凝胶层析法分离纯化蛋白质

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实验步骤
五、收集： 1、用试管进行样品的收集，每管1ml。
2、注意观察层析柱内分离现象，并观察收集管内颜色深浅， 以—、+、++等记号记录两种物质洗脱液的颜色。或者用400nm， 550nm测其OD值
六、凝胶柱的处理： 1、凝胶柱用过后，反复用蒸馏水（2~3倍床体积）通过柱即可。
2、如果凝胶有颜色或比较脏，需用0.5 mol/L 的NaOH-0.5 mol/L NaCl洗涤，再用蒸馏水洗。
了解凝胶层析分基本原理，学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
三、试剂和材料
1）载体：葡聚糖凝胶G-50 2）样品液：
含蓝色葡聚糖2000[相对分子质量在200万以上，蓝色]， 红色水溶性百里香酚蓝[分子质量488.60，红色]
3）洗脱液： 50mmol/L pH3.0 磷酸缓冲液。
（每组200ml。溶液配方：磷酸氢二钠：1.754g；磷酸二氢钠： 0.796g；NaCl：1.752g，用水定容至200ml。配制完成后用盐酸调pH 值为3.0）
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七、实验结果： 1、哪种物质先被分离出来？为什么？ 2、每种物质在收集过程中颜色的变化？
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实验步骤
1、凝胶的预处理 2、装柱 3、平衡 4、样品的准备 5、上样 6、洗脱和收集
7、凝胶的再生及保存
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实验步骤
一、凝胶（G-50）的预处理： 1、Sephadex G-50 干粉室温用蒸馏水充分溶胀24h。溶胀过程注 意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。 二、装柱： 1、将层析柱垂直装好，关闭出口，加入洗脱液约3cm高。 2、强处理好的凝胶自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中，待底部凝 胶沉积约1cm高时，再打开出口，继续加入凝胶浆，至凝胶沉积至 一定高度，约12cm即可。 3、装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”
实验七
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析是按照 蛋白质分子量大小进行分
离的技术，又称之凝胶过
滤、分子筛层析或排阻层 析。 凝胶过滤层析的固定相为
凝胶珠，单个凝胶珠本身
象“筛子”。不同类型凝 胶的筛孔的大小不同。
凝胶珠
带网孔的 葡聚糖凝 胶珠
小分子进入 凝胶珠内 大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层析原理示意图
一、目的 二、原理
1）凝胶层析是基于分子大小不同而进行分离的一种分离方 法。 2）将一定量的含有不同大小分子的混合原料加在柱上并用 流动相洗脱，则无法进入多孔凝胶颗粒内部的大分子会直接随 流动相由凝胶颗粒之间的空隙被洗脱下来； 3）小分子因可深入凝胶颗粒内部而受到很大的阻滞，最晚 洗脱下来； 4）中等大小的分子虽可进入凝胶颗粒内部但并不深入，受 到凝胶颗粒的阻滞作用不强，因而在两者之间被洗脱下来。
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实验步骤
三、平衡： 1、将洗脱液与恒流泵相连，用2倍床体积的洗脱液平衡，平衡 完成后，检测流出液的pH值是否为3.0。 四、加样和洗脱： 1、将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口。 2、将400ul的样品沿层析柱管壁小心加入，加完后，在打开底 端出口。 3、用少量洗脱液清洗柱内壁2次，加洗脱液至液层4cm左右， 按上恒流泵，开始洗脱。