微生物实验(湖水中细菌和抗Cu离子的细菌的总数测定,金属抗性细菌的分离、纯化、保存以及菌落形态观察)

实验题目：

湖水中细菌和抗Cu离子的细菌的总数测定，

金属抗性细菌的分离、纯化、保存以及菌落形态观察

一、实验目的

1. 学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。

2. 了解平板菌落计数法的原则。

3. 了解水质评价的微生物学卫生标准，明白其应用的重要性。

4. 熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。

5. 了解配制微生物培养基的基本原理，掌握常规的配制、分装培养基的方法。

6. 学会各类物品的包装、配制（稀释水等）和灭菌技术。

7. 从湖水中分离、培养微生物，掌握常用的分离微生物的方法。

8. 学会接种技术。

9. 观察分离出来的几种细菌的个体形态及与其相应的菌落形态特征。

10.通过观察和比较细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的菌落特征，达到初步鉴别上述微生物的能力。

二、实验原理

1、测细菌总数原理：水中的细菌总数越多，说明水中有机物的含量就越高，水体被污染的程度越重。水中细菌的种属繁多，它们对营养

和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中的细菌的总数实际上是一种近似值。肠道中的绝大多数腐生性和致病性的细菌，可在牛肉膏蛋白胨培养基上进行生长。因此应用平板菌落计数技术来测定水样中的细菌总数基本上能代表水样中细菌的数量。

2、培养基原理：培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁及微量元素和水，按一定的体积分数配制而成。调整合适的pH，经高温灭菌后以备培养微生物之用。本实验配制固体培养基，固体培养基的成分与液体相同，仅在液体培养基中加入凝固剂使呈固态。通常加入质量浓度15-20g∕L的琼脂为固体培养基。

3、灭菌原理:本次实验采取加压蒸汽灭菌法和干热灭菌法。加压蒸汽灭菌器是能耐一定压力的密闭金属锅，加压灭菌的原理在于提高灭菌器内的蒸汽温度来达到灭菌的目的。包括干热空气灭菌和火焰灼烧灭菌等以干热方法杀死细菌达到灭菌的目的。干热灭菌法适用于干燥粉末、凡士林、油脂的灭菌，也适用于玻璃器皿(如试管、平皿、吸管、注射器)和金属器具(如测定效价的钢管、针头、摄子、剪刀等)的灭菌。干热灭菌的原理是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度

要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧

4、分离纯化原理：本实验使用的平板表面涂布法，是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落的分离方法。此法加样量不宜太多，只能在0.5mL以下，培养时起初不能倒置，先正置一段时间等水分蒸发后倒置。

5、微生物的接种原理：接种就是将一定量的微生物在无菌操作条件下转移到另一无菌的并适合该菌生长繁殖所需的培养基中的过程。本次实验采取斜面接种法，使用到的接种工具是接种环，接种环一般用电炉丝或者镍丝，环的柄为金属材质，其后端套上绝热材料套。

6、菌落形态观察原理：由于微生物个体表面结构、分裂方式、运动能力、生理特性及产生色素的能力等各不相同，因而个体及它们的群体在固体培养基上生长状况各不一样。按照微生物在固体培养基上形成的菌落特征，可从菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、菌丛高度、颜色、透明度、气味、粘滞性、质地软硬、表面光滑粗糙等情况，初步辨别是何种类型的微生物。

三、实验器材及试剂

1.菌落总数

恒温培养箱、高压蒸气锅、电子天平、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；灭菌的玻璃塞瓶1个，三角烧瓶/烧杯4个，灭菌培养皿9个，1ml 移液管6支、10ml 2支、试管3支，PH试纸、玻璃棒、记号笔1

支,100ml量筒，滴管2支。

2、分离纯化

（1）样品：人工湖湖水

（2）仪器：高压蒸汽灭菌器、干燥箱、酒精灯或煤气灯、稀释水、试管、刻度移液管、锥形瓶、烧杯、量筒、滴管、吸水纸、镊子、搪瓷杯、高温灭菌锅、移液枪（枪头）、药物天平、玻璃棒、玻璃珠、石棉网、药匙、铁架、表面皿、滤纸、pH试纸和棉花、接种环、酒精灯、恒温培养箱、4大类菌落（培养皿）

（3）试剂或材料：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和琼脂、重金属离子试剂（Cu离子试剂）等

四、操作步骤

1. 玻璃器皿的准备

（1）洗涤

玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣

粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗

干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入干燥箱中烘干、备用。

（2）包装

A.移液管的包装：移液管的吸端用细铁丝（或牙签）将少许棉花

塞入构成1-1.5cm长的棉塞，起过滤作用（以防细菌吸入口中，并避

免将口中细菌吹入管内）。棉塞要塞的松紧适宜，吸时既能通气，又

不致使棉花滑入管内。然后将塞好棉花的移液管的尖端，放在4-5cm

宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30度夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下的纸折叠打结，待灭菌。

B.培养皿的包装：培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将8套培养皿（皿底朝里，皿盖朝外，4套、4套相对而放）包好。

2. 培养基的配制

（1）配制溶液

取一定容量的烧杯盛入100mL蒸馏水（有时也可用自来水），按培养基配方（0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl、2.0g琼脂、重金属Cu离子）逐一称取各种成分，依次加入水中溶解。蛋白胨、肉膏等可加热促进溶解，待全部溶解后，加水补足因加热蒸发的水量。在制备固体培养基加热融化琼脂时要注意搅拌，避免琼脂糊底烧焦。（2）调节pH，再加琼脂

一般刚配好的培养基是偏酸性的，故要用质量浓度为100g∕L NaOH调pH至7.2-7.4.应缓慢加入NaOH，边加边搅拌，并不时用pH试纸测试。调整至所需的pH。

（3）分装

A.分装试管：将培养基趁热加至漏斗中。分装时左手并排地拿数根试管，右手控制弹簧夹，将培养基依次加入各试管，用于制造斜面培养基时，一般装量不超过试管高度（15mm*150mm）的1∕5。分装时谨防培养基沾在管口上，否则会使棉塞沾上培养基而造成染菌。牛肉膏蛋白胨培养基的配方：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，Nacl 0.5g,琼