第三章 毛细管电泳分离技术-2015

1 V Ri 4 2D
0.5

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1 2
0.5
提高毛细管电泳的分辨率有两条途径： 一是通过增大分离电压来提高柱效; 二是控制电渗流，当电渗流移动方向与分离组 分的迁移方向相反，而速度大小相等时，分辨 率将趋于无穷大。
（四）影响分辨率的因素
• 1.毛细管电泳中的电解效应及缓冲溶液的选 择。 • 2.电压的影响。 • 3.黏度。 • 4.区域的畸变
（3）电泳缓冲液的pH值
• pH对一个蛋白质分子上的净电荷有明显的 作用。 • 为了优化（蛋白质）分子混合物的分离， pH值的选择应以净分子电荷为基础。 • 例如，在一个电泳泳动期间，两个或更多 的蛋白质一起迁移而只形成一条区带。如 果我们在不同的pH值下进行分析，将导致 多余蛋白质带的出现，促使样品中其它蛋 白质的分离。
• 在一个电泳泳动期间，特别在凝胶柱上， 如冷却不充分，凝胶较暖部分的迁移带的 移动速度会比那些较冷的部分快。这个迁 移速度的差异产生了弯曲带。 • 这个可以导致相邻区的重叠和差的分辨率。
（五）影响电泳淌度的因素
• • • • • • • 1.带电分子的本质 2.电泳系统的性质 （1）电泳缓冲液的离子构成 （2）温度 （3）电泳缓冲液的pH值 （4）操作电压 （5）载体介质的选择，
2.电压的影响
• 施加的分离电压越高，分辨率越大。 • 根据欧姆定律，电压与电流呈线性关系， 在熔凝毛细管中产生的热量与电流的平方 成正比，焦尔热 • 电流的产生与缓冲溶液的阴离子种类有关 ， 应选用相同电压下电流小的阴离子制备缓 冲溶液。
3.黏度
• 在凝胶电泳中温度的增加可改变媒介的黏 度。
4.区域的畸变
• 要在维持高效情况下加快CE的分离速度， 可以采用以下几种方法： • ①短而窄内径的分离毛细管； • ②高分离电压； • ③高电渗流。 • 另外，对于带负电荷的分离物，通常在缓 冲溶液中加入阳离子表面活性剂，通过改 变EOF的方向来提高分离速度。
(三)分离效率和分辨率
• 毛细管电泳分离柱效方程式 a p p V l e eo V l2
t
l ve

Ll eV
l－为毛细管柱从进样端至检测窗口的距离(有效长度)
• 电泳迁移率μe • μe =νe/E= Q/f
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ve
Q f

V L
QV 6 R s L
Q－离子所带的净电荷；f－Stokes阻力系数。η是缓冲 溶液的粘度(动力学的)，Rs是离子的有效半径(包括溶剂 化层)
• 当毛细管长度一定时，带电离子的迁移速 度与溶质离子的电荷、施加的电压、缓冲 溶液的粘度及带电离子的大小有关。
• 固、液两相之间的相对运动发生在吸 附层与扩散层之间的滑动面上，此处 的电动势称为界面电动势，也称ζ电位。 • 由于处在扩散层中的正离子的溶剂化 作用，它在电场中发生迁移时，将带 动整个溶液向阴极移动，所以就形成 电渗流。
eo
4
veo eo E
E 4
• 电渗流速度Veo与ζ电位、ε、E成正比，而 与介质的粘度η成反比。 • 与HPLC柱不同，毛细管中的电渗流呈平面 流型，它不存在径向梯度。
二、毛细管电泳的分离模式
• • • • • • • • • 毛细管区带电泳(CZE) 胶束电动毛细管电泳(MECC) 毛细管凝胶电泳(CGE) 毛细管等电聚焦(CIEF) 毛细管等速电泳(CITP) 毛细管离子电泳(CIE) 毛细管电色谱 毛细管阵列电泳 亲和毛细管电泳
第三节 毛细管电泳装置
• 直流高压电源、毛细管、进样装置、检测 器和记录仪等
• 电解质区带的移动速度(Vi)等于电解质区带 的电泳迁移速度(Ve)与溶剂流速度(Veo)之 和。 Vi = Ve + Veo
• 当把样品从阳极端注入毛细管时，假设A物质为 负离子，B物质为正离子，则带不同电荷的离子 将按下面的速度迁移到阴极，到时间t时，A、B 物质已经分离了。 • 正离子：νt =νeo + ν+ • 中性分子：νt = νeo • 负离子：νt =νeo - νˉ
N
2 Dt

2D
L
2D

l L
（Giddings的色谱柱效理论，Einstein扩散定律）
提高分离电压是增加分离效率的主要途径，在相 同的操作电压下，l/L =1，分离效率最高。此外， N与溶质的扩散系数D成反比，所以用毛细管电泳 分离大分子时，可得到高的柱效。
• 毛细管电泳的分辨率 （Giddings ）
1.带电分子的本质
• 微粒的净电荷、大小、形状和相对质量对 它们的电泳淌度有相当大的影响。 • 分子的带电量与大小的比例是一个重要的 参数。 • 电量与大小的比例（e/r）越大，分子在给 定条件下，迁移得越快。
2.电泳系统的性质
• 电泳缓冲液的离子构成、温度、电泳缓冲 液的pH值、操作电压、载体介质的选择
20世纪70年代在HPLC的推动下，电泳分离技术成 为了一种“灰姑娘”式的技术 。 1981年，Jorgenson等[1]介绍了毛细管区带电泳 技术。 • 1984年Terabe等提出的胶束电动毛细管色谱。 • 1987年，Hjerten建立了毛细管等电聚焦。 • 1987年，由Chohen等提出了毛细管凝胶电泳。 • 1991年，Monnig等[2]首次提出了高速毛细管电 泳。 • 目前，毛细管电泳已广泛应用于氨基酸、肽、蛋 白质和核酸等离子型生物大分子的分离分析，加 入表面活性剂还可以扩大到中性粒子，甚至应用 到细胞和病毒等的分离。同时，在小分子化合物 的分离分析方面也取得了重大进展。
• 电渗(Electro osmosis)是驱动电解质运动 的第二种作用力，它使毛细管中的溶剂在 直流电场作用下发生定向运动。
电渗流的产生
• 毛细管内壁表面上的硅醇基在pH>3的水溶液中，可电离 而产生SiO-负离子，使毛细管内壁带上负电荷，因此，溶 液中的一部分正离子(如H+离子)就靠静电作用而吸附于毛 细管内壁上，形成一个双电层(Electric double layer)。 其中一层是带负电的内壁，一层是带正电的溶液离子吸附 层。但溶液中的其余大部分正离子则是离内壁越远，越呈 自由状态，于是在吸附层之外又存在着一个扩散层 。
1.电解效应及缓冲溶液的选择
• 在毛细管电泳中，阳、阴两极最有可能发生的电 极反应，其结果是阳极端因OH-被消耗而H+量相 对增加，阴极端则因消耗H+而使OH-量相对增加。 两极溶液的pH差距变大 • 电渗流则受溶液的pH影响很大。 • 所以，选择具有pH缓冲能力的溶液为分离介质 • 当缓冲液浓度(或离子强度)增加时，双电层的厚 度降低，Zeta电位减小，溶液的粘度增大，电渗 流速度将减小。减小电渗流会增加分辨率。过高 浓度的电解质容易导致溶液过热，会引起电泳区 带展宽，使分辨率降低。 （适度的浓度） • 所用缓冲溶液的种类也会影响电渗流 （磷酸盐溶 液）
第二节 毛细管电泳基本原理
• 一、毛细管电泳的理论基础 • 在毛细管电泳中带电粒子所受的驱动力： 电泳力和电渗力。 • 电泳和电渗是毛细管电泳分离理论中最基 本的概念。
（一）电泳和电渗
• 电泳(Electrophoresis)是指溶液中带电粒子(离子、 胶团)在电场中定向移动的现象。 • 电泳是驱动电解质运动的第一种动力，如此形成 的粒子移动简称为泳流 • 电泳迁移速度ve : ve= μeE = μeV/L • μe:电泳迁移率(电泳淌度); E:电场强度; V－毛细 管柱两端施加的电压；L－毛细管柱的长度。 • 被分离组分在毛细管中的运行时间t （p86有误）
• 如果溶质纵向扩散是区带展宽的唯一因素， 对于CE来说，可以通过增大分离电压和缩 短毛细管长度来提高速度，同时兼顾分离 效率
N t mig

2 app
2D

V 2 L

tmig －组分的迁移时间, μapp－表观电泳迁移率；N －理论塔板数；D－溶质的扩散系数
• 在任何给定的时间内要获得最高的理论塔 板数，分离电压与毛细管长度的比例应该 最大，也就是说在只考虑溶质纵向扩散的 前提下，采用尽可能高的分离电压和短的 毛细管，可以实现高柱效和快速分离。高 的电渗流同样可以提高分析速度和柱效。
（1）电泳缓冲液的离子构成
• 由于带电分子表面的可电离层和电泳缓冲 液中离子间的相互作用，一个带电分子被 反电荷的离子团所包围。结果，它的净电 荷和电泳淌度都下降了。 • 选择一个合适的盐浓度显得很必要。
（2）温度
• 温度对电泳有显著的影响。 • 在一个电泳泳动期间，热量（焦耳热）会产生并 且在很多途径上影响着电泳扩散。 • 温度增加引起带电分子迁移带的扩散增加，如果 电泳持续时间长（数小时）扩散作用变得更显著。 • 温度引起蒸发作用 • 温度引起对流现象 • 为一次电泳泳动选择一个最佳温度并在整个分析 过程中都维持着是必要的。
一、毛细管电泳的进样技术
• • • • • • （一）直接在线进样 （二）近端进样及双向进样 （三）流动注射与毛细管电泳联用(FI-CE) （四）液相色谱与毛细管电泳联用 （五）光学门进样 （六）流动门进样
光学门进样装置示意图
流动门进样装置示意图
二、毛细管电泳检测器
第三章 毛细管电泳分离技术
第一节 概
述
• 电泳是基于两种或多种带电粒子或微粒， 它们所在的介质受到外加直流电场的作用 下，其迁移速率不同而得到分离的一类方 法。（electrophoresis ）
发展历程
• 1807年，Ferdinand Frederic Reuss就观察到了 荷电物质在电场力作用下会发生运动的现象。 • 1909年，由Michaelis对此现象的描述中提出电 泳这个术语(elektron和pbore,分别代表电和搬运 者的意思 ) • 1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两 段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电 泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出 白蛋白和α 、β 、γ 球蛋白，电泳技术才得到有 实际意义的发展，Tiseluis也因此获得了1948年 度的诺贝尔奖。 • 到20世纪50年代，电泳已经是一种与纸和薄层的 平面色谱技术一样的实验室常用技术。
（4）操作电压
• 一个分子的迁移速率和媒介两边的场强是 成比例的。 • 但是，随着电压的增大对流也上升，导致 更强大功率的产生（功率以对流平方的方 式增加），这样一些功率以热量形式消散。 • 电压（或对流）应该要足够大以允许带电 分子的快速迁移，但也不能太大以产生过 量的热。
（5）载体介质
• • • • 选择最合适的载体介质以下面几点为依据： 样品质量 分子的大小 如果不得不使用筛分凝胶时，它的毛孔大小 （集中性）也应该要选择以适合所研究的分 子大小、分析所需时间。
影响柱效的因素
• 实际上，分离电压增大和毛细管长度缩短 时，除了扩散外，还有诸多因素影响柱效， 其中最严重的是温度效应，即毛细管的焦 耳热问题
• • • •
毛细管在高电压场下产生的焦耳热G G=κ·(V/L)2·πr2 κ－电导率； r－毛细管内径 焦耳热随着分离电压增大和毛细管的缩短而增大。 焦耳热过大会造成峰扩展、变形。 • 补救措施： • 采用小内径毛细管可以降低焦耳热。 • 采用低电导率的缓冲溶液。如具有高的相对分子 质量、小电荷的溶液或窄pH范围的两性电解质。
注：电渗流的速度 为泳流的若干倍
电渗流的速度为泳流的若干倍，且受pH等条件的 影响很大，在分离过程中很容易发生变化，因而 必须加以控制，使其在一定范围内保持恒定。
• 抑制毛细管中电渗流的办法： • 消除固液界面间的ζ电位或提高溶液的粘度； • 在毛细管的内壁涂上聚合物，如聚丙烯酰 胺涂层。
(二)分离速率
• 高压电源可对毛细管施加5~50 kV电压，操作电 压一般控制在5~30 kV范围。 • CE通常使用内径10~100 μm、长12~120 cm (内 涂聚酰亚胺) 弹性融凝石英毛细管，毛细管的两 端分别浸泡在含有缓冲溶液的贮液槽中，毛细管 内也充满同样的缓冲溶液。 • 被分离试样可以采用重力法、抽真空法或电迁移 法等多种进样方式由毛细管一端进入。