原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞移植瘤小鼠模型
CpG ODN协同小鼠肝癌细胞裂解物对小鼠原位移植性肝癌的抑制作用研究
doi：10.3969/j.issn.l000484X.2020.23.006CpG ODN协同小鼠肝癌细胞裂解物对小鼠原位移植性肝癌的抑制作用研究①孙鹏②李欢欢王卫芳窦瑶周晓晶(长春中医药大学临床医学院，长春130117)中图分类号R730.51文献标志码A文章编号1000-484X（2020）23-28424）4[摘要]目的:研究CpG ODN与小鼠肝癌细胞（H22）裂解物（TCL）联用对小鼠原位移植性肝癌的抑制作用及机制初探。
方法:制备H22细胞裂解物和建立BALB/c小鼠原位移植性肝癌模型。
将模型鼠随机分为四组PBS、TCL、CpG ODN和CpG ODN+TCL,观察各组小鼠肿瘤生长情况及小鼠的生存期。
采用细胞毒性淋巴细胞（CTL）杀伤实验观察各组小鼠淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤情况。
用ELISA方法检测CpG ODN协助TCL诱导Th1型细胞因子分泌水平。
结果:与其他组相比CpG ODN+TCL明显抑制了肿瘤生长、延长了荷瘤鼠的生存期（P<0.05）o体内外实验显示，CpG ODN能协同TCL刺激小鼠产生Th1型细胞因子和诱导CTL反应。
结论：以CpG ODN为佐剂的TCL具有抑制小鼠原位移植性肝癌的作用，且这种作用可能由于CpG ODN协同TCL诱导小鼠产生的Th1型细胞因子和CTL反应实现的。
[关键词]肿瘤细胞裂解物;免疫刺激性寡聚脱氧核苷酸;肝癌;Thl型免疫反应Effect of CpG ODN on assisting TCL from liver cancer cells to induce immune response against orthotopic-transplantated liver cancer in miceSUN Peng,LI Huan-Huan,WANG Wei-Fang,DOU Yao,ZHOU Xiao-Jing.Clinical Medical College,Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun130117,China[Abstract]Objective:To study the effect of CpG ODN on assisting TCL from H22cells to induce immune response against or-thotopic-transplantated liver cancer in mice and to explore the mechanism.Methods:We prepared TCL from H22cells and built BALB/c mice with orthotopic-transplantated liver cancer.The model mice were injected divided into PBS group,TCL group,CpG ODN group and CpG ODN+TCL group randomly.The mice were monitored for tumor growth and recoding the survival.CTL killing experiment was used to observe the killing of liver cancer cells by lymphocytes in each group.ELISA was used to detect CpG ODN assisting TCL to induce Th1cytokine secretion level.Results:Compared with other groups,CpG ODN+TCL significantly inhibited the growth of orthotopic transplantation liver cancer cells and prolong survival in mice（P<0.05）.In vivo and vitro experiments,CTL response and Th1-biased cytokine also induced by CpG ODN adjuvanted TCL.Conclusion:TCL with CpG ODN as an adjuvant has the effect of inhibiting orthotopic liver cancer in mice,and this effect may be realized by CpG ODN and TCL-induced Th1cytokine and CTL response in mice.[Key words]TCL；CpG ODN;Liver cancer；Th1immune response肝癌是最常见的肝脏原发恶性肿瘤，其致死率极高［1］。
肝癌小鼠造模实验方法
肝癌小鼠造模实验方法(1)肿瘤细胞悬液的制备小鼠肿瘤细胞用小鼠腹腔培养，然后抽取腹水，是取得大量肿瘤细胞最便捷的方法。
具体操作如下：将肿瘤细胞株复苏后，接种于babl/c（昆明小鼠）腹腔，培养8-10天后，接种小鼠的腹腔内长出含肿瘤细胞的腹水，选择腹水饱满的小鼠，在超净台内于无菌条件下消毒小鼠腹部，用注射器抽取淡腹水为瘤源，放入无菌容器内，加入无菌生理盐水稀释瘤液，小心摇匀，并置冰水上保存。
若用多只动物做瘤源时，则应混合腹水。
(腹水应为淡黄色浓稠液体，若为深黄色或红色则应弃去不用。
)(2)肿瘤细胞计数取少量腹水，放置于干试管内，用生理盐水稀释100倍，用枪头吸取少许腹水，滴于载玻片上，推片，镜下观察细胞形态：细胞为圆形，胞浆均匀，透明，折光性好，分布均匀。
并于镜下进行细胞分类计数，其中肿瘤细胞数应≥95％。
7mL，在小鼠右侧腋下(右侧腋窝(3)肿瘤细胞接种腹水用无菌生理盐水调整细胞浓度为1*106个瘤细胞)（5*106）？。
全程严格无菌操作，皮下？)常规接种H22瘤液0．2mL／只(含2*1040min内完成。
(4)分组与给药昆明小鼠用上法造模，造模后再将腹水瘤小鼠按体重分层，随机分为阳性对照组(CTX)、青蒿素各剂量组(150mg／kg、300mg／kg)、青蒿琥酯P0组(60mg ／kg)、青蒿琥酯ip组(60mg／kg)、青蒿醇提物和青蒿水提物各剂量组(1000mg／kg、4000mg／kg)和模型对照组(Model)，每组各lO只小鼠。
造模24h后，阳性对照组(CTX)20mg／kg和青蒿琥酯ip组(60mg／kg)，腹腔注射0．2mL／只，每天1次，连续lOd：其它组灌胃给药，灌服溶液0．4mL／只，每天1次，连续lOd。
模型对照组仅予等量CMC-Na 溶液，连续lOd。
平均每只小鼠每天给等量鼠料，每周换垫料2次，每日换新鲜水1次。
记录各小鼠死亡的时间。
其他问题：检测药物对肿瘤的抑制作用，给药时间怎么确定？1、造模后第二天给药2、肿瘤长出一定体积后在给药。
迷迭香酸抑制荷瘤小鼠H22肝癌移植瘤生长的作用机制
迷迭香酸抑制荷瘤小鼠H22肝癌移植瘤生长的作用机制曹雯;莫凯;潘金凤;韦斯军;王振宁;尹园【期刊名称】《临床合理用药杂志》【年(卷),期】2024(17)11【摘要】目的观察迷迭香酸抑制荷瘤小鼠H22肝癌移植瘤生长的作用机制。
方法建立肝癌H22荷瘤小鼠模型,根据随机数字表法分为模型组、迷迭香酸组、环磷酰胺(CTX)组,每组5只。
迷迭香酸组灌胃给予迷迭香酸,CTX组腹腔注射CTX,模型组灌胃给予等体积0.9%氯化钠注射液,3组均连续给药14 d。
比较3组肿瘤生长情况、免疫器官指数、肿瘤组织病理变化、T淋巴细胞(CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+))、CD3^(+)、CD4^(+)凋亡率、肿瘤组织中免疫细胞因子[干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-10(IL-10)]水平。
结果给药14 d后,CTX组和迷迭香酸组的肿瘤重量和体积低于模型组(P均<0.01);迷迭香酸组小鼠体质量、胸腺指数和脾脏指数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);CTX组小鼠体质量和胸腺指数低于模型组(P均<0.01),脾脏指数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
HE切片染色结果显示,模型组小鼠肿瘤组织中肿瘤细胞分布密集且数目丰富,坏死细胞较少;CTX组肿瘤细胞数明显减少,细胞排列稀疏,肿瘤细胞坏死较多;迷迭香酸组出现肿瘤细胞凋亡和坏死,肿瘤细胞数目减少。
CTX组脾脏组织中CD3^(+)、CD4^(+)水平高于模型组(P均<0.05),CD8^(+)水平、CD4^(+)/CD8^(+)与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);迷迭香酸组CD4^(+)水平、CD4^(+)/CD8^(+)高于模型组,CD8^(+)水平低于模型组(P<0.05或P<0.01),CD3^(+)水平与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);CTX 组荷瘤小鼠脾脏组织中CD4^(+)、CD8^(+)凋亡率高于模型组,迷迭香酸组CD4^(+)凋亡率低于模型组,CD8^(+)凋亡率高于模型组(P<0.05或P<0.01);CTX 组与迷迭香酸组肿瘤组织中IFN-γ水平高于模型组,TNF-α、IL-10水平低于模型组(P<0.05或P<0.01)。
疾病小鼠模型系列之肝癌篇
疾病小鼠模型系列之肝癌篇前面疾病模型专题已经为大家介绍了肺癌及胃癌小鼠模型，今天是疾病模型专题第三讲，小编将为大家介绍肝癌相关的小鼠模型。
近年来，肝癌的发病率在全球呈上升趋势。
根据美国癌症学会官方期刊发表的《2018年全球癌症统计数据》报告显示[1]，肝癌发生率高居恶性肿瘤第六位，是导致癌症相关死亡的第四大疾病(Fig.1)。
其中，中国的肝癌病例数占全世界总数的55%，肝癌已经成为我们的国家病。
Fig.1 排名前10的癌症在全球范围内的发病和死亡占比诱导肝癌发生的相关因素特别多，诸如：病毒，化学致癌物，酒精等，但其确切的发病机制目前尚不清楚。
因此，建立与人类肝癌生物学特性相近的动物模型，对于肝癌发病机制的研究以及药物开发具有重要的现实意义。
首先我们一起来了解肝癌基本知识！肝癌的分类肝癌主要分为原发性及继发性两种。
●原发性肝癌：肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌肿，为我国常见恶性肿瘤之一。
原发性肝癌根据不同的组织类型分为：肝细胞肝癌(HCC)和肝内胆管细胞癌(ICC)，其中HCC最为常见，约占70-85%。
●继发性肝癌：又称为转移性肝癌，其他脏器的肿瘤细胞经过血液、淋巴或直接侵入肝脏引发的肿瘤。
肝癌的发展进程肝癌的发生是一个多阶段逐渐演变恶化的过程，从最初的肝炎到肝硬化，再到最后的肝癌，是一个多步骤的发展过程[2]。
Fig.2 肝损伤不同阶段(图片来自于网络)由于不同病因会引发不同基因的改变，导致肝癌具有异质性(Fig.3)[3]，因此肝癌模型不具有普遍性。
接下来，小编就目前常用的肝癌模型进行综述，供广大研究者进行参考。
Fig.3 常见的肝癌模型病理图（a.DEN诱发的肝癌; b. DEN+CCl4诱发的肝癌；c.Mdr2肝特异性敲除引发的肝癌；d.Tak1肝特异性敲除引发的肝癌; e.Pten肝特异性敲除引发的肝癌;f.原位注射肿瘤细胞引发的肝癌）常见的肝癌动物模型01 01诱发性肝癌模型许多化学致癌剂达到足够的剂量及时间可诱发动物形成肿瘤。
BALB／c小鼠原位移植肝癌模型的建立及鉴定
ｑ Ａｃ ｔ ａ Ａｃ ａ ｄ Ｍｅ ｄ Ｗｅ ｉ ｆ ａ ｎ ｇ Ｖ ｏ １ ． ３ ７ Ｎｏ ． １ ２ ０ １ ５
肝癌模 型是 目前肝 癌实 验研 究最理 想 的动物 模 型 。但 原位 移植 手术 操作 难度 大 ， 有 很 多技术 难题 需要 攻克 ， 因此 本课 题组 经 反复 实 验 和 改进 ， 建 立 了一 种 简 单有 效 的小 鼠原位 移植 肝 癌 模 型 ， 为 肝 癌 的研 究 提 供 了有
术后 １只小 鼠麻醉 未苏 醒死亡 ， 其 他均 于 当天苏 醒 ， 第
２天 活动正 常 。２周 后 ， 人 道 主义 处 死 小 鼠 ， 解 剖 取 出
肝脏 ， 肉眼可见 有乳 白色瘤 结节 形成 （ 图３ ） ， 除 １只未
见 明显 肿瘤 外 ， 其它 小 鼠均有肿 瘤 发生 ， 小 鼠存 活 率和
常肝 组 织标本 用 １ ０ ％ 中性 甲醛 固定 ２ ｄ后做 病 理 学 检 色， 光 学显微 镜下 观察 。
２ 实 验 结 果
１ ． １ 材料
Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ小 鼠 ， 雄性 ， ４～６周 龄 ， 体重 ２ ０ ｇ
左右 ， Ｓ Ｐ Ｆ级 ， 购 自山 东 大学 动 物 中心 ， 动 物 合格 证 号 为０ ０ １ ４ ６ ５ ４， 实验 和饲 养 条 件 严 格 按 照 Ｓ Ｐ Ｆ动 物 的规 范要 求 ； Ｈ ２ ２细 胞 ， 本 室 常规 保 存 ， 传 代 培 养 。Ｄ ＭＥ Ｍ 培 养基 及 １ ６ ４ ０培 养 基 购 自 Ｇ Ｉ Ｂ Ｃ Ｏ公 司 ， 胎 牛 血 清 购 自杭州 四季青 生 物制 品研 究 所 。 １ ０ ％水 合 氯 醛 、 注 射 器、 剪刀、 镊子 、 美翼牌 可 吸收 Ｐ Ｇ Ａ无 菌 缝合 线 及爱 惜 康 的慕 丝 非 吸 收性 缝 线 购 自潍 坊 市 人 民医 院。 １ ０ １ ￣ １
小鼠肝癌原位移植模型的建立及其意义的研究
小鼠肝癌原位移植模型的建立及其意义的研究项亮亮;侯杰;王婕;焦成斌【摘要】目的:探讨用肝癌H22细胞建立小鼠肝癌原位移植模型.方法:将肝癌H22细胞注入小鼠腹腔内,建立异位移植模型;抽取腹水中癌细胞接种于小鼠肝实质内,建立原位移植模型.结果:移植后10d可扪及肿瘤生长,模型成功率94.4％;晚期自发转移率79.4％,腹水产生率35.3％,无自发消退;移植瘤保持甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原(DCP)高分泌及γ-氨基酰转氨酶(γ～GT)同工酶阳性的特点;模型平均自然生存期28d.结论:小鼠肝癌原位模型成功率高,易于制作,生物学特征符合模拟人类肝癌在体内发生发展的全过程,可成为今后人类研究肝癌的重要动物模型.【期刊名称】《黑龙江医药科学》【年(卷),期】2015(038)006【总页数】2页(P48-49)【关键词】肝癌;H22细胞;原位移植模型;小鼠【作者】项亮亮;侯杰;王婕;焦成斌【作者单位】佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003【正文语种】中文【中图分类】R735.7肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，因其发病率高、恶性程度高、死亡率高，素有“癌中之王”的称号[1]。
目前已有大量研究为肝癌临床的治疗提供基础依据，而肝癌动物模型一直是肝癌临床与基础研究工作的重要工具。
目前有关人肿瘤转移模型大多是用裸大鼠、裸小鼠,动物肿瘤则多数是用Wistar或SD大鼠建立的,而用小鼠建立原位肿瘤移植模型国内外报道较少。
小鼠作为一种更经济，易饲养，易获得的实验研究载体，在发挥其普遍应用性方面有着重大的作用。
小鼠肝癌原位移植模型作为一种新型的动物模型是否能更好地模拟人肝癌在体内发生、发展、侵袭及转移的过程，本实验将研究报道如下。
人肝癌裸鼠皮下-肝原位移植瘤模型的建立实验具体步骤及方法
人肝癌裸鼠皮下-肝原位移植瘤模型的建立实验具体步骤及方法先用组织学完整的新鲜人肝癌组织接种于裸鼠皮下，形成皮下移植瘤，然后用此移植瘤组织再接种于裸鼠肝内，建立肝原位移植瘤模型（间接肝原位移植瘤模型），并将其与直接肝原位移植瘤模型、皮下移植瘤模型和腹腔内移植瘤模型作比较。
一、间接肝原位移植瘤模型的制备1. 用新鲜的肝癌外科手术切除标本（来自长海医院，患者为1名47岁男性，病理诊断：肝左叶肝细胞癌，粗梁型，Ⅱ级），在Hanks液中，去除坏死组织和非癌组织后切成1～2 mm3小块。
2. 取2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头植入裸鼠腰背部皮下，待皮下移植瘤长到直径约1 cm时切取肿瘤，在Hanks液中，去除坏死组织后切成1～2 mm3小块，裸鼠用戊巴比妥钠腹腔麻醉后，行左上腹横切口，暴露肝脏。
3. 取上述2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头植入裸鼠肝右叶深部实质内，全层关腹。
二、直接肝原位移植瘤模型的制备1. 同一例新鲜肝癌手术切除标本，处理方法同皮下移植，裸鼠处理同间接肝原位移植，取2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头直接植入裸鼠肝右叶深部实质内。
2. 皮下移植瘤模型和腹腔内移植瘤模型的制备。
三、病理检查和相关指标检测1. 解剖和组织学检查（1）所有裸鼠接种后，分组分笼饲养，自由进食，每天观察1～2次。
（2）当裸鼠处于全身衰竭状态时处死并作大体解剖，对接种瘤和转移瘤分别进行观察、测量，记录肿瘤侵袭和转移情况，重要器官（主要为肝和肺）经10%中性甲醛固定后，常规石蜡制片，光学显微镜检查。
2. 周围血甲胎蛋白(AFP)检测处死前，均采用摘眼球采血的方法获得血液，用生化法检测AFP的分泌量。
3. 瘤细胞DNA含量分析留取部分移植瘤标本采用流式细胞术进行DNA含量分析。
注意事项目前，肝癌的复发和转移仍然是其术后长期存活的主要障碍。
为了研究肿瘤的转移机制，建立接近于人体的肿瘤动物模型显得尤为重要。
H22昆明鼠肝癌原位模型的建立
鼠 中有 ９ ５只造模成功 ， ２ ２只小鼠 出现肝癌右叶转移。结论 ： Ｈ ２ ２昆明 鼠肝癌原住模 型成功率 高， 成本低 ， 值得推 广 ， 是非 常理
想 的研 究 肝 癌 的 实验 动 物 模 型 。
关 键 词 ：Ｈ ２ ２ ； 肝癌 ； 原位模型 ； 动 物 实验
中图分类号 ： Ｒ ７ ３ ５ ． ７ 文献 标 识 码 ： Ａ 文章编 号 ： １ ０ ０ ８— ０ １ ０ ４ （ ２ ０ １ ５ ） ０ １— ０ ０ ７ ８— ０ ２
肝膈 面实 质 内 ， 退 出针 头 ， 轻压针眼， 取 灼 红 的铁 丝
展、 侵袭 及转 移 的过程 ， 具有 极 高 的基 础及 临 床应用 价值 ， 尤其值 得 提 出的是在 本实 验造 模过 程 中 ， 笔者 充 分发 挥 了肿瘤 外科 的优 势 ， 采 用无 瘤操 作原 则 ， 有 效 的避 免肿 瘤 细胞 逃 逸及 种植 ， 与 以往 的各 种 造模
方法 比较 ， 有效 的避 免 了肿 瘤 细 道 ， 以 防止 肿 瘤 细胞 逃 逸 ， 发 生 腹 腔种 植 ， 将肝 左 叶轻 轻 送 回腹 腔 ， 查 无 活 动 性 出血 ， 取 １号丝 线 分 别 缝 合 腹 白线 及 皮 肤 ， 再 次消毒 ， 术 毕。
・
７ ８・
黑龙江医药科学 ２ ０ １ ５年 ２月第 ３ ８卷第 １期
Ｈ ２ ２昆 明 鼠肝 癌 原位 模 型 的建 立①
侯 杰， 罗 兰， 焦成 斌 ， 杨彦 民 ， 何其 勇 ， 张 晓丽 ， 刘伟 新
（ 佳 木斯 大学附属 第一 医院普外二科 ， 黑龙江 佳 木斯 １ ５ ４ ０ ０ ３ ）
白色 ， 质硬 ， 造模 成功 ， 成瘤率为 ９ ５ ％ 。病 理 学 观察
H22瘤块移植入肝
Ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｒｏＯＵｇｅ ｈｅｐａｔｏｎｍ ｃｅｌｌｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｔｓ ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｍａｙ
ｗｏｒｋ ｖｉａ ｕｐ－ｒｅｇｎｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｐＳ３ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｂｃｌ－２ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒＧＣＣＡＧＧＡＧＡ从Ｔｃ从Ａ．ＣＡＧＡ－３’，扩增
片段长度为２５４ ｂｐ。 二、方法
万方数据
１．建立荷瘤鼠模型：Ｈ砣肝癌细胞株在３７℃、 ５％ＣＯ：条件下培养于含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ １６４０培养液中，２ ｄ传代１次。取第４代对数生长 期细胞配制成１．０×１０８／Ｌ的单细胞悬液，无菌条件 下于小鼠腋下区皮下注射０．２ ｍｌ。待移植瘤生长至 大小约１ ｃｍ时，取出肿瘤，放入少量生理盐水中，切 成１—２ ｍｍ３小块备用。将小鼠用１０％水合氯醛 ０．１５ ｍｌ腹腔注射麻醉，沿胸骨下缘０．５ ｃｍ处作３ ｃｍ 横切口，剪开皮肤分离至腹腔，挤出肝脏，显露肝左 右叶，在肝左叶切一长３ ｍｉｌｌ切口，用止血棉轻压， 将瘤块植入，用康派特医用胶粘住切口，关腹。接种 １０ ｄ后解剖小鼠，肝脏表面可见直径约０．２ ｃｎｌ的肿 物，病理切片证实为恶性肿瘤，此时造模成功。
材料与方法
一、材料 １．细胞株：Ｈ毖肝癌细胞株购于中国海洋大学 药理研究所。 ２．实验动物：昆明种小鼠６０只，雌性，鼠龄 ４周，体重２９—３０ ｇ，由中国海洋大学药物检验所提 供（ＳＣＸＫ鲁２００５４３０１０）。 ３．药物：海洋候选药物ｔａｇａｌｓｉｎ（批号：ＧＳＭ－０１） 由北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室提 供，用食用油稀释成０．２、１．０、５．０ ｇ／Ｌ备用。阳性 对照药物卡莫氟片（批号；９０９０ｌｌＬＨ）由齐鲁制药有 限公司提供，用食用油配成３０ ｇ／Ｌ。康派特医用胶 （批号：０９０３０７）由北京瞬康医用胶有限公司提供。 ４．试剂：ＲＰＭＩ １６４０培养基为Ｇｉｂｃｏ公司产品， 胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司，胰酶 购自赛维商贸有限公司，兔抗鼠ｐ５３和Ｂｃｌ－２一抗、 ＳＡＢＣ免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司，Ｔｒｉｚｏｌ 试剂、引物为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品，ＲＴ．ＰＣＲ的逆转录 试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，ＰＣＲ试 剂盒、核酸染料、分子量标记物均购自青岛东盛生物 技术有限公司。Ｂ—ａｃｔｉｎ的上游引物为５’一ＴＧＣＴ— ＧＴＣＣｃＴＧＴＡＴＧｃＣＴＣＴ－３’，下游引物为５’一Ｇ姐ＧＴ－ ＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＩＴＣＣ－３’，扩增片段长度为２２１ ｂｐ。 ｐ５３的上游引物为５’一ＡＧＧＡＣＣＣ－ＴＧＴＣＡＣＣＧＡＧＡ－ ３’，下游引物为５ ７一ＧＴＧＧＡＡＧＣＣ－ＡＴＡＧ，Ｉ－Ｉ＇ＧＣＣ－３’， 扩增片段长度为１２５ ｂｐ。Ｂｃｌ－２上游引物为５’－ ＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＴＣｌＴＣＡＧＧＧ－３’，下游引物为
两种方法建立小鼠原位肝癌模型的比较
两种方法建立小鼠原位肝癌模型的比较摘要】目的比较建立小鼠原位肝癌模型的两种方法的优劣。
方法分别采用肝脏原位注射细胞法和尾静脉高压水流动力学注射法建立小鼠原位肝癌模型，对两组小鼠肝脏的成瘤情况进行比较。
结果两组小鼠均能在短期内成瘤，且成瘤率高。
结论尾静脉高压水流动力学注射法比原位注射细胞法更容易操作，小鼠存活率高，肝脏成瘤更均匀。
【关键词】原位肝癌模型高压水流动力学注射【中图分类号】R73-3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）14-0382-02原发性肝细胞肝癌是我国乃至全球范围内的研究热点，而原位肝癌小鼠模型是进行原发性肝细胞肝癌基础研究和临床研究的重要工具。
目前原位肝癌模型主要采用化学诱导法（DEN），但是该方法建立模型成瘤的时间比较长，大概需要6-8个月，导致研究的周期很长。
本文尝试了两种比较快速地建立小鼠原位肝癌模型的方法--肝脏原位注射细胞法和尾静脉高压水流动力学注射法，并对这两种方法建立的小鼠模型进行了比较。
1 实验材料及方法1.1 实验动物与试剂C57BL/6小鼠7-8周，雄性，20只,购自上海斯莱克实验动物有限公司。
Hepa1-6细胞株购自中科院上海细胞库。
DMEM高糖培养基，胎牛血清，购自上海英潍捷基公司。
水合氯醛、碘伏购自国药集团。
注射器，手术器械、缝合线、针领自苏州大学材料供应中心。
1.2 方法1.2.1 细胞悬液制备 Hepa 1-6在37℃、5 % CO2 的细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞,0.25%胰蛋白酶消化后,收集于15mL离心管中，用PBS调整细胞悬液浓度至5×107/mL用于原位注射细胞法,每只小鼠注射20uL。
用PBS调整细胞悬液浓度至5×105/mL 用于尾静脉高压水流动力学注射法每只小鼠注射2mL。
1.2.2 小鼠分组 20只7-8周龄的C57BL/6雄性小鼠分为2组，第1组10只进行肝脏原位注射细胞建立模型，第2组10只采用尾静脉高压水流动力学注射的方法建立模型。
小鼠肝脏移植模型研究及其临床应用
小鼠肝脏移植模型研究及其临床应用肝脏移植是一种重要的治疗肝脏疾病的手段，但由于供体缺乏和排斥反应等问题，其临床应用受到了一定的限制。
为了更好地研究肝脏移植模型并探索其临床应用，科学家们运用小鼠作为模型进行了大量研究。
一、小鼠肝脏移植模型的建立小鼠肝脏移植作为一种动物实验模型，是用来研究肝脏疾病治疗和肝功能重建的有效手段。
研究人员运用小鼠同种、异种肝脏移植，成功模拟了肝脏移植术后肝移植组织修复、排异反应等生理过程，为肝脏移植的临床应用提供了重要参考。
在小鼠肝脏移植的模型建立中，需要进行供体与受体小鼠的筛选、肝脏获取和获取后的处理等多个步骤。
在特殊条件下，肝脏移植后的小鼠可以成功存活，而且肝脏移植后的组织修复和新陈代谢状态也得到了良好的恢复。
二、小鼠肝脏移植模型的应用和相关研究小鼠作为肝脏移植模型，极大地拓展了肝脏移植的研究领域。
基于小鼠肝脏移植模型，研究人员开展了关于肝脏移植的多个研究领域，例如肝脏再生、免疫学、肝细胞发育以及治疗肝脏疾病等。
小鼠肝脏移植模型也得到了广泛的应用。
例如，在研究肝脏造血干细胞分化和身份确定等方面，小鼠肝移植模型得到了广泛应用。
此外，小鼠肝脏移植还被用于评估局部和全身免疫反应，并为临床移植中的免疫抑制药物开发提供了基础。
不过，小鼠肝脏移植模型也存在一些不足。
例如，小鼠的生理结构与人类不同，导致肝脏移植效果需要配合其他调控手段才能发挥最大的治疗效果。
三、小鼠肝脏移植模型在临床应用中的前景小鼠肝脏移植模型研究的热潮给人们带来了极大的期待，希望能有效地促进肝脏移植的临床应用。
目前，小鼠肝脏移植模型已被广泛地应用于肝脏移植相关的新药研究、肝脏再生等领域。
未来，随着相关研究的深入推进，小鼠肝脏移植模型有望实现与临床应用更好的衔接，推动肝脏移植技术的发展。
综上所述，小鼠肝脏移植模型的建立和研究具有重要意义，为肝脏移植的临床应用提供了理论基础和参考。
虽然小鼠肝脏移植模型研究存在一些不足，但随着相关研究的深入探索，相信小鼠肝脏移植模型的临床应用前景会更加广阔。
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（ 收稿 ２ ０ １ ３ — ０ ５ — １ ０ ； 修回 ２ ０ １ ３ ０ ６ — ２ ５ ）
扶 正 抗 癌 方 对 Ｈ 移 植 瘤 小 鼠 凋 亡 和 端 粒 酶 表 达 影 响 的 实 验 研 究
方 瑜 杨 柳 青△ 王松 林 ▲ 陈光伟 ◆ 陕西 中医 学院（ 成阳 ７ １ ２ Ｏ ４ ６ ） 摘 要 目的 ： 通 过扶 正抗 癌 方对 Ｈ。 腹 水 型瘤株 移植 瘤 小 鼠模 型 ＴＧ Ｆ — ａ 和 端粒 酶水 平 的影响 ， 观察
原发性肝 癌（ ｐ ｒ ｉ ｍａ ｒ ｙ ｈ ｅ ｐ ａ ｔ ｉ ｃ ｃ ａ ｒ ｃ ｉ ｎ ｏ ｍａ ， ＰＨＣ ） 是 临床 上 最 ０ ． ２ ｍＩ ） ； 二抗 ： 羊抗兔多克隆抗体 ； Ｄ Ａ Ｂ显 色 剂 （ Ｃ 一 ０ ０ ０ ３ ） ； 以 上
常 见 的且 恶 性 程 度 最 高 的 肿 瘤 之 一 ， 全球 发病 率 、 死 亡 率 逐 年
陕西中医 ２ ０ １ ３年第 ３ ４卷第 １ ０期
（ ９ ）பைடு நூலகம் １ ２ ４ ０ ．
１ ４ ２ ３
抑制肝癌细胞 Ｓ ＭＭＣ 一 ７ ７ ２ １ 血 管 内皮 生 长 因 子 表 达 ［ Ｊ ］ ． 中 国
中 医基 础 医学 杂 志 ， ２ ０ ０ ４ ， １ ０（ ５ ） ： ５ ２ ．
性 肿 瘤 中死 亡 率 仅 次 于 肺 癌 列 第 二 位 ｌ ２ ｊ 。是 严 重 威 胁 我 国 人 民 健 康 和 生 命 的疾 病 。本 实 验 欲 通 过 建 立 Ｈ２ ２腹 水 型 瘤 株 移 植 瘤 小 鼠模 型 ， 观 察 ＴＧ Ｆ — ａ和 端 粒 酶 的 表 达 ， 来 研 究 扶 正 抗 癌 方抗肝癌细胞 生长的可能机制 ， 为临床应用提供实验依据 。
抗癌方治疗H22移植性肝癌小鼠的实验研究
ｌ４ ８
肿瘤药学 Байду номын сангаас １ 年 ６月第 ２ ０２ 卷第 ３ 期
Ａ ｔ ｔｍ ｒ ｈ ｒ ａｙＪｎ ０２￣ １ ， ｏ３ ｎ —ｎ ｏ ａｍ ｃ，ｕｅ １，＇ ． Ｎ ． ｉ Ｐ ２ ｖ ２ ｏ
● 涮陶
抗 癌 方 ７ Ｈ２ 移 植 性 肝癌 小 鼠 的 实验研 究 ，— 口 厶 ２ Ｊ
移植性 肝癌动物模型 ， 分别设 立正常 对照组 、 荷瘤模型组 、 化疗药物组及 抗癌方治疗组 ， 治疗 ｔ ５天后观察各组 小鼠的瘤重并计算抑瘤率 ， 通过 酶联免疫吸 附法测定小鼠血清中 Ｔ 一 ＮＦ 的含量 结果 抑 瘤率达 ５ ． ７ ６％， 明显高于荷 瘤模 型组（ ＜）） ， Ｐ （（ ） 与化疗药物 组抑 瘤率的差异无统计 学意 义； ．１ 抗癌方 治疗组 小 鼠血清 Ｔ ～ ＮＦ 水平明显低 于荷 瘤模型组 （ ＜ ． ）与化疗药物组的差异 无统计 学意义。结论 Ｊ ００ ， Ｐ １ 对小鼠移植 性肝癌具有 明确的治疗效应 ， 并可抑制荷 瘤小鼠血 清 Ｔ 一 ＮＦ 的浓度。
小鼠H22肝癌肺转移模型的建立及其意义
小鼠H22肝癌肺转移模型的建立及其意义赵方;胡明道;陈鹏【摘要】目的:建立小鼠H22肝癌肺转移模型,为后续研究肝癌的侵袭转移机制奠定实验基础.方法:复苏H22肝癌细胞,在培养皿中进行传代培养并计数,当细胞达到预定数目时,收集处于对数期细胞,用生理盐水洗涤2次,调整细胞浓度为1.0×107/ml,取0.5 ml细胞悬液在无菌环境下注射到小鼠腹腔进行体内传代培养,收集小鼠腹水瘤细胞,用生理盐水洗涤2次,细胞浓度调至2×107/ml,取50μl细胞悬液通过小鼠尾静脉注射到小鼠体内,14 d后人道主义处死小鼠,解剖取出小鼠全肺组织,病理组织学方法鉴定肿瘤组织,全肺连续切片,显微镜下计数肿瘤转移灶数目.结果:全部小鼠肺组织均肿瘤转移灶形成,肉眼可见成肺组织表面微小转移灶,病理鉴定为肝癌肺转移灶,小鼠肺部肿瘤转移灶数平均为23个.结论:成功建立了小鼠H22肝癌肺转移模型,为研究肝癌转移机制提供了理想的动物模型.【期刊名称】《医学理论与实践》【年(卷),期】2017(030)016【总页数】3页(P2346-2348)【关键词】小鼠;H22;细胞;肝癌;肺转移【作者】赵方;胡明道;陈鹏【作者单位】昆明医科大学第二附属医院肝胆胰外科一病区,云南省昆明市650000;昆明医科大学第二附属医院肝胆胰外科一病区,云南省昆明市 650000;昆明医科大学第二附属医院肝胆胰外科一病区,云南省昆明市 650000【正文语种】中文【中图分类】R-33肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是临床上常见的消化细胞恶性肿瘤，每年新发肝癌病例和死亡病例中有50%以上发生在中国[1]。
2017年美国癌症协会发表癌症统计[2]，统计显示，过去25年之间美国总的癌症死亡率降了25%，但是肝癌的死亡率却仍在上升。
目前，手术治疗是当前治疗肝癌的主要方法，但预期效果不佳，后期仍有较大的转移复发率。
不同方法建立小鼠肝癌原位移植瘤模型差异性的探讨
不同方法建立小鼠肝癌原位移植瘤模型差异性的探讨潘蕊;喻锟;张海亮;郑永仁;赵笑雨;唐钧泽;吴健铭;程欣【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2024(32)3【摘要】目的比较肿瘤细胞注射和肿瘤组织块移植方法建立小鼠肝癌原位模型的差异,为小鼠肝癌原位模型的建立提供技术参考。
方法取健康雄性KM小鼠,随机分为4组:A组注射小鼠肝癌H22细胞;B组注射腹水型肝癌H22细胞;C组采用小鼠肝癌组织块移植法;D组肝部注射生理盐水作为假手术组。
定期观察各组小鼠活动情况、体重变化。
记录4组小鼠的生存时间。
观察各组小鼠肝部成瘤状况、肿瘤程度、与腹腔脏器粘连程度和转移情况,并进行B超成像,检测血清中甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)、异常凝血酶原(des-gamma-carboxyprothrombin, DCP)的浓度及苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织病理学变化。
结果 A组、B组、C 组小鼠造模操作时间分别为(3.36±0.44)min、(3.30±0.41)min、(5.68±0.65)min。
建模第25天,A组、B组、C组小鼠成瘤率均100.0%,A组腹腔重度粘连率为40.0%,B组腹腔重度粘连率为60.0%,C组与D组均未出现重度腹腔粘连。
A组、B组、C组小鼠腹水出现率分别为40.0%、100.0%、0.0%;腹壁瘤出现率分别为30.0%、60.0%、0.0%。
B组小鼠还存在肝转移情况(40.0%)。
B超成像、血清AFP和DCP水平检测、组织病理学检查结果显示,与D组小鼠相比,A组、B组、C 组小鼠肝边缘均不光滑,回声欠均匀,可见稍低回声包块;保持AFP、DCP高分泌;存在大量炎症细胞与肿瘤细胞。
结论在第25天时,3种方法均可以建立肝癌原位移植模型,其中,相较于肝癌组织块移植,肿瘤细胞注射具有操作简单、肝内存在多个转移结节的特点。
而肝癌组织块移植相较于肿瘤细胞注射,则具有对腹腔等脏器影响较小等特点。
如何进行小鼠肿瘤模型的建立及鉴定教程文件
如何进⾏⼩⿏肿瘤模型的建⽴及鉴定教程⽂件如何进⾏⼩⿏肿瘤模型的建⽴及鉴定实验肿瘤学的需要导致肿瘤动物模型的产⽣,借以研究⼈类肿瘤的病因、发⽣、发展以及治疗和预防。
肿瘤动物模型可来⾃于动物的⾃发肿瘤、诱发肿瘤和移植性肿瘤。
⼀前两者由于对动物品系要求严格、实验周期较长或缺少实验⼀致性⽽较少使⽤。
移植性肿瘤动物模型具有特性明确、⽣长⼀致性好、实验周期短、瘤株分布⼴泛、可反复复制等优点,在肿瘤研究中占有重要地位。
可移植性肿瘤,是把动物或⼈的肿瘤移植到同系、同种或异种动物,经传代后,组织类型和⽣长特性已趋稳定,并能在受体动物中继续传代,⼜称为可移植性肿瘤细胞。
⼆可移植性肿瘤移植于同系或同种动物,称为同种移植,是国内外最常⽤的肿瘤动物模型复制⽅法之⼀。
同种移植的优点是,可供选择使⽤的细胞系或细胞株多,许多细胞系在世界范围分布⼴泛,并且这些细胞的⽣物学特性已经⽐较明确,⼀般都有明确的背景资料,使⼀群动物同时接种同样量的瘤细胞,⽣长速度⼀致、个体差异较⼩,成活率⾼,易于对照观察,这些都是便于科研成果相互⽐较和交流的有利因素三在接种过程中，应把握注射深度，否则易造成内脏损伤。
接种后三天即开始观察有⽆肿瘤形成。
本实验具有周期短、制作⽅便、成功率⽐较⾼、较好重复性和稳定性的明显优势，是⼀种较为理想的肿瘤实验动物模型，值得推⼴。
肝癌肿瘤模型建⽴：抗肿瘤药物及制剂的药效学评价，可通过建⽴⼩⿏荷瘤数据模型，探索肿瘤⽣长的本质及其发⽣发展的规律，探究其抗肿瘤效果。
⽅法：⼩⿏右腋下注射H22肿瘤细胞，注射部位发⽣癌变，⼩⿏肿瘤⽣长明显，切⽚结果证明实验成功，模型构建完成，使⼩⿏荷瘤，观察肿瘤⽣长，记录体重数据并建⽴动物模型。
1材料与⽅法1.1实验材料1.1.1动物及分组：取20只昆明⿏随机分成A组（10只），B组（5只），C组对照组（5只），编号饲养。
1.1.2试剂：⽆菌⽔，⽣理盐⽔，台酚蓝，2%冰醋酸，甲醛，⼄醇，⼆甲苯，⽯蜡等。
苏木抗癌有效成分抗移植性肿瘤及生长抑制的观察
苏木抗癌有效成分抗移植性肿瘤及生长抑制的观察
郭文杰;乔丽娟
【期刊名称】《山西职工医学院学报》
【年(卷),期】2004(14)4
【摘要】目的:研究苏木抗癌有效成分(CAE-B)抗移植性肝癌H22,S180肉瘤的作用,并研究其对小鼠的生长抑制作用.方法:建立肝癌H22,S180肉瘤腹水及实体模型,观察荷瘤鼠的生命延长率、抑瘤率、体重指数及脾重指数.结果:H22肝癌小鼠生命延生率为145.5%,抑瘤率为47.7%;S180肉瘤小鼠生命延长率为100.2%,抑瘤率为50.0%,体重增长指数及脾重指数,用药组明显高于阳性对照组(环磷酰胺).结论:CAE-B抗肿瘤作用明显,且不产生生长抑制.
【总页数】2页(P5-6)
【作者】郭文杰;乔丽娟
【作者单位】山西省肿瘤研究所,山西,太原,030013;山西省肿瘤研究所,山西,太原,030013
【正文语种】中文
【中图分类】R730.23
【相关文献】
1.低分子生物抗癌物质结合中药有效成分抗白血病的研究 [J], 丁波;闫晓红
2.苏木抗癌有效成份作用荷瘤小鼠TSGF的观察 [J], 乔丽娟;田艳伟
3.苏木抗癌有效成分对HL-60细胞的增殖抑制 [J], 乔丽娟;徐建国;马克荣
4.苏木抗癌有效成分抗移植性肝癌H22的实验研究 [J], 乔丽娟;徐建国;郭文杰
5.蜈龙抗癌颗粒治疗小鼠移植性肿瘤的药效学观察 [J], 刘亚千;李春海;杨更禄;陈华
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World Journal of Cancer Research 世界肿瘤研究, 2015, 5, 15-20Published Online January 2015 in Hans. /journal/wjcr/10.12677/wjcr.2015.51003Orthotropic Transplantation to EstablishH22 Hepatocellular Carcinoma Model in MiceChen Han1,2, Hengxiao Wang1,2*, Zhaoxia Wang31Department of Immunity, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan2School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan3Department of Pathology, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nanEmail: *wanghengxiao@Received: Nov. 24th, 2014; revised: Dec. 22nd, 2014; accepted: Dec. 30th, 2014Copyright © 2015 by authors and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY)./licenses/by/4.0/AbstractObjective: To establish a liver orthotropic transplantation tumor model with H22 cells, for the further development of the related experimental study. Methods: A certain number of H22 cells were directly injected in the left lobe of the liver in C57BL/6 mice, establishing a transplanted tu-mor model of hepatocellular carcinoma in situ. Results: After 7 days of surgery, the liver surface appeared irregular size nodules, nodules increased with the prolongation of time increases, the late abdominal organs appeared invasion, adhesion, ascites was increased. Histopathological ex-amination of liver tumor tissues and adjacent tissues of cancer showed that liver orthotropic transplantation tumor formation rate was 100%, no spontaneous regression. Conclusions: Ortho-tropic injection of H22 cell established orthotropic transplantation tumor formation in the liver, and the tumor formation time was relatively short, tumor formation processes associated with organ metastasis and ascites. This model was reasonable to simulate the pathological and physio-logical body of liver cancer in human, and could satisfy the requirement of research on liver can-cer.KeywordsHepatocellular Carcinoma, Orthotropic Transplantation, Experimental Animal Models原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞移植瘤小鼠模型韩琛1,2，王恒孝1,2*，王朝霞3*通讯作者。
原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞移植瘤小鼠模型1山东省医学科学院基础医学研究所免疫室，济南2济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南3山东省医学科学院基础医学研究所病理室，济南Email: *wanghengxiao@收稿日期：2014年11月24日；修回日期：2014年12月22日；录用日期：2014年12月30日摘要目的：建立H22肝癌细胞小鼠肝脏原位移植瘤模型，为进一步开展相关实验研究做准备。
方法：直接注射一定数量的H22肝癌细胞于C57BL/6小鼠肝脏左叶，构建肝癌原位移植瘤模型。
结果：术后7天小鼠肝脏表面出现大小不一结节散在分布，随着时间延长结节增多增大，后期腹腔脏器出现浸润、粘连，腹水增多。
肝脏瘤组织及癌旁组织进行组织病理学检查，肝脏原位成瘤率100%，无自发消退。
结论：原位注射H22肝癌细胞株能在肝脏局部形成原位移植瘤，且成瘤时间相对较短，成瘤过程中伴有脏器转移、腹水形成等，较好的模拟了机体原发性肝癌的病理生理学过程，能满足对肝癌相关研究的要求。
关键词肝细胞癌，原位移植，实验动物模型1. 引言建立肿瘤动物模型是研究肿瘤发病机制及开展肿瘤治疗相关研究的重要手段，动物模型应该尽可能的接近人类肿瘤的自然生物学过程，包括肿瘤的发生、发展、浸润和转移[1]。
目前在肝癌研究中多采用异体移植法将肿瘤细胞株注射到动物皮下形成局部瘤块来构建移植瘤模型，相比机体原发性肝癌的形成及病理生理学变化仍有一定不同。
本研究通过将一定数量的H22肝癌细胞直接注射入具有完全免疫能力的C57BL/6小鼠肝脏实质，观察其原位移植瘤成瘤的过程及状态，能较好的模拟人体肝癌生长过程，为进一步抗肝癌免疫研究提供实验动物模型。
2. 材料与方法2.1. 材料2.1.1. 实验动物雄性C57BL/6小鼠3 0只，6~8周龄，体重（20±2）g，购自山东大学实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK(鲁)20090001，饲养于山东省医学科学院基础研究所实验动物房IVC(智能型独立送回风净化笼具)中，动物在室温(22±2)℃、相对湿度50%条件下自由摄取食水，两周后开始试验。
鼠源性H22腹水型肝癌细胞株由本室在液氮中长期保存。
2.1.2. 主要试剂无菌生理盐水，磷酸盐缓冲液(PBS)，水合氯醛，10%中性甲醛。
2.2. 方法2.2.1. 复苏细胞株腹腔接种自液氮罐中取出冻存管，在38℃温水中快速摇动使细胞融化，吸取细胞悬液至无菌生理盐水中混匀，原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞移植瘤小鼠模型1000 rpm/min，离心5分钟，弃去上清，用无菌生理盐水重悬细胞，调节细胞浓度至1 × 107/mL。
碘伏消毒C57BL/6小鼠腹部皮肤，采用1 ml BD注射器抽取0.2 ml细胞悬液腹腔注射小鼠，约一周后形成腹水。
无菌抽取腹水进行传代，采用第3代传代细胞进行肝脏注射。
2.2.2. 小鼠肝癌原位移植瘤模型的建立无菌抽取腹腔接种H22肝癌细胞株的小鼠腹水，加入PBS液混匀，1000 rpm/min，离心5分钟，弃去上清，反复PBS洗涤、离心2次。
无菌生理盐水重悬细胞，显微镜下细胞计数，经台盼蓝染色法检测细胞存活率>95%，调节细胞浓度至1.2 × 107/mL，置于冰上待用。
采用5%水合氯醛(0.6 ml/100 g)小鼠腹腔注射进行麻醉，取仰卧位，固定于实验板上，碘伏消毒皮肤，剑突下沿腹中线纵行切口，逐层剪开皮肤和腹膜，充分暴露肝左叶。
用50 μL微量注射器抽取50 μL H22细胞悬液(含细胞数6 × 106个)，20˚角刺入肝脏实质约0.5cm缓慢注入细胞悬液，停留片刻，注射完毕拔出针头，立即用无菌纱布轻压针孔至肝脏表面不再渗血，逐层关腹。
术后继续饲养，自由进食、进水。
2.3. 观察指标及方法2.3.1. 肿瘤移植的观察分别于术后7天、14天、21天处死7只小鼠，肉眼观察移植瘤的大体形态及与周围器官粘连、腹水形成情况。
2.3.2. 组织病理学检查肝脏肿瘤组织经10%中性甲醛固定，酒精梯度脱水，石蜡包埋，4μm连续切片，HE染色，在光学显微镜下进行病理检查。
2.3.3. 荷瘤小鼠的自然生存期观察9只荷瘤小鼠未进行任何干预处理，观察自然生存期及肿瘤的自发消退率。
2.4. 统计学处理实验数据以均数±标准差表示，利用SPSS17.0统计软件进行数据处理，P < 0.05认为具有显著性差异。
3. 结果3.1. 小鼠原位移植瘤模型建立术后7天、14天、21天处死小鼠，观察均形成肝原位瘤，肝原位成瘤率为100%(30/30)，肿瘤自发消退率为0 (0/30)，无手术相关死亡。
荷瘤小鼠自然生存期为21~28天。
3.2. 组织病理分析术后7天处死7只小鼠，取出肝脏进行观察，肉眼可见7只小鼠肝左叶均出现散在0.5~2.5 mm乳白色点状结节。
术后14天处死7只小鼠，未见肿瘤自发消退，乳白色结节增多，散在分布，且体积明显增大，可见有2只出现少量淡黄色腹水，肿瘤结节部分与腹腔脏器有轻微粘连。
术后21天处死7只小鼠，肿瘤组织呈鱼肉状，连接成片，与正常肝组织分界不清，肝脏质地轻度变硬，与腹腔胃、肠管等脏器粘连严重，4只形成大量腹水，占57.1%，颜色呈乳白色或血色(图1所示)。
原位移植瘤在术后第14天左右进入快速增殖期，至21天后肿瘤体积增长速度明显加快。
光镜下观察，正常肝小叶结构消失，瘤细胞异型性明显，大小不等，形状各异，可见瘤巨细胞，染色质明显增多，细胞核深染，呈现分叶、多核等病理性核分裂，肿瘤细胞排列紧密，呈浸润性生长(图2所示)。