第五章 工业微生物诱变育种
工业微生物诱变育种诱变剂(ppt)
2、紫外光的剂量
单位:尔格能量/mm2 (灯具发射强度随使用时间延长而下降。) 实际应用-相对剂量：照射时间、杀菌率来表示 杀菌率：90.0%-99.9% 时间：芽孢菌10min；
小芽孢杆菌营养缺陷型1-3min； 一般营养体3-5min； 无芽孢菌和革兰氏阳性菌0.5-2min。
3、诱变机理
照射 ❖ 设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室、培养皿等; ❖ 紫外灯：波长为253.7nm,功率是15W; ❖处理时的照射距离：20cm — 30cm; ❖ 样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过
3mm,照射时，要用磁力搅拌器搅拌。 注意：操作和培养时必需避免可见光直射液面， 最好在黄色或红色灯光下操作。
后培养：1.5-2小时；
稀释涂皿
（四）、电离辐射
（五）新型诱变剂
❖ 微波:电磁波 ❖ 红外线：0.75～1000μm ❖ 激光：光量子流 ❖ 高能电子流：强电离辐射 ❖ 航天育种：利用返回式卫星进行农作
物新品种的选育的一种方法。
航椒1号
航茄2号
航 天 葫 芦
6、低能离子注入
过程：能量沉积、动量传递、离子注入和电荷 交换
染色体方面的表现: 断裂，形成染色体断片、环、桥等。 染色体畸变率与辐射剂量成正比 染色体畸变率是评价遗传损伤的指标
DNA方面的表现: DNA断裂、分解，形成单链结构 DNA非按时合成 存在自我损伤修复机制，提前进行DNA合成， 进行DNA损伤修复 生长素类物质促进DNA损伤修复 咖啡因、EDTA等拟制DNA损伤修复
结合的复合诱变效应
二、化学诱变剂
化学诱变剂是一些能和DNA起作用，改变 其结构，并引起遗传变异的化学物质。
碱基类似物 烷化剂 种类 移码突变剂 其他类
微生物诱变育种技术
微生物诱变育种技术介绍了微生物诱变育种的各种方法，对经典的诱变技术、复合诱变和新型的诱变技术等处理方法进行了比较。
对离子注入法和等离子体诱变育种等新型诱变育种技术的机理进行了阐述，并对其优缺点以及潜在的研究方向进行了论述。
标签：微生物诱变；离子注入法；等离子体诱变微生物诱变育种是一种基因突变技术，通过技术手段改变微生物的遗传结构和功能，进而筛选出具有特定性状的，优良突变型微生物。
这种育种方式，具有较高的微生物变异率，变异速度快，效率高等优点，是食品加工和医药生产等工业的首选方法。
常用的微生物诱变育种方法包括物理法、化学法和生物法等，其中物理法诱变包括：紫外诱变、X射线诱变和γ射线诱变等，化学法诱变包括烷基磺酸盐和烷基硫酸盐、亚硝基烷基化合物、次乙胺和环氧乙烷类和芥子气类），生物法包括基因转导、基因转化和转座子诱变等。
复合诱变是指采用两种及以上的诱变方法，对微生物进行诱变，制的目标菌株。
通常仅采用一种方法进行诱变，会使微生物产生抗性，从而降低突变率，复合诱变具有补充不同诱变方法之间缺陷的优势。
近些年涌现出一批创新的诱变技术，如离子注入诱变法、大气压冷等离子诱变，其中离子注入诱变法具有与复合诱变相似的特性，日趋成为研究诱变技术的主流方向。
原生质体是包含细胞膜和膜内细胞质及其他具有生命活性细胞器的生物质，对于微生物来说即去除细胞壁的细胞。
原生质体也可以作为诱变的对象，其对外界敏感度很高，因此变异率也很高。
1 经典诱变技术1.1 物理诱变1.1.1 紫外诱变DNA由以嘌呤和嘧啶为碱基的核苷酸组成，紫外线诱变可以使嘧啶形成二聚体，DNA在复制和转录时，因存在嘧啶二聚体而不能分离，进而发生变异。
该方法简单、操作安全且诱变率高，其缺点：诱变原理简单，引起的突变单一，形成的突变体类型较少，而对于基因损伤及其修复的研究却很有意义。
现在，对于细菌、酵母菌或霉菌的紫外诱变往往是对其原生质体的诱变，缺少了细胞壁对细胞的保护，紫外线可以更直接的作用于DNA，提高突变率，从而产生更多的突变体和表现型。
第五章工业微生物育种诱变剂
亚硝酸诱发的突变
HNO2 A T H C G C G C HNO2 A U A T
A:T
G┆C
19
亚硝酸的处理方法
1. 试剂的配制
（1）1mol/LpH4.5醋酸缓冲液
（2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液 （3）0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液
2.处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例）
第五章 工业微生物育种诱变剂 本章内容：
化学诱变剂
物理诱变剂
生物诱变剂
•诱变：通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微 生物以引起突变，这一过程称为诱发突变。
诱发突变(induced mutation)的发现
1927年，Muller 用X射线诱发果蝇遗传性状变异。
在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性状变
5-BU掺入后的复制错误
A:T
G ≡ BUe G≡ C
G≡ C
A: BUk
A:T
A:T
G ≡ BUe
A=BUk
A=T
G ≡ C→A=T
G ≡ BUe
G ≡C A: T → G ≡ C
G ≡ BUe
10
•由于5-BU的诱变作用是在DNA复制过程中实现的，因
此，处在静止或休眠状态的细胞是不适合的。
•细菌采用对数期的细菌，霉菌、放线菌采用孢子，
处理浓度为25—40μg/ml,混合均匀——取0.1—0.2ml菌悬液
加入到琼脂平板上涂布培养——在适宜温度下，使之在生长 过程中诱变处理——培养后挑取单菌落，进行筛选。
真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度（0.1—1mg/ml）， 加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时(一般6—12h)——分离
微生物的诱变育种
2个主要环节：
诱变（随机）
选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀 、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞 致死的同时，使存活个体中的突变频率大大 提高。 设计有效的筛选方法，将少量正变株中的 优良菌株挑选出来。
筛选（定向）
（一） 出发菌株（original strain）
出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。 出发菌株的选择标准： • 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、 标记明显等）； • 对诱变剂敏感 出发菌株的来源： •野生型菌株； •从生产中选育的自发突变菌株； •诱变获得的高产菌株
三种遗传型： 野生型（wild type） 从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。 [A+B+], 可在[-]生长。 营养缺陷型（auxotroph） 野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能 力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的 突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。 [A+B-]：能在[+]、[B]生长 [A-B+]：能在[+]、[A]生长 [A-B-]：能在[+]生长 原养型（prototroph） 营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求 [A+B+], 可在[-]生长
如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物 ，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株， 可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。 加入不含异烟肼的底层 敏感
菌苔
为什么在筛选突变株时 ,不能直接用代谢产物, 抗性 菌落 而必须用其结构类似物 ? 加入含异烟肼的上层
2. 营养缺陷型突变株的筛选
（1）几个概念： 三类培养基： 基本培养基（MM, minimal medium）[-]： 某野生型能生长的最低成分的组合培养基。 完全培养基（CM,complete medium）[+]： 各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基 补充培养基（SM, supplemental medium）[A]:[-]+A [B]:[-]+B 相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基
5工业微生物育种诱变剂
X射线波长是0.06~136纳米， X射线一般由X光机产生。 γ射线的波长是0.006~1.4纳米 ，γ射线来自放射性元素钴、
镭或氡等。 中子可以从回旋加速器、静电加速器或原子反应堆中产生 快中子具有的能量最高，为0.2~10MeV
电离辐射诱变机理
直接作用：打断化学键 间接作用：通过自由基打断化学键，引起缺失和损伤 • 效应：染色体畸变，碱基置换，移码突变
1.4 非电离辐射——紫外线
–2. 紫外线诱变
(4) 紫外线诱变的步骤与方法
① 出发菌株：把细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子 刚成熟。
② 前培养：营养丰富的培养基+抑制修复物质，如咖啡碱或异烟肼等。 霉菌、放线菌培养到绝大部分孢子刚刚萌发。
③ 制备菌悬液：离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液，分散程度 达90~95%。要求菌悬液浓度：细菌约1×108个/毫升，放线菌107~108 个/毫升，霉菌约106~107个/毫升。
1.4 非电离辐射——紫外线
136-390nm
1.4 非电离辐射——紫外线
紫外线可由紫外灯管产生。要求的设备 简单、操作方便、价格低廉。
紫外线诱变效果显著。诱变频率高，而 且不易发生回复突变。
因此紫外线是一种使用最早也是沿用最 久的应用效果最明显的物理诱变剂。
DNA分子能吸收紫外线光谱。其中嘧啶碱基比嘌呤碱基敏感上 百倍。 紫外线使DNA分子发生如下几种变化：①DNA与蛋白质交联； ②胞嘧啶和尿嘧啶之间的水合作用；③DNA链的断裂；④形成 嘧啶二聚体。这是紫外线引起的主要变化。
碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类 似，因此能取代碱基掺入到DNA分子中的一类化合物。 主要诱变剂：5-溴尿嘧啶（5-BU） /T
微生物 诱变育种
紫外损伤的光复活作用
DNA损伤的修复
切补修复 切补修复是在内切核酸酶、
外切核酸酶、DNA聚合酶以及 连接酶的协同作用下将嘧啶 二聚体酶切除去，继而重新 合成一段正常的DNA链以填补 酶切所留下的缺口，使损伤 的DNA分子恢复正常的修复方 式。由于整个过程不依赖于 可见光，所以切补修复也称 暗修复。切补修复几乎存在 于所有的微生物中。
也可用长了菌落的平板直接照射。 一般照射剂量4~10万伦琴。
此外还能引起染色体畸变，即因 染色体断裂引起染色体的倒位、 缺损和重组等。但发生了染色体
断裂的细胞常常不稳定。
化学诱变因素
化学诱变剂用量很少，诱变时设
备简单，只要一般实验室的玻璃 器皿就行，所以其应用发展较快。
碱基类似物
碱基类似物是指与DNA结构中的四种碱基 A、T、G、C在化学结构上相似的一类物 质。如5-溴尿嘧啶（BU）和5-溴脱氧尿
紫外损伤的切补修复
紫外线照射的操作方法
在暗室中安装的15瓦紫外线灯管最 好装有稳压装置，以求剂量稳定。
处理时，可将5毫升菌悬液放在直径 5厘米的培养皿中，置磁力搅拌器上， 使培养皿底部离灯管30厘米左右， 培养皿底要放平，处理前应先开灯 20~30分钟预热稳定。照射时启动磁 力搅拌器，以求照射均匀。
诱变育种
第一节基因突变
突变泛指细胞内（或病毒颗粒 内）的遗传物质的分子结构或 数量突然发生的可遗传的变化。
突变往往导致产生新的等位基 因及新的表现型。狭义的突变 专指基因突变，也称点突变， 而广义的突变则包括基因突变 和染色体畸变。
突变的几率一般很低，约为106~10-9。
突变是工业微生物产生变种 的根源，是育种的基础，但 也是菌种发生退化的主要原 因。
第五章工业微生物育种诱变剂
突变的次要位点：鸟嘌呤的N3，腺嘌呤的N2、 腺嘌呤的N7、胞嘧啶N3
（二）烷化剂的性质
① 溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶 液中容易发生分解。
② 大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液pH关系 很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。 配制烷化剂时，要采用合适的出缓冲液。
（6）稀释涂皿，后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀释度，涂皿，并
且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照，培养后，挑取菌落，以待筛选。
四、电离辐射
伦 琴 和
射 线
X
四川成都放60CO运输
河南杞县“杞人忧钴”
2. 电离辐射剂量
快中子：拉德（rad）；伦琴（R）
致死率达到50％～85％比较合适，诱变剂量大约在15～
1. UPF值是紫外线对未防护的皮肤的平均辐射量的比 值，UPF值越大，表明防紫外线性能越好。
2. 只有当UPF＞30时，并且UVA的透过率小于5％时，才 能称为防紫外线产品，防护等级标识为UPF30＋；
3. 而当UPF＞50时，则表明该产品的紫外线防护性能极 佳，防护等级标识为UPF50＋。
UPF范围 15－24 25－39
处理完毕后继续冰浴可降低或抑制修复酶的活性。
宇宙射线
五、近年来发展的新型诱变剂
1. 微波 微波对微生物的诱变效应有2个方面的因素，即
热效应和非热效应。 ① 热效应是指物料吸收微波能量，使温度升高从而 达到灭菌的效果； ② 非热效应则是在电磁波的作用下，生物体内不产 生明显的升温，却可以产生强烈的生物效应。
2-氨基嘌呤（AP）可以和胸腺嘧啶互配，但出 现亚氨基状态时，和胞嘧啶配对。
工业微生物育种学4
四、电离辐射
常用的微生物诱变电离辐射
物理诱变剂 X射线 波长 生物学效应 0.06~136nm 1 脱氧核糖的降解 2 糖-磷酸骨架的断裂 3 丧失嘌呤 0.006~1.4nm 4 碱基的羟基化 5 自由基和DNA分子反应 6 DNA链的断裂
γ射线
快中子
X射线和γ射线
X射线和γ射线的剂量单位通常以伦琴来表示，即 1cm3干燥空气在0℃、1.013×105帕气压下，产生 2.08×109离子时所需的能量。 其作用机理是使原子中的电子被击出而变成正离子。 由于具有很强的穿透能力，所以对细胞的杀死作用 比紫外线和一般化学试剂更强。在实践中不用象紫 外线那样进行反复多次照射。 切忌使用高剂量进行处理，一般掌握在90~99.9% 的杀菌率为宜。
电离辐射
一些高能射线在照射并穿过物质的过程中，能把 该物质分子或原子上的电子击中而产生正离子， 故称电离辐射。产生的正离子数量随着射线发射 的能量增高而增加。 如X射线、γ射线和快中子等。
快中子有点特别。它本身是不带电荷的粒子，不 直接产生电离，但是它可使吸收中子物质的原子 核被撞击出质子。
杀菌率和诱变效果
照射剂量越高，杀菌率也越高，在残存细胞中的 变异幅度也广。一般认为杀菌率以90%~99%效 果较好。但也有报道说，较低的杀菌率 （70%~80%）有利于正突变型的产生。
因此我们要设法掌握好减少死亡率和提高诱变效 果之间的矛盾。
紫外线诱变的步骤和方法
1 斜面培养出发菌株
关于辐射引起的生物效应
辐射引起的生物效应与射线种类和微生物的种 类有关。同一种射线对不同的微生物其效应也 不一样，这与每种微生物修复系统的强弱不同 有关。 电离辐射主要引起DNA上的基因突变和染色体 畸变；非电离辐射主要是形成嘧啶二聚体。 物理诱变剂引起微生物的变异或死亡与辐射剂 量成正比。在相同的总辐射剂量的条件下，不管是一次连续
微生物诱变育种的方法
微生物诱变育种的方法微生物，这小小的生物世界里的居民，有着大大的能量。
而诱变育种呢，就像是给微生物来一场奇妙的变身之旅。
物理诱变是一种常见的法子。
紫外线就像是微生物世界的严厉教官。
微生物们在紫外线的照射下，就如同小士兵接受艰苦的训练。
紫外线那强烈的能量，会打乱微生物内部的基因结构。
比如说一些细菌，原本规规矩矩地按照自己的基因蓝图进行生长繁殖，紫外线一照，就像打乱了建筑图纸一样，基因里的一些部分发生了错乱。
有的微生物在这错乱中就产生了新的特性，也许原本不会产生某种特殊酶的，经过紫外线照射后就有了这种能力。
还有X射线，这可是更厉害的家伙。
如果把微生物比作是一个精密的小机器，X射线就像一把强力的干扰器。
它能深深钻进微生物的内部，对基因进行破坏和重组。
就像把小机器里的一些零件拆下来又重新组装，只不过这里是在基因层面。
有的微生物经X射线诱变后，抗逆性变强了。
原本在稍微恶劣一点的环境里就奄奄一息的，现在能坚强地活下去，而且还活得挺好。
化学诱变也不甘示弱。
化学诱变剂就像是给微生物的基因施魔法的小巫师。
像亚硝酸，它悄悄地接近微生物的基因，把基因里的一些碱基偷偷换掉。
这就好比在密码锁上换了几个密码数字，整个密码锁的开锁方式就可能完全变了。
微生物的基因表达也就随之改变。
一些霉菌经过亚硝酸诱变后，产孢子的能力可能大大增强，原本产一点点孢子的，现在像开了挂一样大量产孢子。
再说说碱基类似物，它们是伪装高手。
它们混入微生物的基因大厦里，伪装成正常的碱基。
可是一旦到了基因复制的时候，就开始捣乱了。
就像一个假零件混进了真零件堆里，在机器组装的时候就会出问题。
这种捣乱会导致基因复制出错，从而产生突变。
有的酵母菌经过碱基类似物的诱变后，发酵能力变得超强，能产生更多的酒精或者其他有用的代谢产物。
复合诱变就像是给微生物来一套组合拳。
先给微生物来点物理诱变，就像先给它一个下马威，打乱它的基因阵脚。
然后再用化学诱变，进一步在混乱的基因里搞点新花样。
微生物诱变育种
微生物诱变育种：生命的奇妙微生物是我们身边最小的生命体，很多时候我们并不能直接感知它们的存在。
然而，它们却能通过一种特殊的方式——诱变（Mutation）——影响着我们生活中的各种生物群体，包括人类、动植物等等。
今天，我们就来谈谈这个新颖而神秘的话题。
什么是？简单来说，指的就是利用微生物对某种生物进行诱变，从而改变它的基因表达，产生新品种、新性状的一种育种方法。
这个方法的基本原理是：用化学或其他手段让微生物基因发生突变，再通过微生物对某种有用的基因进行筛选，最终通过繁殖来获得新生物种。
诱变是什么？这里我们需要先了解诱变的概念。
诱变是指基因发生变异，导致基因型和表型的改变，是一种与遗传和进化有关的生物现象。
地球上存在着各种各样的微生物，它们在不同的环境和生长条件下会产生大量的基因突变。
这些基因突变可能是随机的或者是特定的，在这个过程中，新的基因型可能获得某些新的性状，这样的性状可能比它们的亲代更有生存优势。
为什么是一种前景广阔的育种方法？之所以前途广阔，是因为它具有以下几个优点：首先，基因突变是自然而然的，而方法则是针对性地诱导微生物进行突变。
这一方法大大缩短了新品种的选育时间和成本。
其次，这种方法不涉及基因编辑技术和转基因技术。
这一点非常重要，因为基因编辑技术和转基因技术可能会对人类和环境造成潜在的风险。
最后，方法具有高效、广泛适用性等诸多优点。
由于微生物的数量庞大，不同的微生物可以用于诱变不同的生物，且微生物在实验中具有高容错性。
在实践中有哪些成功案例？在实践中已经有了很多成功案例。
比如，在植物育种方面，通过微生物诱变，我们可以获得既耐旱又耐病的新品种；在饲料育种方面，我们可以获得既营养丰富又易于消化的新饲料等等。
的应用还不止于此，例如医疗领域，我们可以通过微生物诱变来研制更加安全、有效的药物；在水产养殖中，通过微生物诱变可以获得更加健康和肥壮的水生动物。
结语是生命科学领域的一种创新、前沿的研究方向。
工业微生物菌种的选育——诱变选育(1)
工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）诱变选育诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。
诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。
诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。
诱变育种的步骤与方法（一）、工业育种的一般步骤（图）（二）、诱变育种方案设计诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。
1、出发菌株的选择工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。
出发菌株选择目前主要依据实际经验，总结如下：①以单倍体纯种为出发菌株；②采用具有优良性状的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。
2、出发菌株的纯化为什么要对出发菌株进行纯化呢？这是因为微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。
生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。
这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。
通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。
常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子。
3、单孢子悬液的制备诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。
首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。
其次是分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。
由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。
第五章工业微生物育种诱变剂共62页文档
➢ 在DNA复制过程中取代正常碱基，整合进 DNA分子 ➢ 它们产生异构体的频率高，出现碱基错配的 概率也高
5
（一）碱基类似物的诱变机制
——现以5-BU为例来分析碱基类似物的诱变机制。当胸 腺嘧啶分子结构中5位碳原子上的甲基被溴（Br）原子取 代，就构成了5-BU的结构式。
C
U
A
次黄嘌呤H
16
亚 硝 酸 的 脱 氨 基 作 用 及 其 诱 发 的 突 变
17
亚硝酸诱发的突变
H N O 2 A H GG A A T C CC U T
H N O 2
A:T G┆C
18
亚硝酸的处理方法
1. 试剂的配制
（1）1mol/LpH4.5醋酸缓冲液 （2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液
由于羟胺是诱发G:C
A:T的专一性诱变剂，因
此，可以用来鉴别突变体是A:T G:C还是G:C
A:T转换。
羟胺的处理方法：常用浓度为0.1—5%，可直接 在溶液中处理，时间1—2h，然后分离培养。但一般 都加到琼脂平板或振荡培养基中，然后接入孢子或 细菌，在适温下培养，生长过程中处理，所用浓度 比直接处理时低些。
（3）0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液
2.处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例）
• 取孢子悬液1ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及0.1mol/L亚硝酸钠溶 液1ml，最后处理浓度为0.025mol/L。于25—26℃保温10— 20min，加入0.07mol/L、pH8.6的磷酸氢二钠溶液20ml，使 pH下降至6.8左右，以终止反应。稀释分离于平板。
3．烷化剂
——烷化剂是诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂， 这类诱变剂具有一个或多个活性烷基，它们易取代DNA 分子中活泼的氢原子，直接与一个或多个碱基起烷化反 应，从而改变DNA分子结构，引起突变。
第五章工业微生物基因育种
1960年，F.Jacob和J.Monmd提出了操纵元 （操纵子）的概念，揭示了原核生物基因表达 调控的重要规律。
基因的现代概念
移动基因（movable gene） 断裂基因（split gene） 假基因（pseudogene）
四),重组载体引入受体细胞: 微生物,动物或植物细胞.使用最广泛的是
E.coli.其次为枯草杆菌和酿酒酵母. 以重组质粒作载体,用转化方法; 以病毒DNA 作重组载体,用感染方法.
理想情况,重组载体进入受体细胞,通过自 主复制而大量扩增,使受体细胞表达出供体基 因所提供的部分遗传性状,受体细胞就成为工 程菌.
图
基因工程的应用
基因工程技术已经在医学、工业、 农业等各个领域得到了广泛的应用。
在医学上的应用 基因工程被用于大量生产过
去难以得到或几乎不可能得到的 蛋白质－肽类药物。
转基因动物和植物 转基因动物首先在小鼠获得成功。现在
转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/ 羊 奶中可以生产蛋白质药物。称为“乳腺反 应器”工程。
2,生产新的抗菌素 天蓝链霉菌合成蓝色的多酮肽抗 菌素-放线紫红素,麦迪霉素产生菌合成褐色的麦迪霉 素.经过两级克隆,麦迪霉素产生菌产生一种新的紫色 化合物,是麦迪霉素与放线紫红素的杂种化合物,为一 种新的抗菌素,命名为MederhodinA.
3,改良工业酶生产菌株:蛋白酶,木糖异构酶,纤维素 酶,葡萄糖淀粉酶以及凝乳酶等均进行了研究.研究 较多的是α-淀粉酶和青霉素酰化酶. 1981年起,在枯草杆菌或大肠杆菌中克隆和表达 了来自枯草杆菌,淀粉液化芽孢杆菌,凝结芽孢杆菌, 嗜热脂肪芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等菌种的α-淀 粉酶基因,比野生株最高的可达30倍.目前美国已用 基因工程菌生产. 德国首先克隆大肠杆菌青霉素G酰化酶基因.我 国青霉素G酰化酶的产量可达3000单位/L以上.
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株时，应选择多种遗传类型的菌株作为出发菌株比较
稳妥，容易在较短时期内达到育种目的。
8. 菌种代谢特点
了解菌种代谢特点有助于选择有效的出发菌株。 有人曾研究过肌苷酸产生菌的代谢特性，发现肌苷 酸的生物合成过程与肌苷、肌苷酸及核苷酸、磷酸 化酶的活性有关，如果从产生肌苷酸野生型的枯草 杆菌中筛选到降解酶活性低而磷酸化酶活性强的作 为诱变出发菌株，一般都能得到良好的诱变效果。
6. 药品和原材料质量
药品规格和原材料来源不同，都会影响菌种的质量。
四、了解菌种有效产物中的 各种组分在代谢 合成过程中与培养条件的关系
由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinopora) 产生的庆大霉素，其中C1是有效的组分； C2是无效
的。在发酵过程中加入适量的磷或蛋白胨以及加大 通 风量都有利于C1的合成；反之，C2的比例就上升。
菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或 缓冲液制备而成。对菌悬液的制备有如下的要求：
1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。
细胞要新培养的，细胞生理活性方面既要同步， 又要处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也 好。 霉菌孢子浓度约为：106ml-1，放线菌孢子浓度约 为：106~107ml-1。菌悬液通常采用生理盐水制备。如 果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制， 以防处理过程中pH变化而影响诱变效果。
1. 对一般出发菌株的要求
（1）从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽 然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，
正突变率高；
（2）在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在 生产过程经过自然选育的菌株； （3）采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营 养要求低以及产生孢子早而多的菌株；
（4）由于有些菌株在发生某一些变异后会提高对其 他诱变因素的敏感性，故有时可考虑选择已发 生 其他变异的菌株作为出发菌株。 例如：在金霉素生产菌株中，曾发现以分泌黄色色 素的菌株做出发菌株时，只会使产量下降，而 以失去色素的变异菌株作出发菌株时，则产量 不断提高。
（一） 区分不同菌落类型
一般情况下在同一种培养基和培养条件下往往会 出现多种形态类型的菌落（约有2~5种），不同类型 的菌落其代谢产物的生产能力有较大的差异。
但在特定的培养基和培养条件下，每个菌落都有 其占优势的菌落类型，这种主要类型的菌落形态、特 征、生理生化性状及其生产能力基本上决定了该菌种 的特性，称这种菌落类型为正常型菌落。
2、由非遗传因素产生的“变异”。
（1）培养基组成不同； （2）用于培养基配制的药品、原材料的来源、规格、 质量的差别； （3）培养基平板厚薄不一而引起营养、水分分配不 均； （4）平板上菌落密度希稠限制了营养物质的供应； （5）菌落不同的生长阶段其形态特征也不一样。
这种由非遗传因素造成的与由遗传因素引起的菌落类型是 难以分辨的。不过，由这种非遗传因素产生的“变异”是一 种 假变异，它们是不能遗传的，当菌种离开这种环境，重新移
五、建立一个准确、简便、快速检测产物 的方法
由于诱发突变频率极低，需要从一定量的诱变分 离菌株中筛选，才有可能获得较理想的突变株。限制 筛选量的主要因素，除了摇瓶量之外，检测方法也是 重要因素，所以建立一个适应于大规模筛选的有效的 检测方法是十分必要的。
六、研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件
一个优良菌种的获得往往要花费巨大的人力、 物力和时间，是非常不容易的，不能随便采用某个 培养基、培养条件和保藏方法进行培养和保藏。否 则，容易发生回复突变，使菌种特性衰退，优良特 性消失，结果将前功尽弃。
诱变育种的步骤和方法包括：
1、出发菌株的选择；
2、单孢子（或单细胞）菌悬液的制备； 3、诱变剂及诱变剂量的选择，诱变的处理方法； 4、诱变菌株的纯化分离。
一、出发菌株
长期育种经验证明，诱变处理前选择怎样的出 发菌株，以及对出发菌株的生物学特征的全面了解 是很重要的。特别对菌种的遗传背景、稳定性、纯 一性以及形态、生理、生化等特性研究，都有利于 提高诱变效果。
一、诱变前对出发菌株的了解
每个菌株在特定的培养基和培养条件下，具有
特异性的菌落和培养特征。在不同的培养基和培养条
件下菌落形态是不一样的。
霉菌、放线菌的菌落形态特征包括： 菌落大小、形状、高度、放射线多少、外观组织 结构（粉状、绒毛状、絮状等）、孢子多少和色泽、 可溶性色素情况等。 细菌菌落形态特征包括： 菌落大小、形状、边缘结构、高度、颜色、色泽、 黏性、表面结构、可溶性色素等。
主要影响有如下几个方面:
1. 培养基
这是影响菌种和孢子形成的重要因素之一，其中
碳、氮源的种类、浓度影响很大。
2. 培养基斜面的制备技术
通常配制培养基时，要注意药品的原材料质量、 规格；培养基蒸汽消毒时，压力、时间等。当琼 脂质量较差或培养基中碳源多、pH呈酸性时，琼脂量
要略为增加。琼脂加量根据季节不同也要作适当变
另外发酵周期中的不同阶段，有效组分和无效组 分合成的比例也由较大的差异。就庆大霉素产生菌 A-1菌种来说，当发酵培养到130~135h，C1组分最 高，但在此时期前后C2相应比例也增加，此后C1逐步 下降，为了尽量不影响产品质量，该菌最适发酵周期 应控制在130~135h。 了解有效组分比例与培养条件的关系，便于对菌种 培养过程中的控制，使菌种优良特性充分发挥。
3. 选择纯种作出发菌株： 纯种是指细胞在遗传上应该是同质性的。诱变中 要选择单倍体、单核或少核的细胞作为出发菌株。
4. 选择出发菌株应考虑其稳定性
用作出发菌株除考虑纯种外，还要尽可能挑选生 物合成能力较高的、遗传性状比较稳定的菌株，使育
种工作在较高的水平线上起步。
一般认为高产量的菌株不一定是继续提高产量 潜力最大的菌株。在这种情况下应设法通过杂交、 原生质体融合手段，使遗传物质重新组合，产生新 的重组体，改变遗传类型，提高菌种对诱变剂的敏 感性，诱变后可以显著提高正突变率。
6. 选择出发菌株的其他因素
要选择具有产孢子较多、不产或少产色素、生
活能力强、生长速度快、周期短以及糖氮利用快、 耐消泡、黏度小等性状的菌株作为出发菌株，总 之，要尽量符合育种所需要的生物学和代谢的特性。
7. 采用多出发菌株
在没有详细研究特定出发菌株敏感性的条件下， 而且又不能单纯用生产能力高的菌株作为唯一出发菌
第五章 微生物诱变育种
第一节 第二节 第三节 第四节
诱变育种的试验设计和准备工作 诱变育种的步骤与方法 突变株的分离与筛选 营养缺陷型菌株的筛选
微生物的诱变育种：是以人工诱变手段诱发微 生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，
从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的
突变株，并且找出发挥这个变株最佳培养基和培养 条件，使其在最适环境条件下合成有效产物。
植到原来培养基和培养条件下，其形态又可恢复原状。
二、全面了解菌种特性及其与生产性能的关系
首先要多方面考查菌种的生活史，了解它们的
形态、生理、生化等生物学特性，以及这些特性与代
谢产物合成的关系，还要研究菌种的某些生物学特性 与产量合成的相关性。
三、了解影响菌种生长发育的主要因素
菌种选育工作中，要不断进行移接、培养，因 此必需了解影响菌种生长发育的主要因素，否则， 即使摆在眼前的高产菌株也因某些因素的干扰而掩 盖原有的形态和其他生物特性，造成漏筛或高产特 性难以发挥，甚至发生变异、退化。
3. 简化工艺条件：
通过诱变改善菌种特性，选育出更适合于工业化 发酵要求的突变株。
4. 开发新品种： 通过诱变育种，可以获得各种突变株，其中不难 分离到改变产物结构的、去除多余的代谢产物，改变
原有代谢途径，合成新的代谢产物的新品种。例如，
诱变柔红霉素产生菌，筛选出能产生抗癌的阿霉素突 变株。
第一节 诱变育种的试验设计 和准备工作
工业微生物育种过程分为三个阶段：
1、菌种基因型改变； 2、筛选菌种，确认并分离出具有目的基因型或表型 的变异株； 3、产量评估，全面考察此变异株在工业化生产商的 接受性。
理想的工业用菌种必须具备：
遗传性状稳定；纯净无污染；能产生许多繁殖 单位；生长迅速；能于短时间内生产所要的产物；
可以长期保存；能经诱变，产生变异和遗传；生产
二、出发菌株的纯化
划线分离法
稀释分离法
显微镜操纵器分离单孢子 显微镜操纵器分离单孢子结合延长培养时间，使孢 子趋向老年阶段，遗传性状趋向稳定。
三、单孢子（或单细胞）悬液的制备
在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀 的悬液装状态。因为： A、分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂。 B、避免长出不纯菌落。
（5）在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考
虑至少能累积少量所需产物或其前体的菌株，而在 选择产抗生素的出发菌株时，最好选择已通过几次
诱变并发现每次的效价都有一定程度提高的菌株作
为出发菌株。
选育菌种的目的，是将优良菌种推广到工业化生 产，对此，在选择出发菌株时还要注意如下几个方面： 2. 选择具备一定生产能力或某种特性的菌株作为出 发菌株。 最好采用生产上使用过的，适应于某发酵设 备条件的生产菌种作为出发菌株，这样选育出来的菌 种易于推广到工业生产中。
பைடு நூலகம்
诱变育种工作包括：
1、诱发突变：包括出发菌株、诱变剂及其剂量的选择、影响 诱变效果的因素。 2、突变株的筛选：包括筛选条件（培养基和培养条件）及选 择一个简便、快速、有效的筛选方法。 3、高产突变株最佳环境条件的调整：最佳培养条件改变。
以上是决定诱变育种成败的三个方面，在育种开展之 前，根据试验目的紧紧围绕三个环节制定试验方案。
（二） 出现不同菌落类型原因
1、由遗传因素决定的。
如：（1）由核基因或染色体外遗传物质引起自发突变。 （2）某些高产突变菌株，在传代过程中产生回复突变， 由 杂交或原生质体融合获得的二倍重组体在繁殖过程中 产生分离子等。