第三章 毛细管电泳分离技术-2015
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毛细管电泳原理
01
02
03
蛋白质分离
毛细管电泳可以用于分离 蛋白质，如血红蛋白、免 疫球蛋白等，有助于研究 蛋白质结构和功能。
DNA分析
毛细管电泳可用于DNA片 段的分离和检测，如基因 突变、DNA序列分析等， 有助于遗传学研究和诊断。
药物筛选
毛细管电泳可用于药物筛 选，如新药开发、药物代 谢产物分析等，有助于药 物设计和优化。
电解质浓度。
电极材料与处理
电极材料
毛细管电泳中的电极通常由不锈钢、 金或铂金制成。不同材料对电解质的 响应不同，因此需要根据实验需求选 择适当的电极材料。
电极处理
电极在使用前需要进行适当的处理， 如抛光、清洗和镀膜等。这些处理步 骤可以确保电极表面的光洁度和活性 ，从而提高实验的准确性和稳定性。
检测方法与仪器
在环境监测领域的应用
污染物分析
毛细管电泳可以用于分析水、土 壤、空气中的污染物，如重金属、
农药残留等，有助于环境监测和 保护。
有机物分离
毛细管电泳可用于分离有机化合物， 如多环芳烃、酚类物质等，有助于 了解有机污染物的来源和分布。
放射性同位素分析
毛细管电泳可用于放射性同位素的 分析，如铀、钚等，有助于核工业 和核废料处理的安全管理。
微流控芯片毛细管电泳
总结词
微流控芯片毛细管电泳是一种将微流控 技术与毛细管电泳相结合的技术，利用 微通道网络进行高效、快速的分离分析 。
VS
详细描述
微流控芯片毛细管电泳的原理基于微流体 力学和电泳分离原理，通过在芯片上集成 微通道网络，实现样品在微通道内的快速 混合、分离和检测。该技术具有高效、快 速、高灵敏度等优点。
检测方法
毛细管电泳实验中，常用的检测方法 包括紫外-可见光谱法、荧光光谱法、 电化学法和质谱法等。这些方法可以 根据实验需求选择，以获得最佳的检 测效果。
毛细管电泳分离技术
根据比耳定律，光度测量值A与吸收光呈成正比。
一般检测中，检测最大光程是用毛细管内径，而毛
细管内径增大受焦耳热影响的制约，因此采用细内
径毛细管柱时，测量灵敏度受到限制。
三、毛细管电泳的分离模式
毛细管区带电泳(CZE) 胶束电动毛细管电泳(MECC) 毛细管凝胶电泳(CGE)
毛细管等电聚焦(CIEF)
毛细管电泳装置
直流高压电源、毛细管、进样装置、检测
器和记录仪等
高压电源可对毛细管施加5~50 kV电压，操作电 压一般控制在5~30 kV范围。
CE通常使用内径10~100 μm、长12~120 cm (内 涂聚酰亚胺) 弹性融凝石英毛细管，毛细管的两 端分别浸泡在含有缓冲溶液的贮液槽中，毛细管 内也充满同样的缓冲溶液。
毛细管电泳分离技术
姓名：饶海英 学号：20114209033
毛细管电泳分离技术
概述
毛细管电泳基本原理 毛细管电泳的分离模式 影响毛细管电泳分离效率的因素 毛细管电泳技术的应用 21世纪毛细管电泳发展趋势
一、概
述
毛细管电泳（capillaryelectrophoresis， CE），又称高效毛细管电泳（HPCE）是 近年来发展最快的分析化学研究领域之一。 是基于两种或多种带电粒子或微粒，它们所 在的介质受到外加直流电场的作用下，其迁 移速率不同而得到分离的一类方法。
二、毛细管电泳基本原理
CE是以高压电场为驱动力。以毛细管为分离通 道，依据样品中各组成之间淌度和分配行为上的差 异，而实现分离的一类液相分离技术。 仪器装置包括高压电源、毛细管、柱上检测器 和供毛细管两端插入又和电源相连的两个缓冲液贮 瓶，在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以 不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象称电 泳。
毛细管电泳法
原理
在毛细管中施加电场，带电粒子在电场的作用下产生迁移，由于迁移速度与粒 子所带电荷、半径、质量等因素有关，因此不同粒子在电场中产生不同的迁移 速度，从而实现分离。
发展历程
01
02
03
1980年代初期
毛细管电泳法由 Jorgenson和Lukacs首次 提出并实验验证。
1980年代中期
该技术逐渐成熟，被广泛 应用于生物、医药、环境 等领域。
饮用水安全
毛细管电泳法能够检测饮用水中 的消毒副产物、有机污染物等， 保障饮用水安全。
在食品检测领域的应用
食品添加剂分析
毛细管电泳法能够分离和检测食品中 的添加剂，如色素、防腐剂等，有助 于食品安全监管。
营养成分分析
毛细管电泳法能够快速分析食品中的 营养成分，如氨基酸、维生素等，有 助于食品质量控制和营养评价。
核酸分析
毛细管电泳法能够分离和检测核酸片段，用于基 因诊断、基因表达研究和法医学鉴定。
3
临床检验
毛细管电泳法可用于检测体液中的小分子代谢物， 如氨基酸、糖类等，辅助临床诊断。
在环境监测领域的应用
污染物分析
毛细管电泳法能够分离和检测水 体、土壤中的有害物质，如重金 属、农药残留等，有助于环境监 测和污染治理。
在化学分析领域的应用
有机物分析
毛细管电泳法能够分离和检测有机化合物，如药物、染料等 ，在药物研发、化工生产等领域有广泛应用。
金属离子分析
毛细管电泳法能够高灵敏度地检测金属离子，如铅、汞、镉 等，可用于地质、冶金和环境等领域的研究。
谢谢
THANKS
加样
将处理好的样品加入毛 细管中，注意控制加样
量。
施加电压
启动电源，施加适当的 电压，使带电粒子在电
在毛细管中施加电场，带电粒子在电场的作用下产生迁移，由于迁移速度与粒 子所带电荷、半径、质量等因素有关，因此不同粒子在电场中产生不同的迁移 速度，从而实现分离。
发展历程
01
02
03
1980年代初期
毛细管电泳法由 Jorgenson和Lukacs首次 提出并实验验证。
1980年代中期
该技术逐渐成熟，被广泛 应用于生物、医药、环境 等领域。
饮用水安全
毛细管电泳法能够检测饮用水中 的消毒副产物、有机污染物等， 保障饮用水安全。
在食品检测领域的应用
食品添加剂分析
毛细管电泳法能够分离和检测食品中 的添加剂，如色素、防腐剂等，有助 于食品安全监管。
营养成分分析
毛细管电泳法能够快速分析食品中的 营养成分，如氨基酸、维生素等，有 助于食品质量控制和营养评价。
核酸分析
毛细管电泳法能够分离和检测核酸片段，用于基 因诊断、基因表达研究和法医学鉴定。
3
临床检验
毛细管电泳法可用于检测体液中的小分子代谢物， 如氨基酸、糖类等，辅助临床诊断。
在环境监测领域的应用
污染物分析
毛细管电泳法能够分离和检测水 体、土壤中的有害物质，如重金 属、农药残留等，有助于环境监 测和污染治理。
在化学分析领域的应用
有机物分析
毛细管电泳法能够分离和检测有机化合物，如药物、染料等 ，在药物研发、化工生产等领域有广泛应用。
金属离子分析
毛细管电泳法能够高灵敏度地检测金属离子，如铅、汞、镉 等，可用于地质、冶金和环境等领域的研究。
谢谢
THANKS
加样
将处理好的样品加入毛 细管中，注意控制加样
量。
施加电压
启动电源，施加适当的 电压，使带电粒子在电
毛细管区带电泳
毛细管区带电泳（CZE）分离硝基苯酚异构体一、实验背景毛细管电泳、气相色谱、液相色谱是目前应用最广泛的高效分离技术，与气相色谱、液相色谱相比，毛细管电泳具有许多独特的优点，如分析速度快、柱效可高达数十万塔板/米、适用于带电样品的分离等，另外毛细管电泳具有样品消耗少、实验试剂成本低等优点，已广泛应用于生物、医药等领域的分离检测。
毛细管电泳技术是现代分离科学中必不可少的重要内容。
二、实验目的1．了解CZE分离的基本原理。
2．了解毛细管电泳仪的基本构造，掌握其基本操作技术。
3．学会计算CZE的重要参数。
4．运用CZE分离硝基苯酚异构体。
三、实验原理毛细管电泳是指以毛细管为通道、以高压直流电场为驱动力的一类液相分离分析技术。
毛细管区带电泳是最常用的一种毛细管电泳分离模式，它是根据被分离物质在毛细管中的迁移速度不同进行分离。
毛细管电泳分离分析装置如图1所示。
被分离物质在毛细管中的迁移速度决定于电渗淌度和该物质自身的电泳淌度。
一定介质中的带电离子在直流电场作用下的定向运动称为电泳。
单位电场下的电泳速度称为电泳淌度或电泳迁移率。
电泳速度的大小与电场强度、介质特性、离子的有效电荷及其大小和形状有关。
电渗是伴随电泳而产生的一种电动现象。
就毛细管区带电泳而言，电渗是指毛细管中电解质溶液在外加直流电场作用下的整体定向移动。
电渗起因于固液界面形成的双电层。
用熔融石英拉制成的毛细管，其内壁表面存在弱酸性的硅羟基，当毛细管中存在一定pH值的缓冲液时，硅羟基发生电离，在毛细管内壁形成带负电荷的“定域电荷”。
根据电中性的要求，“定域电荷”吸引缓冲液中的反号离子（阳离子）形成双电层。
在直流电场作用下双电层中的水合阳离子向负极迁移，并通过碰撞等作用给溶剂施加单向推力，使之通向运动，形成电渗。
单位电场下的电渗速度称为电渗淌度。
电渗速度与毛细管中电解质溶液的介电常数和粘度、双电层的 电势以及外加直流电场强度有关。
若同时含有阳离子、阴离子和中性分子的样品溶液在正极端引入毛细管后，在外加直流电场的作用下，样品组分在毛细管中的迁移情况如图2所示。
毛细管电泳分离技术
3、毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis ，CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用， 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分 离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模 蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模 等的电荷 式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DNA排序的重要手段。 式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DNA排序的重要手段。 CGE能获得良好分离 排序的重要手段 特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。 特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。
1、毛细管区带电泳 capillary zone electrophoresis ，CZE
样品在电解液中泳动,根据物质的荷/质比差异来进行分离,比值愈大, 样品在电解液中泳动,根据物质的荷/质比差异来进行分离,比值愈大, 跑得愈快. 跑得愈快. 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。
2、 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC） micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC 1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂， 1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界 缓冲溶液中加入离子型表面活性剂 浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。 浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。 在电场力的作 用下， 用下，胶束在柱中 移动。 移动。
2.药物分析 2.药物分析
检测体液或细胞中某 些代谢产物的分析； 些代谢产物的分析； 尿液中的氨基酸含量 作为临床诊断糖尿病的辅 助手段； 助手段； 采用毛细管区带电泳 方式， 11min内分离17 min内分离17种 方式，在11min内分离17种 药物； 药物；
毛细管电泳技术及应用
蛋白质分离
毛细管电泳技术能够高效分离蛋白质 ，包括白蛋白、球蛋白、酶等，为生 物制药、蛋白质组学等领域提供有力 支持。
DNA和RNA分析
毛细管电泳可用于分析DNA和RNA片 段，在基因诊断、基因工程和生物信 息学等领域有广泛应用。
药物分析
药物成分分离
毛细管电泳能够分离和检测药物中的有效成分和杂质，有助于药物质量控制和研发。
仪器设备与操作
仪器设备
包括高压电源、进样系统、毛细管、检测器和数据采集系统等部分。
操作步骤
首先将样品注入毛细管一端，然后施加电压使带电粒子在电场中移动，同时通 过检测器对分离出的粒子进行检测，最后通过数据采集系统记录数据并进行分 析。
02
毛细管电泳的分离模式
区带电泳
总结词
区带电泳是毛细管电泳中最简单的一种形式，其原理是将样 品加在毛细管的一端，然后施加电压，使样品在电场的作用 下进行分离。
详细描述
在区带电泳中，样品在毛细管中形成一色带，由于不同组分 在电场中的迁移率不同，因此会以不同的速度向另一端移动 ，从而实现分离。这种分离模式适用于简单样品，如氨基酸 、肽和蛋白质等。
胶束电动色谱
总结词
胶束电动色谱是在毛细管电泳中加入一种称为表面活性剂的物质，使溶液的离子 强度和粘度发生变化，从而影响离子的迁移率。
要点二
血液中成分分析
通过毛细管电泳技术，可以分析血液中的离子、小分子和 蛋白质等成分，为临床诊断和治疗提供依据。
04
毛细管电泳技术的优缺点
优点
高分离效率
毛细管电泳技术利用电场对带电粒子的作用力，使其在毛 细管中分离，具有极高的分离效率，特别适合于复杂样品 的分离。
高灵敏度
毛细管电泳技术结合了多种检测手段，如紫外-可见光谱 、荧光光谱等，可以实现高灵敏度的检测，有利于痕量物 质的检测。
毛细管电泳技术能够高效分离蛋白质 ，包括白蛋白、球蛋白、酶等，为生 物制药、蛋白质组学等领域提供有力 支持。
DNA和RNA分析
毛细管电泳可用于分析DNA和RNA片 段，在基因诊断、基因工程和生物信 息学等领域有广泛应用。
药物分析
药物成分分离
毛细管电泳能够分离和检测药物中的有效成分和杂质，有助于药物质量控制和研发。
仪器设备与操作
仪器设备
包括高压电源、进样系统、毛细管、检测器和数据采集系统等部分。
操作步骤
首先将样品注入毛细管一端，然后施加电压使带电粒子在电场中移动，同时通 过检测器对分离出的粒子进行检测，最后通过数据采集系统记录数据并进行分 析。
02
毛细管电泳的分离模式
区带电泳
总结词
区带电泳是毛细管电泳中最简单的一种形式，其原理是将样 品加在毛细管的一端，然后施加电压，使样品在电场的作用 下进行分离。
详细描述
在区带电泳中，样品在毛细管中形成一色带，由于不同组分 在电场中的迁移率不同，因此会以不同的速度向另一端移动 ，从而实现分离。这种分离模式适用于简单样品，如氨基酸 、肽和蛋白质等。
胶束电动色谱
总结词
胶束电动色谱是在毛细管电泳中加入一种称为表面活性剂的物质，使溶液的离子 强度和粘度发生变化，从而影响离子的迁移率。
要点二
血液中成分分析
通过毛细管电泳技术，可以分析血液中的离子、小分子和 蛋白质等成分，为临床诊断和治疗提供依据。
04
毛细管电泳技术的优缺点
优点
高分离效率
毛细管电泳技术利用电场对带电粒子的作用力，使其在毛 细管中分离，具有极高的分离效率，特别适合于复杂样品 的分离。
高灵敏度
毛细管电泳技术结合了多种检测手段，如紫外-可见光谱 、荧光光谱等，可以实现高灵敏度的检测，有利于痕量物 质的检测。
毛细管电泳法的特点和CE-MS的构造
自动化与智能化
通过自动化和智能化技术，实现CE-MS的 远程控制和实时监测，提高分析效率。
解决实际应用中的问题
样品处理
优化样品处理方法，减少基质干扰，提高分析准确度。
交叉污染
采取有效措施减少交叉污染，如定期清洗、更换分离介质等，确保分析结果的可靠性。
谢谢
Байду номын сангаасTHANKS
03 CE-MS的构造
CHAPTER
毛细管电泳仪
高效分离
毛细管电泳仪利用电场对 带电粒子的作用力，实现 高效分离不同成分的物质。
微量进样
毛细管电泳仪采用微米级 的进样体积，可减少样品 消耗，降低实验成本。
高灵敏度
毛细管电泳技术结合激光 诱导荧光检测等高灵敏度 检测方法，可实现对痕量 物质的检测。
质谱仪
分子结构分析
质谱仪通过测量分子在电场和磁 场中的行为，确定分子的质量和
结构信息。
高选择性
质谱技术可对复杂混合物中的目标 分子进行高选择性检测，排除干扰 物质。
定量分析
质谱技术可实现目标分子的定量分 析，提供准确的物质浓度信息。
接口设计
高效传输
接口设计的主要目标是实现毛细管电 泳分离后的样品溶液高效传输至质谱 仪。
原理
在毛细管中施加电场，带电粒子在电 场作用下产生迁移，根据其在电场中 的迁移速度差异实现分离。
发展历程
1980年代初期
毛细管电泳技术开始发展，研究者发 现使用毛细管可以产生电渗流，为电 泳提供驱动力。
1980年代中期
成功分离氨基酸和多肽，奠定了毛细 管电泳在生物分析领域的应用基础。
1990年代
毛细管电泳技术得到广泛应用，涉及 蛋白质、DNA、糖类等多种生物分 子的分离分析。
毛细管电泳法
电极槽和毛细管内的溶液为缓冲液，可以加入有机溶剂作为改性剂，以及加入表面活性剂，称作运行缓冲液。 运行缓冲液使用前应脱气。电泳谱中各成分的出峰时间称迁移时间。胶束电动毛细管色谱中的胶束相当于液相色 谱的固定相，但它在毛细管内随电渗流迁移，故容量因子为无穷大的成分最终也随胶束流出。其他各种参数都与 液相色谱所用的相同。
此外，还有一类基于芯片的二维分离系统主要应用于蛋白质酶解物的分离分析。
除上述分离模式外，芯片自由流电泳也是芯片电泳分离蛋白质的重要方法。芯片自由流电泳是指在芯片中通 过外加电场使样品随缓冲液连续流动的同时沿电场方向进行电迁移，从而按照电泳淌度不同实现分离的电泳分离 模式。Raymond等采用芯片自由流电泳模式分离了人血清蛋白、缓激肽和核糖核酸酶A，其分离长度为3.1 cm，流 出时间为62 S。Kobayashi等采用自由流电泳的分离模式在一个体积为56.5 mm×35 mm×30 mm的微分离室 (60uL)中实现了持续的蛋白质分离，并用羟丙基甲基纤维素涂覆来抑制蛋白质吸附，在25 min内有效分离了细胞 色素C和肌红蛋白。最近，Kohl．heyer等H 3。制作了一种自由流等电聚焦分离蛋白质的玻璃芯片，成功地将人 血清白蛋白(pI=4.4)与等电聚焦标记物(pH 3和9)分离。
仪器要求
所用的仪器为毛细管电泳仪。正文中凡采用毛细管电泳法测定的品种，其所规定的测定参数，除分析模式、 检测方法(如紫外光吸收或荧光检测器的波长、电化学检测器的外加电位等)应按照该品种项下的规定外，其他参 数如毛细管内径、长度、缓冲液的pH值、浓度、改性剂添加量、运行电压或电流的大小、运行的时间长短、毛细 管的温度等，均可参考该品种项下规定的数据，根据所用仪器的条件和预试验的结果，进行必要的调整。
检测方法
毛细管电泳通常用到的检测方法有吸收光谱，荧光光谱，热镜，拉曼光谱，质谱和电化学方法。
此外，还有一类基于芯片的二维分离系统主要应用于蛋白质酶解物的分离分析。
除上述分离模式外，芯片自由流电泳也是芯片电泳分离蛋白质的重要方法。芯片自由流电泳是指在芯片中通 过外加电场使样品随缓冲液连续流动的同时沿电场方向进行电迁移，从而按照电泳淌度不同实现分离的电泳分离 模式。Raymond等采用芯片自由流电泳模式分离了人血清蛋白、缓激肽和核糖核酸酶A，其分离长度为3.1 cm，流 出时间为62 S。Kobayashi等采用自由流电泳的分离模式在一个体积为56.5 mm×35 mm×30 mm的微分离室 (60uL)中实现了持续的蛋白质分离，并用羟丙基甲基纤维素涂覆来抑制蛋白质吸附，在25 min内有效分离了细胞 色素C和肌红蛋白。最近，Kohl．heyer等H 3。制作了一种自由流等电聚焦分离蛋白质的玻璃芯片，成功地将人 血清白蛋白(pI=4.4)与等电聚焦标记物(pH 3和9)分离。
仪器要求
所用的仪器为毛细管电泳仪。正文中凡采用毛细管电泳法测定的品种，其所规定的测定参数，除分析模式、 检测方法(如紫外光吸收或荧光检测器的波长、电化学检测器的外加电位等)应按照该品种项下的规定外，其他参 数如毛细管内径、长度、缓冲液的pH值、浓度、改性剂添加量、运行电压或电流的大小、运行的时间长短、毛细 管的温度等，均可参考该品种项下规定的数据，根据所用仪器的条件和预试验的结果，进行必要的调整。
检测方法
毛细管电泳通常用到的检测方法有吸收光谱，荧光光谱，热镜，拉曼光谱，质谱和电化学方法。
毛细管电泳原理及分析策略
--MicroScale Bioseparations 2006
第六章 检测器选择
• 小分子检测 • 大分子检测
9
CE检测器种类及性能
• 检测系统
HPCE的种类及性能
检测方式 紫外-可见光吸收
质量检测限(mol) 10-13～10-16
浓度检测限(M)* 10-5～10-8
荧光
10-15～10-17
• 电渗流的波动极大的影 响了迁移时间的重复性
影响电渗流的因素
• pH值 pH越高，电渗流越大
• 离子强度 离子强度越高，电渗流越小
• 缓冲溶液添加剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精
控制电渗流的三个重要手段
1. 采用涂层毛细管，消除电渗流的影响 2. 改变pH，从而调整电渗流的大小。pH<3时电
第一步，尽可能多地了解分离样品的类型、来源、组成 及其性质；
第二步，根据样品的可能性质和来源，选择分离模式， 若无样品信息可先选CZE；
10
条件选择流程
第三步，根据样品性质确定检测方法，一般先选直接 紫外吸收；
第四步，确定样品处理方式，包括衍生方案以及离心 过滤除蛋白等；
第 五 步 ， 根 据 样 品 解 离 常 数 计 算 最 佳 pH ， 或 利 用 75µmID毛细管和磷酸缓冲体系确定pH范围;
电流。 那些被称为生物“优良缓冲液”的，如Tris, borate, CAPS 等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大， 能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个 潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。
3
常用的CE缓冲体系
• 磷酸钠体系 宽缓冲范围 • 硼酸钠体系 高pH范围 • Tris-HCl体系 低pH范围 • 醋酸-醋酸铵体系 CE/MS常用体系
第六章 检测器选择
• 小分子检测 • 大分子检测
9
CE检测器种类及性能
• 检测系统
HPCE的种类及性能
检测方式 紫外-可见光吸收
质量检测限(mol) 10-13～10-16
浓度检测限(M)* 10-5～10-8
荧光
10-15～10-17
• 电渗流的波动极大的影 响了迁移时间的重复性
影响电渗流的因素
• pH值 pH越高，电渗流越大
• 离子强度 离子强度越高，电渗流越小
• 缓冲溶液添加剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精
控制电渗流的三个重要手段
1. 采用涂层毛细管，消除电渗流的影响 2. 改变pH，从而调整电渗流的大小。pH<3时电
第一步，尽可能多地了解分离样品的类型、来源、组成 及其性质；
第二步，根据样品的可能性质和来源，选择分离模式， 若无样品信息可先选CZE；
10
条件选择流程
第三步，根据样品性质确定检测方法，一般先选直接 紫外吸收；
第四步，确定样品处理方式，包括衍生方案以及离心 过滤除蛋白等；
第 五 步 ， 根 据 样 品 解 离 常 数 计 算 最 佳 pH ， 或 利 用 75µmID毛细管和磷酸缓冲体系确定pH范围;
电流。 那些被称为生物“优良缓冲液”的，如Tris, borate, CAPS 等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大， 能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个 潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。
3
常用的CE缓冲体系
• 磷酸钠体系 宽缓冲范围 • 硼酸钠体系 高pH范围 • Tris-HCl体系 低pH范围 • 醋酸-醋酸铵体系 CE/MS常用体系
毛细管电泳
带电粒子在直流电场作用下于一定介质（溶剂）中所发生的定向运动称为电泳。单位电场下的电泳速度称为 淌度。在无限稀释溶液中（稀溶液数据外推）测得的淌度称为绝对淌度。
电场中带电离子运动除了受到电场力的作用外，还会受到溶剂阻力的作用。一定时间后，两种力的作用就会 达到平衡，此时离子作匀速运动，电泳进入稳态。实际溶液的活度不同，特别是酸碱度的不同，所以样品分子的 离解度不同，电荷也将发生变化，这时的淌度可称为有效电泳淌度。一般来说，离子所带电荷越多、离解度越大、 体积越小，电泳速度就越快。
基础理论
Zeta电势
双电层
淌度
双电层是指两相之间的分离表面由相对固定和游离的两部分离子组成的。
双电层是与表面异号的离子层，凡是浸没在液体中的界面都会产生双电层。在毛细管电泳中，无论是带电粒 子的表面还是毛细管管壁的表面都有双电层。
电介质溶液中，任何带电粒子都可被看成是一个双电层系统的一部分，离子自身的电荷被异号的带电离子中 和，这些异号离子中有一些被不可逆的吸附到离子上，而另一些则游离在附近，并扩散到电介质中进行离子交换。 “固定”离子有一个切平面，它和离得最近的离子之间的电势则被称之为离子的Zeta电势。
电渗、电渗流和表观淌度电渗是推动样品迁移的另一种重要动力。所谓电渗是指毛细管中的溶剂因轴向直流 电场作用而发生的定向流动。电渗是由定域电荷引起。定域电荷是指牢固结合在管壁上、在电场作用下不能迁移 的离子或带电基团。在定域电荷吸引溶液中的反号离子并与其构成的双电层，致使溶剂在电场作用（以及碰撞作 用）下整体定向移动而形成电渗流（毛细管中的电渗流为平头塞状）。
毛细管电泳仪度随pH的升高而升高，电渗流也随之升高。因此，pH为分离条件优化时不可忽视的因素。
在CE中，分离电压也是控制电渗的一个重要参数。高电压是实现CE快速、高效的前提，电压升高，样品的迁 移加大，分析时间缩短，但毛细管中焦耳热增大，基线稳定性降低，灵敏度降低；分离电压越低，分离效果越好， 分析时间延长，峰形变宽，导致分离效率降低。因此，相对较高的分离电压会提高分离度和缩短分析时间，但电 压过高又会使谱带变宽而降低分离效率。电解质浓度相同时，非水介质中的电流值和焦耳热均比水相介质中小得 多，因而在非水介质中允许使用更高的分离电压。
分析化学 毛细管电泳法
第十九章：
毛细管电泳法
Capillary Electrophoresis
概述
电泳: 电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用
下，发生差速迁移，可实现分离。
毛细管电泳
经典电泳法散热差，难以克服高电压引起的焦耳热，限
制了高电压的使用，分离电压受到限制。 乔更森和鲁卡斯采用75μm内径的石英毛细管做为分离室， 紫外柱上检测的方法，在30kv的分离电压下分离丹酰化氨基 酸，柱效达到40万个理论塔板。
课后习题： P427：3，4
的溶液整体向负极移动，形成电渗流（EOF）。
1.2 毛细管电泳原理
电渗速度uos以下式表示：
os uos os E E 4 os ：电渗率或电渗淌度 os ：管壁的Zeta电势 ：介质介电常数 ：介质黏度
E ：电场强度
1.3 CE中电渗流的方向
电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：
Qin c0 π r (eff +os )Et
2
电场：1-10kv 时间：1-10s 特别适合黏度大的试样。
存在的问题：
进样不均：淌度大的离子比淌度小的进样量大。 离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去。 偏向性，准确性可靠性差，重现性差
2.3.3 扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。
由于电渗流速度大大高于电泳 速度，一般为电泳的5-7倍，所 以，不管正离子、负离子还是 中性分子，均随电渗流移动。
第二节、毛细管电泳仪
结构与流程
主要由高压电源、缓冲液及进样系统、毛细管柱、检测 器及数据处理等五部分组成 。
2.1 高压电源
（1）0～30 kV 稳定、连续可调的直流电源；
（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；
毛细管电泳法
Capillary Electrophoresis
概述
电泳: 电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用
下，发生差速迁移，可实现分离。
毛细管电泳
经典电泳法散热差，难以克服高电压引起的焦耳热，限
制了高电压的使用，分离电压受到限制。 乔更森和鲁卡斯采用75μm内径的石英毛细管做为分离室， 紫外柱上检测的方法，在30kv的分离电压下分离丹酰化氨基 酸，柱效达到40万个理论塔板。
课后习题： P427：3，4
的溶液整体向负极移动，形成电渗流（EOF）。
1.2 毛细管电泳原理
电渗速度uos以下式表示：
os uos os E E 4 os ：电渗率或电渗淌度 os ：管壁的Zeta电势 ：介质介电常数 ：介质黏度
E ：电场强度
1.3 CE中电渗流的方向
电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：
Qin c0 π r (eff +os )Et
2
电场：1-10kv 时间：1-10s 特别适合黏度大的试样。
存在的问题：
进样不均：淌度大的离子比淌度小的进样量大。 离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去。 偏向性，准确性可靠性差，重现性差
2.3.3 扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。
由于电渗流速度大大高于电泳 速度，一般为电泳的5-7倍，所 以，不管正离子、负离子还是 中性分子，均随电渗流移动。
第二节、毛细管电泳仪
结构与流程
主要由高压电源、缓冲液及进样系统、毛细管柱、检测 器及数据处理等五部分组成 。
2.1 高压电源
（1）0～30 kV 稳定、连续可调的直流电源；
（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；
第三章毛细管电泳法高等教育
特选课件
34
一、毛细管区带电泳
（Capillary zone electrophoresis , CZE）
带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；
阴离子：两种效应的运动方向相 反；ν电渗流 >ν电泳时,阴离子在负极最 后流出,在这种情况下,不但可以按类 分离,同种类离子由于差速迁移被相 互分离。
特选课件
29
特选课件
30
3.缓冲液池
化学惰性，机械稳定性好；
4.检测器
要求：具有极高灵敏度，可柱端检测； 检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；
类型
检测限/mol
特点
紫外-可见 10-13～10-15 加二极管阵列，光谱信息
荧光
10-15～10-17 灵敏度高，样品需衍生
激光诱导荧光 10-18～10-20 灵敏度极高，样品需衍生
Vap是表观迁移速度；μap是表观淌度；ldet 是毛细管有效长度； ltot 是毛细管总长度
2.分离效率（塔板数）
在CE中，仅存在纵向扩散，σ2=2Dt
n apVl det ap Eldet ;
2DL
2D
n
5.54
tR W1/
2
2
扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，这是分离生
物大分子的依据。
式中， e为of 电渗速度；为eof 电渗淌度（EOF mobility）； 为 双电
层的Zeta电位； 为 缓冲液介电常数；η为电解液粘度；V为所
施加的电压； 为毛lto细t 管总长度。
特选课件
11
毛细管电泳分离技术课件
电泳操作
01Leabharlann 准备毛细管电泳仪和样 品02
样品处理：稀释、离心、 过滤等
03
毛细管电泳仪设置：电 压、电流、温度等
04
毛细管电泳仪运行：样 品注入、电泳、检测等
05
数据分析：电泳图谱分 析、数据处理等
06
结果报告：电泳结果、 结论和建议等
数据分析
01
毛细管电泳分离技术 原理
03
毛细管电泳分离技术 数据分析方法
05
毛细管电泳分离技术 数据分析应用
02
毛细管电泳分离技术 操作步骤
04
毛细管电泳分离技术 数据分析结果分析
毛细管电泳分离技术的发展趋势
技术改进
1
2
提高分离效率： 通过优化毛细管 电泳参数和设计， 提高分离效率
降低成本：通过 改进毛细管电泳 设备，降低设备 成本和运行成本
3
4
提高灵敏度：通 过改进检测方法， 提高毛细管电泳 的灵敏度
毛细管电泳技术的特点
高效分离：毛细管电泳技术具有较高的分离效率， 能够快速分离复杂样品中的多种组分。
灵敏度高：毛细管电泳技术具有较高的灵敏度，能 够检测到样品中极低浓度的组分。
快速分析：毛细管电泳技术具有较快的分析速度， 能够在较短的时间内完成样品的分析。
应用广泛：毛细管电泳技术广泛应用于生物医学、 环境科学、食品科学等领域，具有广泛的应用前景。
演讲人
毛细管电泳分 离技术课件
2023-12-11
目录
01. 毛细管电泳分离技术的基本 原理
02. 毛细管电泳分离技术的应用 03. 毛细管电泳分离技术的操作
步骤
04. 毛细管电泳分离技术的发展 趋势
毛细管电泳-2015
6.2 毛细管电泳的特点
与传统的电泳的比较 毛细管电泳的特点：高效、快速、微量、自动化
CE与HPLC比较
动力 分离效率 溶剂耗量 柱 仪器成本 分离速度 样品用量
CE 强电场 ~106/米 极少 便宜 低 更快 <100nL
HPLC 高压 ~50000/米 大 贵 高 快 几微升
毛细管区带电泳
基于试样中各个组分间荷质比的差异进行 分离。该模式的特征是：整个系统都用同 一种缓冲溶液充满。背景电解质的浓度一 般高于试样，起运载电流的作用。如果试 样中不同离子的迁移率差别很大，就能将 不同离子分离。
毛细管区带电泳可分离小离子，或衍生化生成 离子的物质，如抗炎药物，氨基酸等物质。
6.4 毛细管电泳的分类
按分离原理的不同，可将毛细管电泳分成： 毛细管区带电泳 capillary zone electrophoresis, CZE 毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis, CGE 毛细管等电聚焦 capillary isoelectric focus, CIEF 毛细管等速电泳 capillary isota- chophoresis, CITP 胶束电动力学毛细管色谱 (micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC) 填充毛细管电色谱 (capillary electroosmostic chromatography ，CEC)
参考书
1. 林炳承，《毛细管电泳导论》，科学出版 社，1996
2. 陈义，《毛细管电泳方法及应用》（第二 版），化学工业出版社，2006
3. 邓延倬，《高效毛细管电泳》，科学出版 社，2000
6.1 分离原理
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第二节 毛细管电泳基本原理
• 一、毛细管电泳的理论基础 • 在毛细管电泳中带电粒子所受的驱动力： 电泳力和电渗力。 • 电泳和电渗是毛细管电泳分离理论中最基 本的概念。
（一）电泳和电渗
• 电泳(Electrophoresis)是指溶液中带电粒子(离子、 胶团)在电场中定向移动的现象。 • 电泳是驱动电解质运动的第一种动力，如此形成 的粒子移动简称为泳流 • 电泳迁移速度ve : ve= μeE = μeV/L • μe:电泳迁移率(电泳淌度); E:电场强度; V－毛细 管柱两端施加的电压；L－毛细管柱的长度。 • 被分离组分在毛细管中的运行时间t （p86有误）
1.带电分子的本质
• 微粒的净电荷、大小、形状和相对质量对 它们的电泳淌度有相当大的影响。 • 分子的带电量与大小的比例是一个重要的 参数。 • 电量与大小的比例（e/r）越大，分子在给 定条件下，迁移得越快。
2.电泳系统的性质
• 电泳缓冲液的离子构成、温度、电泳缓冲 液的pH值、操作电压、载体介质的选择
第三章 毛细管电泳分离技术
第一节 概
述
• 电泳是基于两种或多种带电粒子或微粒， 它们所在的介质受到外加直流电场的作用 下，其迁移速率不同而得到分离的一类方 法。（electrophoresis ）
发展历程
• 1807年，Ferdinand Frederic Reuss就观察到了 荷电物质在电场力作用下会发生运动的现象。 • 1909年，由Michaelis对此现象的描述中提出电 泳这个术语(elektron和pbore,分别代表电和搬运 者的意思 ) • 1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两 段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电 泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出 白蛋白和α 、β 、γ 球蛋白，电泳技术才得到有 实际意义的发展，Tiseluis也因此获得了1948年 度的诺贝尔奖。 • 到20世纪50年代，电泳已经是一种与纸和薄层的 平面色谱技术一样的实验室常用技术。
2.电压的影响
• 施加的分离电压越高，分辨率越大。 • 根据欧姆定律，电压与电流呈线性关系， 在熔凝毛细管中产生的热量与电流的平方 成正比，焦尔热 • 电流的产生与缓冲溶液的阴离子种类有关 ， 应选用相同电压下电流小的阴离子制备缓 冲溶液。
3.黏度
• 在凝胶电泳中温度的增加可改变媒介的黏 度。
4.区域的畸变
• 在一个电泳泳动期间，特别在凝胶柱上， 如冷却不充分，凝胶较暖部分的迁移带的 移动速度会比那些较冷的部分快。这个迁 移速度的差异产生了弯曲带。 • 这个可以导致相邻区的重叠和差的分辨率。
（五）影响电泳淌度的因素
• • • • • • • 1.带电分子的本质 2.电泳系统的性质 （1）电泳缓冲液的离子构成 （2）温度 （3）电泳缓冲液的pH值 （4）操作电压 （5）载体介质的选择，
一、毛细管电泳的进样技术
• • • • • • （一）直接在线进样 （二）近端进样及双向进样 （三）流动注射与毛细管电泳联用(FI-CE) （四）液相色谱与毛细管电泳联用 （五）光学门进样 （六）流动门进样
光学门进样装置示意图
流动门进样装置示意图
二、毛细管电泳检测器
• 高压电源可对毛细管施加5~50 kV电压，操作电 压一般控制在5~30 kV范围。 • CE通常使用内径10~100 μm、长12~120 cm (内 涂聚酰亚胺) 弹性融凝石英毛细管，毛细管的两 端分别浸泡在含有缓冲溶液的贮液槽中，毛细管 内也充满同样的缓冲溶液。 • 被分离试样可以采用重力法、抽真空法或电迁移 法等多种进样方式由毛细管一端进入。
N
2 Dt
2D
L
2D
l L
（Giddings的色谱柱效理论，Einstein扩散定律）
提高分离电压是增加分离效率的主要途径，在相 同的操作电压下，l/L =1，分离效率最高。此外， N与溶质的扩散系数D成反比，所以用毛细管电泳 分离大泳的分辨率 （Giddings ）
1 V Ri 4 2D
0.5
eo
1 2
0.5
提高毛细管电泳的分辨率有两条途径： 一是通过增大分离电压来提高柱效; 二是控制电渗流，当电渗流移动方向与分离组 分的迁移方向相反，而速度大小相等时，分辨 率将趋于无穷大。
（四）影响分辨率的因素
• 1.毛细管电泳中的电解效应及缓冲溶液的选 择。 • 2.电压的影响。 • 3.黏度。 • 4.区域的畸变
• 固、液两相之间的相对运动发生在吸 附层与扩散层之间的滑动面上，此处 的电动势称为界面电动势，也称ζ电位。 • 由于处在扩散层中的正离子的溶剂化 作用，它在电场中发生迁移时，将带 动整个溶液向阴极移动，所以就形成 电渗流。
eo
4
veo eo E
E 4
• 电渗流速度Veo与ζ电位、ε、E成正比，而 与介质的粘度η成反比。 • 与HPLC柱不同，毛细管中的电渗流呈平面 流型，它不存在径向梯度。
• 要在维持高效情况下加快CE的分离速度， 可以采用以下几种方法： • ①短而窄内径的分离毛细管； • ②高分离电压； • ③高电渗流。 • 另外，对于带负电荷的分离物，通常在缓 冲溶液中加入阳离子表面活性剂，通过改 变EOF的方向来提高分离速度。
(三)分离效率和分辨率
• 毛细管电泳分离柱效方程式 a p p V l e eo V l2
1.电解效应及缓冲溶液的选择
• 在毛细管电泳中，阳、阴两极最有可能发生的电 极反应，其结果是阳极端因OH-被消耗而H+量相 对增加，阴极端则因消耗H+而使OH-量相对增加。 两极溶液的pH差距变大 • 电渗流则受溶液的pH影响很大。 • 所以，选择具有pH缓冲能力的溶液为分离介质 • 当缓冲液浓度(或离子强度)增加时，双电层的厚 度降低，Zeta电位减小，溶液的粘度增大，电渗 流速度将减小。减小电渗流会增加分辨率。过高 浓度的电解质容易导致溶液过热，会引起电泳区 带展宽，使分辨率降低。 （适度的浓度） • 所用缓冲溶液的种类也会影响电渗流 （磷酸盐溶 液）
20世纪70年代在HPLC的推动下，电泳分离技术成 为了一种“灰姑娘”式的技术 。 1981年，Jorgenson等[1]介绍了毛细管区带电泳 技术。 • 1984年Terabe等提出的胶束电动毛细管色谱。 • 1987年，Hjerten建立了毛细管等电聚焦。 • 1987年，由Chohen等提出了毛细管凝胶电泳。 • 1991年，Monnig等[2]首次提出了高速毛细管电 泳。 • 目前，毛细管电泳已广泛应用于氨基酸、肽、蛋 白质和核酸等离子型生物大分子的分离分析，加 入表面活性剂还可以扩大到中性粒子，甚至应用 到细胞和病毒等的分离。同时，在小分子化合物 的分离分析方面也取得了重大进展。
（3）电泳缓冲液的pH值
• pH对一个蛋白质分子上的净电荷有明显的 作用。 • 为了优化（蛋白质）分子混合物的分离， pH值的选择应以净分子电荷为基础。 • 例如，在一个电泳泳动期间，两个或更多 的蛋白质一起迁移而只形成一条区带。如 果我们在不同的pH值下进行分析，将导致 多余蛋白质带的出现，促使样品中其它蛋 白质的分离。
注：电渗流的速度 为泳流的若干倍
电渗流的速度为泳流的若干倍，且受pH等条件的 影响很大，在分离过程中很容易发生变化，因而 必须加以控制，使其在一定范围内保持恒定。
• 抑制毛细管中电渗流的办法： • 消除固液界面间的ζ电位或提高溶液的粘度； • 在毛细管的内壁涂上聚合物，如聚丙烯酰 胺涂层。
(二)分离速率
t
l ve
Ll eV
l－为毛细管柱从进样端至检测窗口的距离(有效长度)
• 电泳迁移率μe • μe =νe/E= Q/f
ve
Q f
V L
QV 6 R s L
Q－离子所带的净电荷；f－Stokes阻力系数。η是缓冲 溶液的粘度(动力学的)，Rs是离子的有效半径(包括溶剂 化层)
• 当毛细管长度一定时，带电离子的迁移速 度与溶质离子的电荷、施加的电压、缓冲 溶液的粘度及带电离子的大小有关。
（4）操作电压
• 一个分子的迁移速率和媒介两边的场强是 成比例的。 • 但是，随着电压的增大对流也上升，导致 更强大功率的产生（功率以对流平方的方 式增加），这样一些功率以热量形式消散。 • 电压（或对流）应该要足够大以允许带电 分子的快速迁移，但也不能太大以产生过 量的热。
（5）载体介质
• • • • 选择最合适的载体介质以下面几点为依据： 样品质量 分子的大小 如果不得不使用筛分凝胶时，它的毛孔大小 （集中性）也应该要选择以适合所研究的分 子大小、分析所需时间。
二、毛细管电泳的分离模式
• • • • • • • • • 毛细管区带电泳(CZE) 胶束电动毛细管电泳(MECC) 毛细管凝胶电泳(CGE) 毛细管等电聚焦(CIEF) 毛细管等速电泳(CITP) 毛细管离子电泳(CIE) 毛细管电色谱 毛细管阵列电泳 亲和毛细管电泳
第三节 毛细管电泳装置
• 直流高压电源、毛细管、进样装置、检测 器和记录仪等
（1）电泳缓冲液的离子构成
• 由于带电分子表面的可电离层和电泳缓冲 液中离子间的相互作用，一个带电分子被 反电荷的离子团所包围。结果，它的净电 荷和电泳淌度都下降了。 • 选择一个合适的盐浓度显得很必要。
（2）温度
• 温度对电泳有显著的影响。 • 在一个电泳泳动期间，热量（焦耳热）会产生并 且在很多途径上影响着电泳扩散。 • 温度增加引起带电分子迁移带的扩散增加，如果 电泳持续时间长（数小时）扩散作用变得更显著。 • 温度引起蒸发作用 • 温度引起对流现象 • 为一次电泳泳动选择一个最佳温度并在整个分析 过程中都维持着是必要的。
• 电解质区带的移动速度(Vi)等于电解质区带 的电泳迁移速度(Ve)与溶剂流速度(Veo)之 和。 Vi = Ve + Veo