第4章 基因工程常用技术 - 凝胶电泳技术
凝胶电泳在基因操作中的用途
凝胶电泳在基因操作中的用途凝胶电泳是一种常用的分离DNA、RNA和蛋白质的方法，它广泛应用于基因操作中。
本文将从凝胶电泳的原理、分类及其在基因操作中的用途等方面进行阐述。
一、凝胶电泳的原理凝胶电泳的原理是利用凝胶作为分离介质，通过电场作用将目标分子分离出来。
凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯凝胶等。
在凝胶中，通过电泳电场的作用，DNA、RNA和蛋白质等分子会向电极移动，分子的迁移速度与其分子大小、电荷量和凝胶孔径大小有关。
在电泳过程中，DNA、RNA和蛋白质等分子会被分离出来，可以根据其大小、电荷量等特性进行鉴定和分析。
二、凝胶电泳的分类凝胶电泳按照不同的分离介质和分子类型可以分为不同的类型。
常见的凝胶电泳包括：1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常见的DNA分离方法，适用于分离较小的DNA分子。
琼脂糖凝胶可以根据其浓度和孔径大小调整分子分离的范围。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种高分辨率的分离方法，适用于分离较大的DNA和蛋白质分子。
聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小可以通过调整交联剂的浓度和聚合物的比例来控制。
3.聚丙烯凝胶电泳聚丙烯凝胶电泳是一种分离较大分子的方法，适用于DNA和RNA的分离。
聚丙烯凝胶的孔径大小可以通过调整聚合物的浓度和孵育时间来控制。
三、凝胶电泳在基因操作中的用途凝胶电泳在基因操作中具有广泛的用途，主要包括：1.分离DNA和RNA凝胶电泳是一种常用的DNA和RNA分离方法，可以用于提取DNA和RNA等分子。
在分离DNA和RNA的过程中，可以通过调整凝胶孔径大小和电场强度来控制分子的分离范围。
2.检测PCR产物凝胶电泳可以用于检测PCR产物，通过分析PCR产物的大小和数量来判断PCR反应的效果。
在PCR反应中，PCR产物可以通过引物的设计来控制其大小，通过凝胶电泳可以检测PCR产物的大小和数量。
3.分离蛋白质凝胶电泳可以用于分离蛋白质，通过调整凝胶孔径大小和电场强度来控制蛋白质的分离范围。
分子生物学实验技术(核酸的凝胶电泳) ppt课件
1 不能有效的回收大片段DNA
2 不能有效回收少量DNA
ppt课件
Home
27
二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳
polyacrylamide gel electrophoresis PAGE
ppt课件
28
ppt课件
29
（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质
在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原 产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯 基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。
ppt课件
41
3 电场夹角：电场方向的夹角常为1100 - 1200， 研究证实900夹角也非常有效的。
4 温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行， PFGE一般应在4℃ 进行。较高的温度DNA泳 动较快；但是较高的温度也引起较小片段 的泳动截留和明显的条带变宽。
Home
ppt课件
42
7 电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE
ppt课件
14
TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较
都是常用电泳缓冲液。三者相比：
1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝 胶的阳极一侧将发生酸性化；
2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；
3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；
垂直交变电场系统
A-
B-
A+B
+A B-
场翻转系统
-
+B
+A
箝位匀转胶系统
40
（三） 影响分辨率的因素
1 脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较 大分子，减少脉冲时间分离较小分子。 2 电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大 了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度 会导致较小片段泳动的紊乱。
凝胶电泳技术课件
提高灵敏度：通过改进检测 方法、优化实验条件等方法 提高灵敏度，以便更好地检 测低丰度的DNA片段。
降低成本：通过优化实验 方案、改进实验设备等方 法降低成本，以便更好地 推广凝胶电泳技术。
应用领域拓展
生物制药：蛋白质、核酸等 生物大分子的分离和纯化
基因工程：DNA片段的克 隆和测序
食品安全：食品添加剂、微 生物检测
凝胶电泳技术课件
目录
01. 凝胶电泳技术概述 02. 凝胶电泳实验步骤 03. 凝胶电泳结果分析 04. 凝胶电泳技术发展
凝胶电泳原理
凝胶电泳技术是一种利用凝胶介质对不同分子量 的DNA、RNA或蛋白质进行分离和检测的技术。
凝胶电泳的原理是利用电场对不同分子量的DNA、 RNA或蛋白质进行分离和检测。
04
06
确定分子量：根 据迁移率和分子 量之间的关系确 定分子量
确定电泳条件： 根据结果分析 确定合适的电 泳条件
技术改进方向
提高分辨率：通过优化凝胶 配方、改进电泳技术等方法 提高分辨率，以便更好地区 分不同大小的DNA片段。
提高速度：通过优化电泳 技术、改进实验流程等方 法提高速度，以便更快地 完成实验。
凝胶电泳技术主要包括凝胶制备、样品处理、电 泳、染色和检测等步骤。
凝胶电泳技术在分子生物学、生物化学、遗传学、 医学等领域具有广泛的应用。
凝胶电泳类型
聚丙烯酰胺凝胶电 泳（PAGE）：根 据分子量进行分离
毛细管凝胶电泳 （CGE）：根据分 子大小和电荷进行
分离
琼脂糖凝胶电泳 （AGE）：根据分
子大小进行分离
03
电泳方向：观 察电泳方向的 正负，判断样 品的电荷和分 子量
04
电泳时间：观 察电泳时间的 长短，判断样 品的电荷和分 子量
凝胶电泳技术及应用
凝胶电泳技术及应用凝胶电泳技术是一种常用的分离和检测生物大分子的方法，广泛应用于生物学、生物化学、医学等领域。
凝胶电泳技术基于生物大分子在凝胶中的迁移性差异，通过电场作用下的迁移从而实现分离。
凝胶电泳通常分为聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳两种。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种基于聚丙烯酰胺凝胶的电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶是一种由聚合物网络构成的凝胶，其孔径大小可以通过改变凝胶浓度和聚合物交联程度来调节。
聚丙烯酰胺凝胶具有独特的物理性质，如弹性好、溶胶吸水性强、电泳速度适中等。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分为垂直电泳和水平电泳两种形式。
垂直电泳常用于核酸分离，水平电泳则主要用于蛋白质分离。
琼脂糖凝胶电泳是一种基于琼脂糖凝胶的电泳技术。
琼脂糖凝胶是一种质地松软的凝胶，其孔径大小通常通过改变琼脂糖浓度来调节。
琼脂糖凝胶电泳主要用于DNA和RNA的分离和定量分析。
琼脂糖凝胶电泳通常采用水平电泳形式，其中比较常用的有休闲琼脂糖凝胶电泳和碱性琼脂糖凝胶电泳。
凝胶电泳技术的应用非常广泛。
以下是一些典型的应用实例：1. 分离和鉴定DNA：凝胶电泳技术是DNA分子生物学中不可或缺的方法之一。
通过凝胶电泳可以对DNA分子进行分离和纯化，并通过染色剂或探针的反应进行检测和鉴定。
2. 分离和鉴定RNA：凝胶电泳技术也可以用于RNA的分离和鉴定。
通过凝胶电泳可以对RNA分子进行分离和纯化，并通过染色剂或探针的反应进行检测和鉴定。
3. 检测蛋白质：凝胶电泳技术可以用于检测蛋白质分子的大小、电荷等性质，并通过染色剂或抗体的反应对蛋白质进行检测和定量分析。
4. 检测酶活性：凝胶电泳技术可以通过酶标记底物反应，检测酶的活性。
通过凝胶电泳可以对酶反应产物进行分离和定量。
5. DNA指纹图谱的构建：凝胶电泳技术可以用于构建DNA指纹图谱，从而实现个体鉴定、犯罪侦查等方面的应用。
除了以上几个典型的应用外，凝胶电泳技术还可以在DNA测序、基因重组、蛋白质纯化等领域得到广泛应用。
凝胶电泳技术与应用
凝胶电泳技术与应用凝胶电泳是一种分离、纯化和检测生物分子的基础技术，广泛应用于基础生物学研究、临床诊断、药物研发等领域。
它的原理是利用电场通过凝胶，分离不同大小、形状、电荷的生物分子，具有广泛的适用性和较高的分辨率。
本文将从技术原理、类型、应用等方面介绍凝胶电泳的相关知识。
一、技术原理凝胶电泳的技术原理是将电荷带有生物分子通过凝胶进行分离的技术，基于在电场作用下，带电分子沿着电场线移动到电极。
具体分离原理是根据生物分子的大小、形状和电荷，选择不同类型的凝胶，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯凝胶等，通过不同的电场条件，形成不同的分离模式。
带电分子在凝胶中的移动速度与电场强度成正比，与分子大小成反比，通过在凝胶中的移动，使得大分子迁移速度慢，小分子快，从而可以分离不同大小和形状的生物分子。
二、类型1、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是凝胶电泳的早期经典技术，它使用的是具有多孔性结构的琼脂糖凝胶。
琼脂糖凝胶的孔隙大小和形状可人为调整，从而实现不同大小和形状生物分子的分离。
琼脂糖凝胶电泳具有简单、易用、成本低等特点，主要用于分离DNA、RNA等小分子。
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是近年来较常应用的一种凝胶电泳技术，它是通过将聚丙烯酰胺单体聚合成大分子链，形成具有透明度和稳定性的凝胶，进行生物分子的分离的。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点是分辨率高、适用范围广，可以分离多种生物分子，并且可以形成各种形态的凝胶，如板状、柱状、管状等。
3、分子筛凝胶电泳分子筛凝胶电泳是一种基于生物分子大小的分离技术，例如蛋白质、多肽、核酸等，它利用不同的孔隙大小和形状来限制生物分子的通过，从而实现分离纯化的效果。
分子筛凝胶电泳一般使用交替吸附凝胶或低熔点温度凝胶，具有分离效果好、可逆性强、重复性好等特点。
三、应用凝胶电泳是一种广泛应用的分离技术，主要应用于生物学、医学、食品科学、环境监测、法医学等领域。
1、生物学领域凝胶电泳在生物学领域中广泛用于分离和检测DNA、RNA、蛋白质等生物分子，并用于基因测序、PCR检测等分子生物学实验。
凝胶电泳技术
凝胶电泳技术凝胶电泳技术是一种常用的生物分析技术，可用于分离和分析生物分子，如蛋白质和核酸。
本文将介绍凝胶电泳技术的原理、操作步骤以及应用领域。
一、原理凝胶电泳是利用电场对带电粒子在凝胶基质中的迁移进行分离的方法。
凝胶是一种由高分子聚合物构成的网状结构，可以形成孔隙，使带电粒子能够在凝胶中迁移。
根据粒子的大小和电荷，它们会在凝胶中以不同的速率迁移，从而实现分离。
二、操作步骤1. 准备样品：将待分离的生物分子样品进行预处理，如蛋白质样品可以进行蛋白质提取和纯化，核酸样品可以进行DNA或RNA提取和纯化。
2. 制备凝胶：按照需求选择合适的凝胶类型，如聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）用于蛋白质分离，琼脂糖凝胶（agarose gel）用于DNA 或RNA分离。
根据实验目的和分离需求，调配合适的凝胶浓度和缓冲液。
3. 加载样品：将样品与电泳缓冲液混合，加入到凝胶孔中，通常会加入一种染料以便观察分离结果。
4. 电泳分离：将凝胶槽中的凝胶浸泡在电泳缓冲液中，连接电源进行电泳。
根据需要，可以选择不同的电场强度和电泳时间。
5. 可视化结果：电泳结束后，可以使用染色剂染色或使用特定的探针进行标记，然后使用紫外线照射或其他适当的成像技术观察和记录分离结果。
三、应用领域凝胶电泳技术在生物学研究和临床诊断中有着广泛的应用。
1. 蛋白质分析：凝胶电泳可以用于分离和定量蛋白质样品，如SDS-PAGE用于分析蛋白质的分子量，2D-PAGE用于分析蛋白质的表达谱。
2. 核酸分析：凝胶电泳可以用于分离和检测DNA和RNA样品，如琼脂糖凝胶电泳用于DNA片段的分离和检测，聚丙烯酰胺凝胶电泳用于RNA的分离和检测。
3. 突变检测：凝胶电泳可以用于检测基因突变，如单链构象多态性（SSCP）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）等技术。
4. 体外诊断：凝胶电泳可以用于检测某些疾病的标志物，如血红蛋白电泳用于检测血红蛋白病和地中海贫血等。
总结：凝胶电泳技术是一种重要的生物分析技术，广泛应用于生物学研究和临床诊断。
凝胶电泳的技术原理及应用
凝胶电泳的技术原理及应用1. 凝胶电泳的技术原理凝胶电泳是一种常见的生物分子分离方法，它利用了生物大分子在电场下的电荷和空间构型的特性来实现分离。
其主要原理是将待分离的生物大分子（如DNA、RNA和蛋白质等）置于凝胶状物质（如聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶）中，然后利用电场将这些分子定向迁移直至分离。
具体原理如下： 1. 凝胶状物质：凝胶电泳中常用的凝胶状物质有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
它们的基本原理是在电场下形成一种类似筛子的网状结构，通过排斥作用将生物大分子分离开来。
2. 电场作用：当电场施加到凝胶中时，生物大分子会带上电荷，并在电场力的作用下向阳极（正极）或阴极（负极）迁移。
这样，不同大小、电荷和形状的生物大分子会以不同的速率在凝胶状物质中迁移，从而实现分离。
3. 分离效应：由于凝胶状物质的筛子效应，较大的生物大分子会受到更大的阻力，迁移速度较慢，而较小的生物大分子则会受到较小的阻力，迁移速度较快。
因此，经过一段时间的电泳迁移后，生物大分子会按照大小从上到下在凝胶上形成一个分离带。
2. 凝胶电泳的应用凝胶电泳作为一种高效、准确、经济的分子分离方法，广泛应用于生物学和医学领域。
以下是凝胶电泳的一些典型应用：•DNA分析：凝胶电泳是DNA分析的重要工具。
通过将DNA样品在凝胶中进行电泳分离，可以快速、准确地鉴定DNA的大小和形态。
常见的DNA分析应用包括基因突变检测、DNA指纹图谱分析和基因测序等。
•RNA分析：凝胶电泳也广泛应用于RNA的分析。
通过将RNA样品在凝胶中进行电泳分离，可以检测RNA的大小和纯度。
常见的RNA分析应用包括转录组分析、RNA干扰和核酸杂交等。
•蛋白质分析：凝胶电泳在蛋白质分析中也有重要应用。
通过将蛋白质样品在凝胶中进行电泳分离，可以确定蛋白质的分子量和纯度。
常见的蛋白质分析应用包括蛋白质电泳免疫印迹、蛋白质丰度分析和蛋白质相互作用分析等。
•核酸杂交：凝胶电泳在核酸杂交中也发挥着重要的作用。
基因工程的主要技术与原理
（一）、探针的标记物
非放射性探针的标记 ▪ 生物素标记核酸 （光敏生物素、酶促生物素） ▪ DNA半抗原标记 ▪ 荧光素标记
基本原理：
生物素标记法
以生物素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio-7-dATP、 Bio-11-dCTP）等代替相应脱氧核苷三磷酸，经DNA聚合酶作用掺 入新合成的DNA。可以采用缺口平移法和随机引物延伸法进行。
制备高比活性探针(1010 cpm/μgDNA);
（3）末端标记法 T4 DNA聚合酶
5’→3’聚合酶活性，1500 nt/min, 为pol I的两倍 3’→5’外切酶活性，可作用于ssDNA和dsDNA, 其切除速度 分别为40和 4000nt/min
补平或标记DNA分子由核酸内切酶产生的3'凹端 对带有3'黏性末端或平末端的DNA片段进行标记，制备探针
基本原理 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针” 是抗体，“显色”用标记的二抗
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如NC膜）上， 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多 肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作 为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第 二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的 特异性目的基因表达的蛋白成分。
随机引物：含有各种 可能排列顺序的寡核 苷酸片段的混合物。 46 = 4096
DNA聚合酶ⅠKlenow片段
5’→3’DNA聚合酶活性 弱3’→5’外切核酸酶活 性 无5’→3’外切核酸酶活 性
➢ 产物平均长度为400-600个核苷酸。 ➢ Klenow片段没有5 ’→3’外切酶活性, 反应稳定, 可以获得大量的有效探针。 ➢ 反应时对模板的要求不严格, 用微量制备的质粒DNA 模板也可进行反应。
基因工程常规技术-凝胶电泳
考马斯亮蓝G250主要用于蛋白质含量测定
39
40
2.银染色法
银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有 100
多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大
致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银
，沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度
很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点。
41
42
Ethidium bromide （EB）
33
EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与
琼脂糖结合。 EB在紫外光照射下能发出红色荧
光，EB-DNA复合物的荧光产率比没有结合 DNA的染料高出20-30倍，因此可显示DNA泳 带在凝胶中所处的位置。 荧光强度与DNA含量 成正比。
34
在EB存在的情况下，线 状DNA的电泳迁移率约 降低15%。当需要知道核
3
Increasing degree of supercoiling
Relaxed 相同分子量的DNA:
supercoiled
闭合环状卷曲超螺旋迁移最快， 线性分子次之， 伸展开环状最慢。
4
的pH值 溶液的离子强度 温度的影响 支持物的影响
5
电场强度
单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对泳 动速度起着十分重要的作用。
电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。
6
溶液的pH值
决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电 荷的多少。
溶液的离子强度
电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降低 原因：带电离子吸引相反电荷的离子聚集在其周围， 相成一个与运动粒子电荷相反的离子氛（ionic atmosphere），它使该离子向相反的方向运动，从而 降低了该粒子的迁移率。
04_基因工程的主要技术及其原理
第一节 DNA和RNA的提取和纯化
DNA酶抑制剂 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用 金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙
二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；
阴离子型表面活性剂： 如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋 白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复 合物在高盐溶液中沉淀。
第四章基因工程的主要技术及其原理第一节dna和rna的提取和纯化第二节凝胶电泳第三节聚合酶链式反应技术第四节核酸和蛋白质的分子杂交第五节dna序列分析第六节基因定点诱变第七节dna与蛋白质互作分析第一节dna和rna的提取和纯化核酸是遗传信息的载体是最重要的生物信息分子是分子生物学研究的主要对象因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要最基本的操第一节dna和rna的提取和纯化核酸提取与纯化的原则保持核酸分子一级结构的完整性温度不要过高控制一定的ph值范围ph值59保持一定的离子强度减少物理因素对核酸降解的机械剪切力防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键破坏核酸一级结构
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使
酚容易去除
一、DNA提取的基本原理与方法
CTAB提取缓冲液的改进配方
Tris-HCl （pH8.0） 100 mM EDTA NaCl （pH8.0） 20 mM
组份
终浓度
CTAB
PVP40
β-巯基乙醇
第四章基因操作的技术原理(电泳)
1 琼脂糖凝胶电泳的参数：
（1） 缓冲液 （2）凝胶的浓度 （3） 加DNA样品：<1μg，载样缓冲液(溴酚蓝，甘油） （4） 电泳条件 （5）染色和观察
（1） 缓冲液：
常用的几种电泳缓冲液有： TAE[Tris-乙酸和EDTA (pH8.0)] TBE(Tris-硼酸和EDTA) TPE(Tris-磷酸和EDTA) 一般配制成浓缩母液（10X或5X）,储于室温。
（4） 电泳条件
在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压 成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的 DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大, 因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压 增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。
大片断低电压长时间 小片段高电压短时间
（5） 染色和观察：
PFGE can resolve large DNA fragments
6. 混合DNA样品和0.2倍体积6×指示剂。 7. 用微量移液器将样品混合液缓慢加至浸没凝胶的加样孔内。分子质 量标准应分别加至样品孔的左侧和右侧的两个孔内。 8. 关上电泳槽盖，接好电极插头。给予合适的电压。 9. 当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔出电 极插头和打开电泳槽盖. 10. 转移凝胶至凝胶成像系统内观察。
溴化乙锭（ethidium bromide,EB）染色，
溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到 堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使 其刚性更强。
1 常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB）， 染色效果好， 操作方便，但是稳定性差， 具有毒性，致癌作用。 2 SYBR Green ， GelRed 毒性小，但价格贵。 3 GeneGreen 相比则是性价比高的低毒 替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10 倍以上。
分子生物学常用技术凝胶电泳幻灯片
方
于EB分子的插入，在紫外光的照射下，
向
凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧
光，易于检测。可以检测10ng 的DNA
注意：EB是一种诱变剂，操作时一定 要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套
德厚行远，因尔成道
环形双链的质粒DNA分子具有三 种不同的构型
1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的 环形结构时，称之为共价闭合环形DNA （cccDNA），这样的DNA通常呈现超 螺旋的SC构型；
①淀粉液 ②聚丙烯酰胺凝胶 ③琼脂糖凝胶
德厚行远，因尔成道
不用支持体的电泳技术：
1、Tiselius电泳 2、显微电泳 3、等电点聚焦电泳技术 4、等速电泳技术 5、密度梯度电泳
德厚行远，因尔成道
DNA电泳
德厚行远，因尔成道
DNA分子带负电，向正电方向游泳
德厚行远，因尔成道
（一）琼脂糖凝胶电泳
2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持 着完整的环形结构，另一条链出现有一 至数个缺口时，称之为开环DNA （ocDNA），此即OC构型；
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制 酶切割之后，发生双链断裂形成线性分 子（IDNA），通称L构型。
德厚行远，因尔成道
琼脂糖凝胶中DNA的观察
溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下 红色荧光
德厚行远，因尔成道
琼脂糖Agarose
琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂糖束→大网孔型
D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactopyranose. Melting at 85 ℃ and solidifying from 32-40 ℃
德厚行远，因尔成道
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
分子生物学常用技 术凝胶电泳幻灯片
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2.00 2.00 2.00 2.00 11.8 10.20 8.54 5.20
7
混匀后，置真空干燥器中，抽气10min
2.00 4.60
2.分离胶的制备 胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水加速聚 合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。
3.浓缩胶的制备 用滤纸吸干水→倒入 浓缩胶→插入梳子→静置，聚合。
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力
凝胶类型及浓度 0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4%聚丙烯酰胺 10%聚丙烯酰胺 20%聚丙烯酰胺
分离DNA片段的大小范围 50000~1000 20000~1000 6000~300 1000 ~100 500 ~25 50 ~1
二、琼脂糖凝胶电泳
10% SDS
配制20ml不同浓度分离胶 所需各种试剂用量/ml
5% 7.5% 10%
15%
配制10ml浓缩胶 所需剂用量
3%
3.33 5.00 6.66 10.00
-
2.50 2.50 2.50 2.50
-
-
-
-
-
3.0
-
-
-
-
1.25
0.20 0.20 0.20 0.20
0.10
1%TEMED 重蒸馏水
蛋白质的相对分 子量的范围 ＜104
1×104～4×104
4×104～1×105
1×105～5×105
＞5×105
分离胶的 浓度
20%～30% 15%～20%
10%～15%
5%～10%
2%～5%
试剂名称
分离胶贮液 （30%Acr-0.8%Bis) 分离胶缓冲液 （pH8.8Tris-HCl） 浓缩胶贮液 （10%Acr-0.5%Bis） 浓缩胶缓冲液 （pH6.8Tris-HCl）
电泳仪
电泳槽
琼脂糖凝胶电泳装置
• 操作流程大致为： 凝胶的制备→胶板的制备→加样→电泳 →观察和拍照。
操作步骤
•琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB •凝胶板的制备：加梳子，倒胶 •样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 •加样：加样端为负极（黑） •电泳：5V/cm •观察：紫外灯下观察，照相
称量、加入缓冲液
第四章 分子基本操作技术
第二节 凝胶电泳技术
一、电泳的原理
将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速 度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度 叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携 带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分 子大小、极性、介质的粘度系数等）。
在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的， 所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态 （Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会 由负极→正极移动。
混合样品
大分子
电泳方向
电泳 带孔胶
小分子
按分子
不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图 大小分离
流程图
聚丙烯酰胺凝胶中常用的引发剂过硫酸铵和核黄素在碱性 条件下可产生自由基，而增速剂N，N，N′，N′-四甲基 乙二铵（TEMED）可催化由过硫酸铵产生的自由基的形成， 从而加速聚合。
聚丙烯酰胺凝胶制胶装置
实验步骤
一、制胶
1.配胶
配胶应根据所测蛋
白质相对分子质量范 围选择适宜的分离胶 浓度。由于SDS-PAGE 有连续体系和不连续 体系两种，两者各有 不同缓冲体系，因而 有不同的配制方法。（以 不连续体系为例）
常用固体支持介质
琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyarylamide）都属于固体支持介 质，使用支持介质的目的是防止电泳过程中的对流和扩散，使得被分 离的成分得到最大的分辨率。这些固体支持介质可以形成复杂的网孔 结构，DNA要穿过这些网孔才能到达正极，因此分子量小，结构致密 的DNA分子就更容易穿过这些网孔，泳动的速度也越快。
二、样品处理与加样
1.样品处理
样品 样品溶溶解液解 沸水浴 冷却
2.加样
小心拔出梳子 上下槽 注入电极缓冲液 用 微量进样器点样
加样
样品 迁移 方向
三、电泳
接上电泳仪，上槽为负极，下槽为正极。打开开 关，保持恒压进行电泳。
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分 子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
溶胶
准备胶槽
凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
铺胶
凝胶凝固后取出梳子
加缓冲液
准备样品
点样
电泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
紫外灯下观察电泳结果
照相
三、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺主要由丙烯酰胺和N，N′-甲叉双丙烯酰胺聚合 而成，这两种成分在有引发剂和增速剂存在的情况下，丙烯 酰胺的单体形成长链，由N，N′-甲叉双丙烯酰胺的双功能 基团和链末端的自由功能基团反应而发生交联。
琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，它的分 子结构大部分是由1,3联接的β-吡喃半乳糖，1，4联接的 3，6脱水α-D吡喃半乳糖交替而成的，其结构为：
染色：
在凝胶电泳中，一 般加入溴化乙锭 （EB）--ethidium bromide染色，此 时，核酸分子在紫 外光下发出荧光， 肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。
丙烯酰胺为白色结晶粉末，无味，分子量为71.08，为中枢 神经毒物。N，N’-甲叉双丙烯酰胺也为白色结晶粉末，无 味，分子量为154.17，亦为中枢神经毒物。1%的稀溶液与 皮肤接触也会引起皮肤发炎，小鼠的确切致死量（LD50） 为170mg/㎏，所以在实验室操作时应尽量避免与之直接接 触和吸入粉尘。