第五章 工业微生物诱变育种

工业微生物育种过程分为三个阶段：
1、菌种基因型改变； 2、筛选菌种，确认并分离出具有目的基因型或表型 的变异株； 3、产量评估，全面考察此变异株在工业化生产商的 接受性。
理想的工业用菌种必须具备：
遗传性状稳定；纯净无污染；能产生许多繁殖 单位；生长迅速；能于短时间内生产所要的产物；
可以长期保存；能经诱变，产生变异和遗传；生产
主要影响有如下几个方面:
1. 培养基
这是影响菌种和孢子形成的重要因素之一，其中
碳、氮源的种类、浓度影响很大。
2. 培养基斜面的制备技术
通常配制培养基时，要注意药品的原材料质量、 规格；培养基蒸汽消毒时，压力、时间等。当琼 脂质量较差或培养基中碳源多、pH呈酸性时，琼脂量
要略为增加。琼脂加量根据季节不同也要作适当变
因此，事先研究一个最的培养基。培养条件和适 宜的保藏方法是相当重要的。
第二节 诱变育种的步骤与方法
诱变育种在工业发酵菌种史上创造了辉煌业 绩，它具有方法简单、投资少、收获大等优点，但 它最大缺点是缺乏定向性。对此，除了深入开展诱 变机制研究外，在诱变育种过程中应注意出发菌株、 诱变剂及诱变剂量的选择、诱变处理方式方法的应 用，以及结合有效的筛选方法等来弥补不足，以提 高诱变育种的效率。
五、建立一个准确、简便、快速检测产物 的方法
由于诱发突变频率极低，需要从一定量的诱变分 离菌株中筛选，才有可能获得较理想的突变株。限制 筛选量的主要因素，除了摇瓶量之外，检测方法也是 重要因素，所以建立一个适应于大规模筛选的有效的 检测方法是十分必要的。
六、研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件
一个优良菌种的获得往往要花费巨大的人力、 物力和时间，是非常不容易的，不能随便采用某个 培养基、培养条件和保藏方法进行培养和保藏。否 则，容易发生回复突变，使菌种特性衰退，优良特 性消失，结果将前功尽弃。
植到原来培养基和培养条件下，其形态又可恢复原状。
二、全面了解菌种特性及其与生产性能的关系
首先要多方面考查菌种的生活史，了解它们的
形态、生理、生化等生物学特性，以及这些特性与代
谢产物合成的关系，还要研究菌种的某些生物学特性 与产量合成的相关性。
三、了解影响菌种生长发育的主要因素
菌种选育工作中，要不断进行移接、培养，因 此必需了解影响菌种生长发育的主要因素，否则， 即使摆在眼前的高产菌株也因某些因素的干扰而掩 盖原有的形态和其他生物特性，造成漏筛或高产特 性难以发挥，甚至发生变异、退化。
一、诱变前对出发菌株的了解
每个菌株在特定的培养基和培养条件下，具有
特异性的菌落和培养特征。在不同的培养基和培养条
件下菌落形态是不一样的。
霉菌、放线菌的菌落形态特征包括： 菌落大小、形状、高度、放射线多少、外观组织 结构（粉状、绒毛状、絮状等）、孢子多少和色泽、 可溶性色素情况等。 细菌菌落形态特征包括： 菌落大小、形状、边缘结构、高度、颜色、色泽、 黏性、表面结构、可溶性色素等。
6. 选择出发菌株的其他因素
要选择具有产孢子较多、不产或少产色素、生
活能力强、生长速度快、周期短以及糖氮利用快、 耐消泡、黏度小等性状的菌株作为出发菌株，总 之，要尽量符合育种所需要的生物学和代谢的特性。
7. 采用多出发菌株
在没有详细研究特定出发菌株敏感性的条件下， 而且又不能单纯用生产能力高的菌株作为唯一出发菌
3. 选择纯种作出发菌株： 纯种是指细胞在遗传上应该是同质性的。诱变中 要选择单倍体、单核或少核的细胞作为出发菌株。
4. 选择出发菌株应考虑其稳定性
用作出发菌株除考虑纯种外，还要尽可能挑选生 物合成能力较高的、遗传性状比较稳定的菌株，使育
种工作在较高的水平线上起步。
一般认为高产量的菌株不一定是继续提高产量 潜力最大的菌株。在这种情况下应设法通过杂交、 原生质体融合手段，使遗传物质重新组合，产生新 的重组体，改变遗传类型，提高菌种对诱变剂的敏 感性，诱变后可以显著提高正突变率。
第五章 微生物诱变育种
第一节 第二节 第三节 第四节
诱变育种的试验设计和准备工作 诱变育种的步骤与方法 突变株的分离与筛选 营养缺陷型菌株的筛选
微生物的诱变育种：是以人工诱变手段诱发微 生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，
从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的
突变株，并且找出发挥这个变株最佳培养基和培养 条件，使其在最适环境条件下合成有效产物。

菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或 缓冲液制备而成。对菌悬液的制备有如下的要求：
1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。
细胞要新培养的，细胞生理活性方面既要同步， 又要处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也 好。 霉菌孢子浓度约为：106ml-1，放线菌孢子浓度约 为：106~107ml-1。菌悬液通常采用生理盐水制备。如 果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制， 以防处理过程中pH变化而影响诱变效果。
2、由非遗传因素产生的“变异”。
（1）培养基组成不同； （2）用于培养基配制的药品、原材料的来源、规格、 质量的差别； （3）培养基平板厚薄不一而引起营养、水分分配不 均； （4）平板上菌落密度希稠限制了营养物质的供应； （5）菌落不同的生长阶段其形态特征也不一样。
这种由非遗传因素造成的与由遗传因素引起的菌落类型是 难以分辨的。不过，由这种非遗传因素产生的“变异”是一 种 假变异，它们是不能遗传的，当菌种离开这种环境，重新移
1. 对一般出发菌株的要求
（1）从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽 然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，
正突变率高；
（2）在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在 生产过程经过自然选育的菌株； （3）采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营 养要求低以及产生孢子早而多的菌株；
（4）由于有些菌株在发生某一些变异后会提高对其 他诱变因素的敏感性，故有时可考虑选择已发 生 其他变异的菌株作为出发菌株。 例如：在金霉素生产菌株中，曾发现以分泌黄色色 素的菌株做出发菌株时，只会使产量下降，而 以失去色素的变异菌株作出发菌株时，则产量 不断提高。
3. 简化工艺条件：
通过诱变改善菌种特性，选育出更适合于工业化 发酵要求的突变株。
4. 开发新品种： 通过诱变育种，可以获得各种突变株，其中不难 分离到改变产物结构的、去除多余的代谢产物，改变
原有代谢途径，合成新的代谢产物的新品种。例如，
诱变柔红霉素产生菌，筛选出能产生抗癌的阿霉素突 变株。
第一节 诱变育种的试验设计 和准备工作
（一） 区分不同菌落类型
一般情况下在同一种培养基和培养条件下往往会 出现多种形态类型的菌落（约有2~5种），不同类型 的菌落其代谢产物的生产能力有较大的差异。
但在特定的培养基和培养条件下，每个菌落都有 其占优势的菌落类型，这种主要类型的菌落形态、特 征、生理生化性状及其生产能力基本上决定了该菌种 的特性，称这种菌落类型为正常型菌落。
株时，应选择多种遗传类型的菌株作为出发菌株比较
稳妥，容易在较短时期内达到育种目的。
8. 菌种代谢特点
了解菌种代谢特点有助于选择有效的出发菌株。 有人曾研究过肌苷酸产生菌的代谢特性，发现肌苷 酸的生物合成过程与肌苷、肌苷酸及核苷酸、磷酸 化酶的活性有关，如果从产生肌苷酸野生型的枯草 杆菌中筛选到降解酶活性低而磷酸化酶活性强的作 为诱变出发菌株，一般都能得到良好的诱变效果。
（5）在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考
虑至少能累积少量所需产物或其前体的菌株，而在 选择产抗生素的出发菌株时，最好选择已通过几次
诱变并发现每次的效价都有一定程度提高的菌株作
为出发菌株。
选育菌种的目的，是将优良菌种推广到工业化生 产，对此，在选择出发菌株时还要注意如下几个方面： 2. 选择具备一定生产能力或某种特性的菌株作为出 发菌株。 最好采用生产上使用过的，适应于某发酵设 备条件的生产菌种作为出发菌株，这样选育出来的菌 种易于推广到工业生产中。
动，夏天天气热，温度高，比冬季要多加一些。
3. 移种的密度
对丝状真菌来说，密度控制尤为重要。 接种量过密，不同菌落间的菌丝交织在一起，容
易吻合产生异核体，变异菌株增多，菌种发生退
化，生产能力下降。因此宜稀不宜密。
4. 温 度
温度对菌种影响很大，在培养过程中温度高，生
长快，但超过适应反围会使生产能力显著下降，甚至 引起变异，对菌种优良性状的影响，高温永远比低温 要大。
5.连续诱变育种过程中如何选择出发菌株
由于突变株的产量是数量遗传，只能逐步累加，一次性大 幅度提高发酵水平不太容易。在选择出发菌株时，应挑选每代 诱发突变后均有一些表型上改变的菌株。几乎每代出发菌株分 别在发酵单位、菌落大小、菌落结构或颜色、基质菌丝颜色、 可溶性色素以及生长速度等表型发生变异，继续经诱变因子处 理，产量又有显著的提高。这些表型上改变了的菌株，说明已 动摇了遗传稳定性，继续处理，对诱变剂的敏感性就提高了， 因而容易发生变异，易于达到育种目的。
能力具再现性；具有高产量、高收率等特性。
诱变育种的意义
1. 提高有效产物的产量： 包括提高野生菌种和改造菌种的代谢产物
或中间产物的产量。
2. 改善菌种特性、提高产品质量：
通过诱变育种，除了获得高产突变株之外，还可
以选育到一些具有良好性状的变株，包括改善产品质 量、提高有效组分比例、简化工艺、缩短周期以及适 合工业化发酵工艺要求的变株。
6. 药品和原材料质量
药品规格和原材料来源不同，都会影响菌种的质量。
四、了解菌种有效产物中的 各种组分在代谢 合成过程中与培养条件的关系
由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinopora) 产生的庆大霉素，其中C1是有效的组分； C2是无效
的。在发酵过程中加入适量的磷或蛋白胨以及加大 通 风量都有利于C1的合成；反之，C2的比例就上升。
诱变育种的步骤和方法包括：
1、出发菌株的选择；
2、单孢子（或单细胞）菌悬液的制备； 3、诱变剂及诱变剂量的选择，诱变的处理方法； 4、诱变菌株的纯化分离。
一、出发菌株
长期育种经验证明，诱变处理前选择怎样的出 发菌株，以及对出发菌株的生物学特征的全面了解 是很重要的。特别对菌种的遗传背景、稳定性、纯 一性以及形态、生理、生化等特性研究，都有利于 提高诱变效果。
5. 湿 度
湿度对菌种生长和孢子形成的影响也不可忽视， 相对湿度高了，生长慢；反之，则生长快。
如：一般产抗放线菌在不同相对湿度下培养斜面菌种时，孢子 形成的数量有明显的影响，当相对湿度40~50%时，每支 斜面的孢子数为相对湿度5~20%的4倍左右。通常真菌要 求相对湿度高，约70%。放线菌则偏低，约40~50%。
二、出发菌株的纯化

划线分离法

稀释分离法
显微镜操纵器分离单孢子 显微镜操纵器分离单孢子结合延长培养时间，使孢 子趋向老年阶段，遗传性状趋向稳定。


三、单孢子（或单细胞）悬液的制备
在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀 的悬液装状态。因为： A、分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂。 B、避免长出不纯菌落。
另外发酵周期中的不同阶段，有效组分和无效组 分合成的比例也由较大的差异。就庆大霉素产生菌 A-1菌种来说，当发酵培养到130~135h，C1组分最 高，但在此时期前后C2相应比例也增加，此后C1逐步 下降，为了尽量不影响产品质量，该菌最适发酵周期 应控制在130~135h。 了解有效组分比例与培养条件的关系，便于对菌种 培养过程中的控制，使菌种优良特性充分发挥。
（二） 出现不同菌落类型原因
1、由遗传因素决定的。
如：（1）由核基因或染色体外遗传物质引起自发突变。 （2）某些高产突变菌株，在传代过程中产生回复突变， 由 杂交或原生质体融合获得的二倍重组体在繁殖过程中 产生分离子等。
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因此，每代供诱变的出发菌株也同样要进行纯化， 使菌种留纯去杂，保持遗传稳定性。
诱变育种工作包括：
1、诱发突变：包括出发菌株、诱变剂及其剂量的选择、影响 诱变效果的因素。 2、突变株的筛选：包括筛选条件（培养基和培养条件）及选 择一个简便、快速、有效的筛选方法。 3、高产突变株最佳环境条件的调整：最佳培养条件改变。
以上是决定诱变育种成败的三个方面，在育种开展之 前，根据试验目的紧紧围绕三个环节制定试验方案。