数细菌有抗菌作用。
产黄青霉分泌青霉素抑制细菌细胞壁的合成。
青霉素主要抗G＋细菌。
链霉素作用于核糖核酸30S亚基，所以链霉素只作用原核生物。
链霉素以抗G－细菌为主。
紫外线具有杀菌作用主要是因为它诱导形成胸腺嘧啶二聚体来破坏DNA的结构，使其不能正常行使功能。
另外，空气在紫外线照射下产生臭氧(O3)，也有一定杀菌作用。
紫外线杀菌力最强的波长是226-256nm部分。
紫外线透过物质能力很差，所以只适用于空气及物体表面的灭菌，它距离照射物以不超过1.2米为宜。
紫外线对枯草芽孢杆菌产生蛋白酶的诱变效应
紫外线对枯草芽孢杆菌产生蛋白酶的诱变效应一．实验目的1.观察紫外线对枯草芽孢杆菌产生蛋白酶的诱变效应2.学习并掌握物理诱变育种的方法。
二.原理物理诱变因子中以紫外线辐射的使用最为普通，其他物理诱变因子则受设备条件的限制，难以普及。
一般用于诱变育种的物理因子有快中子、60Co、γ-射线和高能电子流β-射线等。
紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有80%左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。
因此，对于微生物菌种选育工作者来说，紫外线作为诱变因子还是应该首先考虑的。
紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。
紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。
紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。
但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。
经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。
另外，照射处理后的菌液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。
三.主要仪器设备与试剂1.菌种：枯草芽孢杆菌BF7658。
2.培养基：①菌体培养基：LB ②初筛培养基：酪蛋白0.5% 葡萄糖0.1% 酵母膏0.1%磷酸氢二钾0.1% 磷酸二氢钾0.05% 琼脂2%3. 主要药品：0.9%氯化钠4. 主要器皿：锥形瓶、50ML离心管、20 W 紫外灯、离心机等。
四.实验方法与步骤1.将过夜培养的枯草芽孢杆菌菌液1mL接种于新鲜LB培养基中2.菌悬液的制备：把对数生长期的菌悬液于2000 r/min离心10 min，倒掉上清液，收集到的菌体用约40mL己灭菌的生理盐水洗涤后，重悬约40 mL生理盐水制备菌悬液。
实验六紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的诱变效应
实验六紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的诱变效应、抗菌素生物效价的评价及裂解性噬菌体效价测定（-----结果分析）•实验目的与要求：•1、学习并掌握物理诱变——紫外射线诱变育种的方法。
学习并掌握计算诱变后存活率及致死率的计算。
学习透明圈和菌落直径大小及HC比值计算。
•2、学会裂解性噬菌体效价测定方法。
•3、学会抗生素效价测定方法及利用检定菌检测微生物代谢产物的抗菌性。
一、紫外诱变枯草芽胞杆菌效应• 1.紫外诱变过程：•紫外线诱变采用15W紫外线杀菌灯；在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热；灯与处理物的距离为30cm；无菌取菌悬液使其厚度为0.5～1.0cm，放在紫外灯的照射台上，开启电磁搅拌器开关。
操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。
•照射时间：未照射前（0时），照射1min，照射2min，照射3min时分别取样0.5ml；每照射到时间马上无菌取样，加到已经编号的第1个试管，为10-1，共有4个时间的10-1 ，分别将其稀释至：•0min 1min 2min 3min•稀释度10-610-710-8 10-610-710-8 10-510-610-7 10-410-510-6•每个稀释度各取0.2ml涂平板，共涂12块平板，做好标记，37℃培养48hr。
• 2.计算致死率•（1）对照样品中活菌数：将培养至48h后对照古板取出进行细胞计数，根据平板上菌勤务员落数，计算出对照样品1ml菌液中的活菌数。
同样方法数出紫外线处理1、2、3min后的细菌数。
•（2）致死率计算：（3）画出致死率曲线：横坐标为照射时间，纵坐标为致死率。
• 3.观察诱变效应•在平板菌落计数后，分别向菌落数在5个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。
•分别测量透明圈菌落计算比值（HC值），与对照平板进行比较。
二、抗菌素滤纸片法测定生物效价• 1.实验操作过程：•（1）将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基灭菌融化，倒平板凝固后，用无菌吸管吸取培养好的试验菌液0.2ml，采用涂布法均匀涂于平皿表面。
实验三 紫外线的诱变育种
实验三紫外线的诱变育种（学时：4）一、目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。
二、基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起的是DNA分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
三、菌种与仪器菌种：枯草芽孢杆菌；仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机四、操作步骤1.菌悬液的制备A、取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。
B、将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。
C、用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。
2.平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。
3.紫外线处理A、将紫外线灯开关打开预热约20分钟。
B、取直径9cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。
C、将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。
4.稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。
5.涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。
以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。
6.培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。
注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。
7.计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。
同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。
8.观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。
紫外线诱变选育酸性α-淀粉酶菌株
Ｋｅ ｒ ｓ ｂ ｃｌ ｓｓ ｂｉｓ ａ ｉ 一ａ ｌｓ ； ｌ ａ—ｖｏｅ ａ ； ｔｔ ｎ ｙ Ｗｏ ｄ ： ａ ｉｕ ｕ ｔｉ；ｃｄ ｌ ｌ ｍｙａｅ ｕｔ ｒ ｉｌｔ ｙ ｍｕａｉ ｒ ｏ
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中 图分 类 号 ：Ｓ ０ ． Ｔ ２ １３ 文献 标 识 码 ： Ｂ
Ｂｒ ｅ ｉ ｇ ｏ ｇ ａ ｉ 一ａ ｙ ａ ｅ ｐｒ ｄ ｉ ｇ ｓ ｒ ｉ ｔ ｌｒ —ｖ ｏ ｅ ｕｔ ｉ ｎ ｅ ｄ ｎ ｆｈｉ ｈ ｃ ｄ ｍ ｌ ｓ ｏ ｕｃ ｎ ｔ ａ ｎ ｗｉｈ ｕ ｔ ａ ｉ ｌｔｍ ａｔｏ
要是 芽孢 杆 菌 和 曲霉 Ｊ 国外 已有 利 用 黑 曲 霉 。 发酵 生产 酸性 仅一淀 粉 酶 的报 道 Ｊ但 我 国 尚未 ， 实现 耐 酸性 一淀 粉 酶工业 化 。本 实 验 以枯 草 芽
精 』 。酸 性 一 粉 酶 的优 点 是能 在 酸性 条件 下 淀
发 挥催 化作 用 ， 从而 实现 淀粉 同步液 化与 糖化 ， 简
摘 要 ： 了提 高菌株 产酶能力 ， 究 了紫外线处理 对枯草 芽孢 杆菌 Ｂ ６ ８产酸性 ０一淀粉 酶 的影响 。结 为 研 Ｆ７ ５ 【
果表 明： 采用 ３ 紫外线照射 ９ 获得较好 的突变效果 ， 用变色圈法初 筛结合摇瓶发 酵复筛 ， ０ｗ ０Ｓ 利 筛选得 到一 株理 想的突变株 ｕ Ｖ一１ ， ２ 其酶活为 ３ １ ． ／ Ｌ， ４ ８ ８Ｕ ｍ 比出发 菌株提 高 了５ ．％ 。对 ｕ ９７ Ｖ—ｌ ２进行 紫外线二次诱 变， 酶活提 高不显 著 ， 表现 出一 定“ 抗性” 。 关键词 ： 枯草 芽孢杆 菌； 酸性 ｅ一淀粉酶 ； ｔ 紫外线 ； 变 诱
紫外诱变实验报告结果
一、实验目的1. 通过紫外线诱变技术，提高微生物的产酶能力。
2. 筛选出具有较高酶活性的突变菌株。
二、实验原理紫外线诱变是一种物理诱变方法，通过紫外线照射微生物细胞，导致DNA分子发生突变，从而产生具有新的遗传特性的菌株。
本实验采用紫外线照射枯草芽孢杆菌，通过透明圈法初筛，筛选出具有较高淀粉酶活性的突变菌株。
三、实验材料1. 菌种：枯草芽孢杆菌2. 器材：紫外线灯、培养皿、涂布器、吸管、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球3. 培养基：可溶性淀粉培养基、牛肉膏培养基、0.5%碘液四、实验方法1. 紫外线照射：将枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏培养基中，培养至对数生长期。
将培养好的菌液用无菌水稀释至一定浓度，取适量菌液均匀涂布于培养皿上，放入紫外灯照射箱中，照射距离为20-30cm，照射时间为1-3分钟。
照射过程中，严格控制死亡率在50%-80%。
2. 初筛：将照射后的菌落用无菌水洗涤，制成菌悬液。
取适量菌悬液涂布于可溶性淀粉培养基上，37℃培养24小时。
观察透明圈的大小，筛选出具有较大透明圈的突变菌株。
3. 酶活性测定：采用淀粉酶活力测定方法，测定筛选出的突变菌株的淀粉酶活性，并与原始菌株进行对比。
五、实验结果1. 紫外线照射后，部分菌株出现透明圈，且透明圈大小不一。
2. 经过初筛，筛选出10株具有较大透明圈的突变菌株。
3. 酶活性测定结果显示，筛选出的10株突变菌株的淀粉酶活性均高于原始菌株，其中菌株A的淀粉酶活性最高，达到原始菌株的1.8倍。
六、讨论与分析1. 紫外线照射能够有效诱导枯草芽孢杆菌产生淀粉酶活性突变菌株，且突变频率较高。
2. 初筛过程中，透明圈大小与淀粉酶活性具有一定的相关性，透明圈越大，酶活性越高。
3. 实验结果表明，通过紫外线诱变技术，可以有效地提高枯草芽孢杆菌的产酶能力，为微生物育种提供了一种新的方法。
七、结论1. 紫外线诱变技术是一种有效提高微生物产酶能力的方法。
2. 本实验筛选出的突变菌株具有较高淀粉酶活性，为后续的发酵生产和应用提供了有利条件。
紫外线对枯草芽孢杆菌生产菌株的诱变与筛选
紫外线对枯草芽孢杆菌生产菌株的诱变与筛选马加强，吴明，马礼鹏，刘博*【摘要】摘要：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种革兰氏阳性菌，具有种类多、分泌蛋白能力强、安全性好等优点，是一种重要工业酶和工业制剂的菌种，被广泛应用于医药、食品、农业、饲料、造纸和纺织等多种领域。
为了进一步提高枯草芽孢杆菌的发酵能力，采用紫外线照射的方法诱导筛选高产菌株。
对通过紫外线诱导提高枯草芽孢杆菌产淀粉酶、蛋白酶、α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase，简称α-ALDC)、3-羟基丁酮(Acetoin)和葡萄糖-1-磷酸(Glucose-1-phosphate，简称G-1-P)能力的条件进行了比较。
【期刊名称】安徽农业科学【年(卷),期】2016(044)017【总页数】4【关键词】枯草芽孢杆菌；紫外线诱导；酶制剂；3-羟基丁酮；葡萄糖-1-磷酸枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，呈直杆状，内生芽孢，好氧，其菌落不透明，呈白色或微黄色，表面粗糙，可将体内生产的蛋白分泌到胞外。
枯草芽孢杆菌广泛分布于土壤、动植物表面和湖波海洋中，正是因为其生活环境的多样化，可以利用多种环境中丰富的物质，所以细菌体内有丰富的产酶系统，具有产生多种酶的潜力，可以生产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶木、聚糖酶、纳豆激酶、维生素、寡糖、小肽、氨基酸、增味剂、葡萄糖-1-磷酸和3-羟基丁酮等，应用于食品、纺织、医药、科研、造纸、皮革、环保与饲料养殖中[1-4]。
枯草芽孢杆菌是经我国农业部认定的2种饲料添加菌种之一，也是美国食品药物管理局(FDA)认定的安全菌种[5]。
枯草芽孢杆菌是工业酶生产的主要菌种之一，仅有由其生产的蛋白酶、淀粉酶。
其中，脂肪酶就占据整个酶市场的50%以上[1,3]。
在食品领域，枯草芽孢杆菌生产的酶占世界食品工业酶总量的60%以上，在我国食品工业酶中由枯草芽孢杆菌生产的酶占85%以上。
一株芽孢杆菌的鉴定和紫外线诱变研究
中 图分 类 号 Ｑ ３ ． ２ ９ ９ １４ 文献标识码 Ｂ 文章编号 １０ ７ ３ （０ ７ １ ４ — ２ ０７— ７ １ ２０ ）３－ １ ０
３ ．Ｔ ｅ ｓ ａ ｎ Ｗａ ｄ ｎ ｉ ｅ ｏ ｂ ａ ｉ ｕ ｕ ｔ ｉ． ｈ ｔ ｉ ｓ ｉ ｅ ｔ ｄ ｔ ｅ Ｂ ｃｌ ｓ ｓ ｂ ｉ ｓ ｒ ｉ ｆ ｌ ｌ
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枯草芽孢杆菌8-32拮抗菌株的紫外诱变选育
枯草芽孢杆菌8-32拮抗菌株的紫外诱变选育高同国;贾天瑶;郭晓军;张冬冬;朱宝成【摘要】为了获得更高拮抗活性的菌株,以对大豆根腐病病原菌具有较强拮抗作用的Bacillus subtilis8-32为实验材料,采用紫外线诱变方法选育具有更高拮抗活性菌株.紫外诱变条件为30 W紫外线,15 cm辐射距离,诱变时间4 min.结果表明,经初筛和复筛,从诱变后菌落形态差异显著的100个菌株中,筛选得到3株(YB-1,YB-2和YB-3)拮抗活性明显增强的菌株,其拮抗活性与对照相比分别提高了50％,55％和50％,并且传代培养10次后其活性保持不变,说明诱变菌株YB-1,YB-2和YB-3遗传性状稳定.【期刊名称】《河北大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(035)006【总页数】6页(P610-615)【关键词】大豆根腐病;枯草芽孢杆菌;尖孢镰刀菌;紫外诱变【作者】高同国;贾天瑶;郭晓军;张冬冬;朱宝成【作者单位】河北农业大学生命科学学院,河北保定071001;河北农业大学生命科学学院,河北保定071001;河北农业大学生命科学学院,河北保定071001;河北农业大学生命科学学院,河北保定071001;河北农业大学生命科学学院,河北保定071001【正文语种】中文【中图分类】Q933第一作者：高同国(1984-)，男，河北邢台人，河北农业大学讲师，博士，主要从事植物真菌病害及生物防治研究.E-mail：**************大豆是世界上重要的粮食及经济作物，近些年由于重茬、迎茬比例不断增加，大豆根腐病日趋严重，成为制约大豆生产的主要病害之一.仅黑龙江垦区大豆根腐病发病率就为75%~90%，感病品种产量损失为5%~10%，严重可达90%以上，有的甚至绝产[1]，给我国经济带来严重损失.大豆根腐病(soybean root rot)是大豆根部和茎部疾病的统称[2]，是一种根治困难、危害严重的常发性土传病害.大豆根腐病在整个生长期都有可能发生，病原菌通过浸染植株的根、茎、叶以及部分豆荚，引起根和茎的腐烂、植株矮化、枯萎,最终导致大豆死亡.大豆根腐病的致病菌有多种，其中以尖孢镰刀菌为主要致病菌[3].目前，对大豆根腐病的治疗主要依靠化学农药，但化学农药的使用造成严重的环境污染，所以生物防治土传染疾病逐渐引起大家的关注[4],并且由于细菌自身的优点，在生物防治中展现出良好的发展前景，因此，用生物来防治疾病的研究与开发有着重要的意义[5-7].目前用于生物防治的菌株中研究最多的是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和假单胞菌属(pseudomonas sp.)，芽孢杆菌可以产生内生芽孢，抗逆能力强，繁殖速度快，营养要求简单，易定殖在植物表面，其逐渐成为世界上生防细菌研究的重点.如Zhang等[8]采用拌种和根施2种方法研究了10株枯草芽孢杆菌在防治镰刀菌引起的根腐病上的效果，其中4株细菌对根腐病的防治效果达到43%~63%.芽孢杆菌BH1对尖孢镰刀菌引起的大豆根腐病的田间防效达56.1%，大豆增产7.6%[9-10]；细菌 BRF-1可促进大豆幼苗生长，在豆长连、重1年和正茬土壤上，对大豆根腐病的防治效果分别达 53.9%,34.4%和 15.8%[11].上述研究均表明芽孢杆菌可以有效地防治大豆根腐病的发生，目前可用于大豆根腐病的商业菌剂中的菌种以枯草芽孢杆菌为主，如Bio safe，Companion，HiStick N/T等[12]，但这些产品主要集中在美国等发达国家，国内对大豆根腐病的防治虽然取得了一定的进展，但是有效的商业化菌剂依然很少.在前期工作中，以大豆根腐病病原菌——尖孢镰刀菌为指示菌，从实验室保存的237株细菌中筛选得到1株对尖孢镰刀菌具有明显拮抗作用的菌株Bacillus subtilis 8-32，平板对峙实验表明其抑菌圈直径达21.62 mm，孢子萌发抑制率达42.5%~71.6%，温室生防效果显示该菌株使大豆根腐病病情指数降低了32.08%.为进一步提高其拮抗能力，本实验拟通过对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)8-32进行紫外诱变，筛选出具有更强拮抗性能的菌株，为8-32菌剂的开发及大豆根腐病的防治奠定基础.生防细菌：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 8-32(本实验室筛选保藏).大豆根腐病病原真菌：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(由中国科学院东北地理与农业生态研究院王光华教授提供).1.2.1 菌种活化尖孢镰刀菌的活化：取保存好的尖孢镰刀菌斜面1支，挑取1块菌落接种在PDA 培养基平板上，倒置放在28 ℃的培养箱中培养，培养3~5 d.枯草芽孢杆菌的活化：取实验室保存好的枯草芽孢杆菌斜面1支，用划线的方法接种在NA培养基平板上，倒置放在37 ℃的培养箱中培养，培养1~2 d.1.2.2 枯草芽孢杆菌8-32生长曲线的测定用竹签挑取活化好的枯草芽孢杆菌，接种到NB培养基中，37 ℃，180 r/min震荡培养12 h.再按1%的接种量接种到新鲜的NB培养基中，37 ℃，180 r/min震荡培养，并每隔2 h取样，测定样品在600 nm波长下的吸光度，并绘制生长曲线[13-14].1.2.3 紫外诱变方法本实验采用分光光度法对枯草芽孢杆菌8-32的生长曲线进行测定，结果见图1.结果显示：0~2 h菌体处于调整期，2~20 h菌体处于对数期，20~90 h菌体处于稳定期；90 h以后菌体死亡速率大于生长速率，菌体处于衰亡期.本实验选取对数期的菌体进行研究，选择生长7 h(对数生长初期)的菌体作为研究对象.根据生长曲线，对培养7 h的菌体进行紫外诱变，在30 W紫外灯，辐射距离15 cm条件下，以NA为培养基，采用梯度稀释涂布平板方法，研究不同辐射时间对8-32菌体存活数量的影响，结果见图2和图3.由图2可知，随着紫外照射时间的延长菌体的存活率越来越低.通过对图2平皿上的菌体计数，计算出不同诱变时间下菌体的存活数量，绘制存活率曲线.由图3可知，当诱变时间为1 min时，其存活率为66.40%，2 min的存活率为26.60%，4 min的存活率为17.5%.对诱变处理4 min，避光培养24 h后形态不同的菌体进行筛选.通过对100个形态不同的菌株进行筛选，得到3株抑菌效果较强的菌株，筛选结果如图4.结果显示：与对照菌相比较，YB-1,YB-2和YB-3的抑菌效果都有所增加，将这3株菌进行保藏并对其复筛，进一步研究其抑菌作用.采用琼脂扩散抑菌圈法对初筛得到的3株抑菌活性较高的菌株(YB-1，YB-2，YB-3)进行复筛，结果见图5.结果表明，诱变后得到的3株细菌YB-1,YB-2和YB-3的抑菌圈直径与对照菌相比较都有明显的增大.与对照菌相比较，YB-1，YB-2和YB-3抑菌圈的平均直径分别增加了50%，55%和50%.对复筛得到的3株抑菌活性较高的菌株进行连续传代培养， YB-1，YB-2和YB-3连续传10代后分别标记为YB-1-C，YB-2-C和YB-3-C.采用琼脂扩散抑菌圈法对传代后的菌株进行稳定检测(图6)，结果显示经过传代培养10代以后，抑菌圈大小未有明显改变，说明本实验筛选得到的3株菌株的高产性状可以稳定遗传.大豆根腐病是引起大豆减产的主要原因之一，生物防治因其高效、安全、无污染等优点越来越引起人们的重视.采用紫外线进行诱变育种是生防菌株常用的育种方法之一，如王静等[16]对枯草芽孢杆菌 B47进行了2次紫外诱变选育，诱变后其菌株对西瓜枯萎病病菌的拮抗能力提高37.5%~68.8%，贾洁等[17]采用紫外诱变后其菌株对大肠杆菌的抗菌活性提高58.49%.本研究通过紫外诱变选育方法也成功筛选出3株拮抗活性明显提高的菌株，其活性与诱变前相比分别提高了50%，55%和50%，并且该3株细菌遗传性状稳定.但研究中未能对突变株的生防效果进行跟踪实验，也未能明确突变株产生的拮抗物质和抗菌谱是否发生了改变，上述问题还需要进一步深入研究.综上所述，本研究通过紫外诱变技术选育出3株具有更高拮抗能力的菌株YB-1，YB-2和YB-3，其拮抗活性分别提高50%，55%和50%，且3株细菌的遗传稳定性良好.[1] 王佳. 大豆根腐病生防菌的鉴定及发酵条件的优化[D]. 哈尔滨:黑龙江大学, 2010： 9-10.WANG Jia. 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实验8紫外线对枯草杆菌的诱变效应
（2）紫外线处理：10 –5和10–6照射45S，10–3和10-4
照射90S，10–1 和10–2照射180S 。以10–7和10 培养，48h后观察并记录结果。
紫外灯功率为30W，照射距离为30cm
-8
平板作对照。处理后的平皿用黑纸包好，置37℃
（3）观察诱变效应：取出平皿，分别向菌落分散开
的平板内加卢戈氏碘液数滴，在菌落周围将出现
注意：硫酸二乙酯有毒，不能接触皮肤，操作时可戴上 一次性乳胶手套。
对照：以同样操作取未经硫酸二乙酯处理的菌液稀
释涂平板（10–3，10–4，10–5各涂2块板）
5.计数：将培养24-48 h后的平板取出进行细胞计数，
并计算出诱变处理15min和30 min后的存活率。
6.观察诱变效应：分别向菌落分散开的平板内滴加 碘液数滴，菌落周围将出现透明圈，分别量5组
2.稀释：取摇瓶培养至对数期的菌液（菌液浓度为
10 8 -10 10 ）0.5 ml 入4.5 ml 生理盐水中，进行10 倍稀释，稀释度为10 –1 - 10 –8 。 3.涂布：取10 –1 - 10 –8的菌液各100 ul涂平板，每个 稀释度涂平板2只。
4.紫外线处理： （1）在暗室或红光下进行紫外线处理。预先打开紫 外灯照射15min ,使光波稳定。
紫外线诱变的主要作用是使细菌DNA链中相邻二个 嘧啶核苷酸形成二聚体，并阻碍双链的解开和复
制，从而引起基因突变，最终导致表型的变化。
受紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处
理过的微生物样品需用黑纸或黑布包裹以避免可见光的
照射。另外，照射处理后的孢子液不要储放太久，以免 突变在黑暗中修复。
实验器材
1.紫外照射箱、37℃恒温培养箱、取液器、 2.无菌平板、试管、无菌涂棒、酒精灯、记号笔、黑纸、 试 管架、无菌吸头等
细菌紫外诱变实验报告
一、实验目的1. 了解紫外线对细菌的诱变作用。
2. 掌握紫外诱变实验的基本原理和方法。
3. 熟悉营养缺陷型菌株的筛选和鉴定方法。
二、实验原理紫外线是一种波长在10-400纳米之间的电磁波，对微生物具有强烈的杀伤作用。
在一定条件下，紫外线可以诱导微生物发生基因突变，从而产生新的遗传特性。
本实验采用紫外线照射大肠杆菌，通过筛选和鉴定营养缺陷型菌株，研究紫外线对细菌的诱变作用。
三、实验材料1. 实验菌株：大肠杆菌（E. coli）2. 培养基：LB培养基、固体LB培养基、营养缺陷型培养基3. 试剂：紫外线灯、青霉素、琼脂糖、无菌水、无菌滤纸、无菌试管、无菌吸管、酒精灯、显微镜等四、实验方法1. 菌株培养：将大肠杆菌接种于LB培养基中，在37℃恒温培养箱中培养过夜。
2. 紫外线照射：将培养好的大肠杆菌均匀涂布于固体LB培养基平板上，置于紫外灯下照射。
照射时间根据实验设计而定，本实验中照射时间为10分钟。
3. 营养缺陷型菌株筛选：将照射后的平板置于37℃恒温培养箱中培养过夜，挑取单菌落接种于营养缺陷型培养基中，观察菌株生长情况。
4. 营养缺陷型菌株鉴定：对生长缓慢或不能生长的菌株进行鉴定，鉴定方法如下：（1）青霉素筛选：将疑似营养缺陷型菌株接种于含有青霉素的LB培养基平板上，观察菌株生长情况。
（2）生长谱法：将疑似营养缺陷型菌株接种于不同氨基酸的营养缺陷型培养基平板上，观察菌株在不同氨基酸培养基上的生长情况。
5. 数据统计与分析：对实验结果进行统计和分析，得出紫外线对大肠杆菌诱变作用的结论。
五、实验结果1. 紫外线照射后，平板上出现部分生长缓慢或不能生长的菌株。
2. 青霉素筛选实验中，部分菌株在含有青霉素的培养基上生长缓慢或不能生长。
3. 生长谱法实验中，部分菌株在特定氨基酸培养基上生长缓慢或不能生长。
六、实验讨论1. 紫外线照射对大肠杆菌的诱变作用：本实验结果表明，紫外线照射可以诱导大肠杆菌发生基因突变，产生营养缺陷型菌株。
紫外线辐射对植物生理生化过程的影响分析
紫外线辐射对植物生理生化过程的影响分析紫外线辐射是来自太阳的电磁辐射中的一种，长期暴露于紫外线辐射下会对生物产生重大影响，植物也不例外。
本文将从植物的生理和生化两个方面来分析紫外线辐射对植物的影响。
一、植物生理过程1.植物生长紫外线辐射中的UV-B是对植物最为危害的部分，长时间的暴露会对植物的光合作用和生长产生影响。
UV-B辐射会表现出两种形式的作用：抑制和刺激。
抑制作用表现在植物生长速度上，UV-B会减缓植物的生长速度。
而刺激作用表现在植物的形态上，高强度的UV-B辐射会促进植物的紫色素和花青素等生长素合成，使植物在一定程度上更有鲜明的色彩。
2.生态适应紫外线辐射的作用一方面是使得植物生理过程产生变化，另一方面也会对植物的生态适应产生影响。
在植物与环境交互中，植物会逐渐适应环境，产生各种形式的生态适应规律。
UV-B辐射就是其中一种外界环境对植物的生态影响之一，它可以已经影响植物的花、叶形态，使植物更能适应自然环境。
3.荧光素合成经实验证明，UV-B辐射会刺激植物合成抗性叶绿素和花青素等生理物质，以及抗氧化物质维生素C 和E等。
这些物质能够吸收自由基、活性氧和紫外线，保护植物免受损伤。
也就是说，UV-B辐射在一定程度上促进了植物的抵御自由基和氧化反应的能力。
二、植物生化过程1.黄酮类物质的合成机制紫外线辐射是刺激诱导物质累积的关键因素，UV-B辐射可以促进植物紫色物质——黄酮类物质的产生。
植物体内存在丰富的黄酮类物质，如花青素、黄酮、苷等，这些成分都在植物生理生化过程中扮演着重要角色。
2.抗氧化酶的活性植物体内存在大量的抗氧化酶，主要是为了保护叶绿素分子和DNA免受氧化损伤，从而维持其正常功能。
紫外线辐射能够通过刺激植物合成抗氧化物质，维护植物体内生物分子的完整性和功能。
3.蛋白质合成紫外线辐射对植物的蛋白质合成也会产生影响。
较强的UV-B辐射会产生机械损伤，刺激植物合成排除损伤细胞的相关蛋白，加上紫外线应激的刺激，将可能对蛋白质的合成活性产生影响。
紫外线对枯草杆菌的诱变效应
倒置培养37,1d。
取出1天前培养的初筛的10个淀粉培养基和5 个普通培养基的培养皿。在培养基上滴加碘液 ，测量每个菌落的直径H和水解圈的直径C，计 算H/C的值并排序。
取出第6天复筛的培养皿，加入碘 液，测量菌落直径和水解圈直径， 计算H/C的值。
取H/C的值排序前3的菌种，在之前保留的普通培 养基平板上找到相应的菌种序号及对照组的菌种， 进行扩繁
紫外线对枯草芽孢杆菌产酶诱变 效应的遗传分析
第二大组 组长：刘梦雅 组员：孙文静、白娟、毛阿威 指导老师：高飞
一、实验目的
1.了解物理因素对遗传物质的影响； 2.了解紫外线诱变原理，掌握微生物的紫 外线诱变技术。
二、实验原理
物理诱变往往被分为电离辐射和非电离辐射。非电离辐射 最典型的就是紫外线，其电磁波谱位置为40~390nm。而由 于DNA分子的紫外吸收峰位于260 nm。因而波长在 200~300 nm之间的紫外线被用于紫外诱变。紫外诱变时的
制备枯草芽孢杆菌菌液
取之前涂布的计算初始菌悬液浓度的3个普通培养 基平板和计算照射后的菌悬液浓度的28个普通培 、养基平板，计算初始菌落数和每个照射强度下的 菌落数，计算致死率。
稀释菌液：10-1—10-5，10-4和 10-5涂布于6个平板，用于计数
紫外线处理：处理组一个平板菌 悬液照射，涂布两个平行，对照 组菌悬液涂布
计算公式：致死率 =（对照1 mL 菌液中活菌数 — 处理后1 mL 菌液中活菌数）/对照1 mL 菌液中活 菌数
取致死率为50%-80%的菌种，1个菌落点植于2 个平行的淀粉培养基平板和1个保存菌种的牛肉膏 蛋白胨培养基平板。点植方法如下图所示：点植 于两线焦点处。
菌种扩繁后，按下图所示方式进行 点植，每个菌种点植于淀粉培养 皿，37℃倒置培养24h。
紫外诱变原理和步骤
紫外诱变原理和步骤嘿，咱今儿个就来唠唠紫外诱变这档子事儿哈！你说这紫外诱变，就好像是给微生物来一场特别的“变身之旅”。
咱先讲讲这原理吧，紫外线这家伙，就像个调皮的小精灵，它能和微生物的遗传物质捣捣乱，让那些遗传物质出现些小差错。
这些小差错呀，就有可能带来新的特性呢！就好比一个人原本走在一条老路上，突然路变了，他就得找新的方向走，说不定就走到一个更有意思的地方去了。
那这紫外诱变具体咋操作呢？听我给你细细道来。
首先呢，得把咱要诱变的微生物培养起来，让它们茁壮成长。
这就像是给运动员准备好赛道，让他们能在上面尽情奔跑。
然后，把这些小家伙们放在紫外线灯下，让紫外线好好地“关照”它们一下。
这时候可就得注意啦，照的时间不能太长也不能太短，就跟炒菜放盐似的，得恰到好处。
接下来呀，把经过紫外线照射的微生物转移到合适的环境中，让它们缓一缓，适应一下这新的变化。
这就好像是运动员跑完比赛后，得休息休息，恢复恢复体力。
然后呢，就等着看这些小家伙们会有啥新变化啦！是不是很有意思呀？你想想看，通过这么一个简单的紫外诱变过程，就有可能让那些小小的微生物变得不一样了。
也许它们会变得更厉害，能生产出更多我们需要的东西；也许它们会有一些新的特性，给我们带来惊喜呢！这就像是在一个大宝藏里挖呀挖呀，说不定啥时候就挖出宝贝来了。
当然啦，这紫外诱变也不是每次都能成功的，有时候可能运气不太好，啥变化也没有。
但那又咋样呢？咱不能因为一次不成功就放弃呀，得继续尝试，说不定下一次就成功了呢！就像咱走路，有时候会碰到绊脚石，但咱不能就坐在那儿不走了呀，得跨过去，继续往前走。
总之呢，紫外诱变就是这么一个神奇又有趣的过程，它让我们看到了微生物世界的无限可能。
咱可以通过它来探索、来发现，说不定就能找到一些对我们特别有用的东西呢！所以呀，别小看了这小小的紫外诱变，它里面的学问可大着呢！你说是不是呀？。
【2019年整理】紫外线诱变育种
紫外线诱变选育α-淀粉高产菌株一、实验目的1.学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。
2.通过诱变技术筛选出高产ɑ-淀粉酶的菌株。
二、实验原理紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。
紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。
被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。
同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。
本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌，通过透明圈法初筛，选择淀粉酶活力高的生产菌株。
三、实验材料1.菌种产淀粉酶枯草芽孢杆菌2.器材装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10m L离心管、（1、5、10m L）吸管、250m L三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球3.培养基和试剂①无菌水、75%酒精②0.5％碘液碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200m L，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。
③选择培养基可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，N a C l0.5g，琼脂2g，蒸馏水100m L，p H6.8～7.0，121℃灭菌20m i n。
④肉汤培养基牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，N a C l0.5g，蒸馏水100m L，p H7.2～7.4，121℃灭菌20m i n。
四、实验步骤1.菌体培养取枯草芽孢杆菌一环接种于盛有20m L肉汤培养基的250m L三角瓶中，于37℃振荡培养12h，即为对数期的菌种。
2.菌悬液的制备取5m L发酵液于10m L离心管中，以3000r/m i n离心10m i n，弃去上清液。
加入无菌水9m L，振荡洗涤，离心10m i n，弃去上清液。
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[5]娄权，陈广平.浸矿微生物紫外诱变选育及浸矿机理研究[J].现代 矿业，2004（2）. 通过微生物的铜离子耐受性培养，选取可以浸出铜离子的酸性浸矿 微生物，并利用紫外线照射对微生物进行诱变培养，培育出一种可 以高效浸出铜离子的酸性浸矿微生物。同时探讨了微生物对铜离子 的耐受性培育和紫外线诱变在高效浸矿微生物选育中的应用，以及 浸矿微生物在矿山中的应用前景。 [6]丁学知，夏立秋.苏云金杆菌高毒力菌株4.0718的快速选育[J].中 国生物防治，2001,17（4）63-166. 不同生态区域的早作地、果园和稻田采集的858份土样中，分离筛 选出苏云垒杆菌30株 选取一株具典型苏云垒杆菌菌落特征和较高杀 虫毒力的菌株70为出发菌株，经紫外线和两次亚硝基胍的交替复合 诱变，显微涂片染色镜检，发现菌体的伴孢晶体的形状、大小、数 量及芽孢与伴孢晶体的比倒与杀虫效力密切相关 以这些特征为参考 进行一佚速韧筛和毒力生测复筛，筛选出一株高毒力突变杀虫菌株 4．0718。该突变袜杀虫毒力与原始菌株相比提高了7．5倍，在6、 12和24h内供试小菜蛾三龄幼虫死亡率分别高达20％ 、97％ 和 100· 此菌株的高效速效杀虫毒力经连续l0代培养能稳定遗传。
实验结论： 实验失败
失败原因分析：细节决定成败
1：制作牛肉膏蛋白胨培养基时，没有调到合适的 PH。 2：培养基灭菌处理没有处理好，导致杂菌没有 灭干净。 3：接种过程中由于在酒精灯上灼烧时间长且 没有完全冷却就进行接种导致菌种被烫死。 培养基培养时没有长出实验中所需菌落。
失败原因
4：紫外线诱变过程及诱变后的稀释操作没有在无菌下进行 在黑暗中培养时间过短。 5：涂平板时离酒精灯远进，导致杂菌进入，最后 菌落没有长出，且其他杂菌生长旺盛。 6：由于以上所有操作都应无菌操作进行，但实际操作没有 做到无菌操作，最后导致平板上菌落较杂，分不清枯草芽 孢杆菌菌落无法计数。
[3]周德明，冯友仁，梁帅.木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶高产 菌株的诱变育种[J].中国林业科技大学学报，2009,10（5）. 利用低能N 注入，对产木质素过氧化物酶(Mnp)和锰过氧化物酶(Lip) 活力均较高的菌株N1023进行诱变，研究了不同能量和不同剂量N+离 子诱变后菌株的存活率与突变率、突变菌株的产酶活力及遗传稳定 性．结果表明：不同能量和不同N 离子剂量注入对菌株有显著影响， 诱变菌株Nlo23j产Mnp~11Lip双酶活力分别提高了27．29％和 22．58％，同时诱变菌株N1o23j有很好的遗传稳定性 。 [4]孟庆云，张鹏.环境参数变化对γ 射线诱变微生物的影响[J].微 生物学通报，2000,27（3）. 报告了在非自然环境中培养选育青霉菌苗株的一些结论。实验表明 随着辐射剂量的增加菌株的致死率也相应增加；当辐照剂量相同时， 与自然环境相比其致死率有所提高，且随着非自然环境参数值的增 加而增加。当电场强度为300kV／m、磁场强度为600G~时，正变率有 一极大值。
存活率 将培养48 h 后的平板 取出进行细胞计数。 根据平板上菌落数， 计算出对照样品1 mL 菌液中的活菌数。
同样计算用紫外线处 理1、2、3min 后的存 活细胞数及致死率。
注
1：紫外线照射时注意保 护眼睛和皮肤。 2：诱变过程及诱变后 的稀释操作在无菌下进行并黑暗中培养。
意 事 项
实验结果分析
实验目的：
学习微生物诱变育种的基本操作方法
实验内容：
1：对枯草芽孢杆菌出发菌株进行处理 制备菌悬液。 2：对紫外线进行诱变处理。
实验材料和用具 1 菌种:枯草芽孢杆菌 2 培养基:淀粉培养基。 3 主要药品:牛肉膏、蛋白胨、 Nacl、可溶性淀粉、碘液，生理盐 水。 4主要器皿:试管、移液管、锥形瓶、 量筒、烧杯、紫外灯、离心机、培 养皿等。
3诱变处理
用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选 择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获 得更好的结果。本实验用紫外线照射的诱变方法。 (1)．紫外线处理 打开紫外灯预热20min。取5mL 菌悬 液放在无菌的培养皿中，同时制作5 份。逐一操作， 将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始进 行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、 l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗中保-6，从10-5 和106 中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释 度均做3 个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养 基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。
4稀释涂平板
取未照射的菌悬液(作为对照)和照射 过的菌悬液各0.5 mL 进行不同程度的稀释。 取最后3 个稀释度的稀释液涂于淀粉培养 基平板上，每个平板加稀释液0.1 mL，用 无菌玻璃刮棒涂匀，培养48 h(用报纸包好 平板)。注意在每个平板背后要标明处理时 间、稀释度。 注：枯草芽孢杆菌诱变前：稀释至10-8， 10-7,10-6，生理盐水 枯草芽孢杆菌照射1min稀释至10-8,107,10-6，生理盐水 枯草芽孢杆菌照射2min稀释至10-8,10-7， 10-6，生理盐水 枯草芽孢杆菌照射3min稀释至10-8，10
教训
1：实验操作提前准备 材料及器材。 2：无菌操作时严格 按照无菌操作 技术操作。 3：紫外线诱变处 理时注意黑暗 培养。 4：遇到不会的要 及时询问，不能 自己随便做。
参考文献：
[1]李豪，车振明.微波诱变微生物育种的研究[J]. 山西食品工业，2005,6（2）. 简要概括了国内外微波诱变育种领域的研究新进 展，对微波的生物学效应及诱变微生物的机 理进行了总结和讨论，在此基础上探讨了微波诱 变微生物育种的应用性研究。最后，对本领域的 发展进行了展望。 [2]孙金旭.乳酒酵母紫外诱变原生质体制备研究[J]. 酿酒科技，2008（6）. 在乳酒酵母原生质体形成率和再生率影响单因素 研究的基础上，对菌龄、酵解温度、酵解时间、 酶浓度、稳渗剂采用L16（4）5正交试验，评价 各因素的影响程度，得出适宜该菌原生质体制备 的条件。
技术路线：
材料器具准备
紫外线诱变处理
菌悬液制备
平板制作 稀释涂平板
计算存活率 及致死率
稀释菌悬液
操作步骤
1.菌悬液制备 将枯草芽孢杆菌接种在牛肉膏蛋白胨培养基上， 37℃培养20h，使其活化，取已培养20 h 的活 化枯草芽孢杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水 将菌苔洗下，倒入离心管中，离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐 水洗涤2 次，最后制成菌悬液，用血球计数板 在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为108/mL。 2. 平板制作 将培养基熔化后，冷至45℃左右倒平板。