动物细胞大规模培养

提问
1、动物细胞培养有哪三种类型？
1、悬浮培养
P209
问题
1、悬浮培养是用培养哪一类细胞的？ 2、悬浮培养有何优缺点？
2、贴壁培养
贴壁指必须贴附在固体介质表面上生长的细胞培养培养，主要用于非淋巴组 织和许多单倍体等贴壁依赖性细胞的培养。由于大多数动物细胞属于贴壁依 赖性细胞，贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。
问题
目前由动物细胞培养的产物包括哪几类？请分别列举出2-3个产物。
表11-1 动物细胞培养的产物
疫苗 人 小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫 苗等 牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘 病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗 IgG、IgM、IgA等 β-细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、 白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等 尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶、细胞色素P、450、纤维 蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脱羟酶等 绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、 促间质细胞激素、促黄体激素等
抗体
由B细胞产生的免疫球蛋白，它能识别抗原的某一特定位点。抗体分 子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链分子组成。存在 于人或哺乳动物的血清之中。
抗原
有毒物质或病原物侵入，即抗原 侵入 抗体1 抗体2
指诱导产生抗体的物质。
如前所述，抗体分子是免疫系统反应的一个重要组分，因为抗体分子可以识 别各种不同的外来抗原，同时可激活宿主的防卫系统。 对于一个免疫刺激（有毒物质或病原物侵入，即抗原），每一个淋巴细胞都 会合成并分泌一种单个的抗体，这些抗体可以高度特异地识别免疫抗原的特定区域， 也就是抗原决定簇。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫 淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的 不同的抗体统称为多克隆抗体。
问题
1、目前较常用的合成培养基有哪些？ 2、为什么在要求较高的基础性研究中要用无血清培养液？ 3、无血清培养液由哪两部分组成？P208
二、动物细胞培养方法
所谓动物细胞培养是将动物组织或细胞从机体取出，分散成 单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体 外继续生长和繁殖。表11-4，表11-5是微生物细胞与动物细胞性质 和培养方法的比较。
第十一章动物细胞大规模培养 教 学 内 容
1、动物细胞培养基 2、动物细胞培养方法 3、动物细胞培养生物反应器 4、动物细胞培养技术 5、动物细胞大规模培养工艺
第十一章
本章内容提要
动物细胞的大规模培养
在生物技术中，人们已广泛地围绕着细菌、酵母、丝状真菌等微生物的 大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质等产物。然而，许多有重要价值的 蛋白质等生物物质，必须借助于动物细胞的培养来获得，例如病毒疫苗、干扰 素、单克隆抗体等，如表11-1所示的是一些已实现工业化和正在研究开发的产 品。 大规模的动物细胞培养开始于本世纪50年代，经过多年来的研究，人类对动 物细胞培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大的进展。尽管如此，目前 的技术水平还远不能满足细胞生物产品研究和生产的要求，随着动物细胞培养 技术的应用日趋广泛，已显示出很广阔的发展前景。
1、气升式细胞培养生物反应器
气升式反应器的基本原理如图11-2 所示。气体混合物从底部的喷射管进 入反应器的中央导流管使得中央导流 管侧的液体密度低于外部区域从而形 成循环。气升式生物反应器主要采用 内循环式，但也有采用外循环式。
温 度
细胞在体外生存的基本条件之一，来源不同的动物细胞，其最适的生长温度是 不尽相同的，例如昆虫细胞的最适温度是25-28℃，人和哺乳动物的细胞的最适温度 是37℃.细胞代谢强度与温度成正比，高于最适温度范围，细胞的正常代谢和生长将 会受到影响，甚至导致死亡。总的来说，动物细胞对低温的耐受力比对高温的耐受 力强，如温度升至45℃时，1h内人和哺乳动物细胞将被杀死；相反，降低细胞置于 25-35℃时，细胞仍能生长，但速度减慢，并维持长时间不死，甚至于放在4℃，数小 时后再置于37℃培养，细胞仍能继续生长。
目前所有的细胞培养都已采用经标准化生产、组成和含量都相对固定的各种合 成培养基，并已有配制好的干粉型商品。尽管现在的合成培养基成分和含量已经较 为复杂，但仍然不能完全满足体外培养细胞生长的需要，合成培养基中还是需要加 入一定量的天然培养基予以补充。
3、常用的合成培养基
目前合成培养基的种类已有数十种，大多数培养基都是为适应某种组织细胞 的生长而在某种合成培养基的基础上改良而来的。目前较为常用的有199培养液、 Eagle (MEM、DMEM)培养液、RPMI1640培养液、HAM培养液等。表11-2为常用 的培养基的成分和配方。
PH 值
合适的PH值是细胞生存的必要的条件之一。动物细胞合适的PH值一般在7.2-7.4， 低于6.8或高于7.6时都对细胞产生不利的影响，严重时可导致细胞退变或死亡。不同 的细胞对 PH值也有不同的要求，原代培养细胞对 PH值的变化耐受性差，传代细胞 对 PH 值变化的耐受性较强。而对于同一种细胞，增长期和维持期的最适 PH也不尽 相同，对于大多数细胞来说，偏碱性环境比酸性环境更有利于细胞的生长。
于是，人们认识到要把抗体应用于临床诊断或是治疗，必须要制备单一类型的 只对某一特定抗原决定簇的抗体分子，也就是单克隆抗体。
多克隆抗体
在一个血清样品中包含了对同一抗原分子上不同抗原决定簇的多种抗体。
单克隆抗体
由杂交瘤细胞系产生的针对某一特定抗原决定簇的单一类型的抗体。
补充内容（二）
动物细胞培养步骤
天然培养基的种类有很多，包括生物性液体（如血清）、组织浸出液（如胚胎 浸出液）、凝固剂（如血浆）等。
1、天然培养基有哪些？它有何优缺点？
问题
2、血清和血浆分别如何取得？ 3、最广泛使用的血清是什么动物血清？它有何营养成分？
血液组成：红细胞、白细胞、血小板和血浆。高速离心，分三层：上层为血浆 40%多。
在贴壁培养过程中，贴壁依赖性细胞需要附着在带适量正电荷或半固体的 表面上，原来是圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展开来，然后开始有丝分裂，并很 快进入对数生长期。一般可在数天后铺满生长表面，形成致密的细胞单层。
问题
在贴壁培养依赖性细胞中，请比较滚瓶培养系统和微载体培养系统？
细胞贴壁一般分为贴壁因子吸附于培养表面、细胞与表面接触、细胞贴壁于培 养表面和贴壁细胞在培养表面上扩展等几个步骤。图11-1为细胞在培养表面贴壁过 程示意图。
表11-4 微生物细胞和动物细胞性质的比较
性质
大小 代谢调节方式 营养要求 生长速率 机械强度 环境适应
微生物细胞
1-10μm 内部
动物细胞
10-100μm 内部和激素 苛刻 倍增时间一般为12-60h 很差，缺乏保护性细胞壁 差
宽松，可利用多种底物
倍增时间一般为0.5-2h 较好 好
表11-5 微生物和动物细胞培养方法的比较
血浆
血浆不仅可用来支持培养组织块，而且还供给细胞生物匠营养物质，但由于血 浆很容易发生液人经，目前已很少单独使用。一般使用的是禽类血浆。
组织浸出液
组织浸出液常用的是胚胎浸出液（如鸡胚浸出液），它的主要成分含有大分子 核蛋白和小分子的氨基酸，有促进细胞生长的作用。
水解乳蛋白
水解乳蛋白是常用的一种天然培养基，是由乳白蛋白经水解而 制得，氨基酸的含量较高。一般配制成0.5%的溶液，或与合成培养 基以1：1共同使用。
血浆冷冻到 -30 度，离心，分层：上层为血清， 下层为杂蛋白（少）。
血清
组织细胞培养中最常用的天然培养基是血清，这是因为血清中含有包括大分子 的蛋白质和核酸等丰富的营养物质，对促进细胞生长繁殖、粘附及中和某些物质的 毒性起着一定的作用。用于组织细胞培养的血清的种类很多，其来源主要动物，有 小牛血清、胎牛血清、马血清、兔血清以及人血清等，最广泛使用的是小牛血清和 胎牛血清。优质的血清外观应为透明、无溶血、淡黄色、无沉淀物。
培养动物细胞一般可按以下步骤进行： 无菌取出目的细胞所在组织，用培养液漂洗干净
以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块
将小组织块置解离液离散细胞。解离液含蛋白酶类，无钙、镁离子
低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养
一、动物细胞培养基
1、动物细胞培养的环境
动物细胞的生长、繁殖和代谢等生理性质在很大程度上受到各种环境因素的影 响。为了使动物细胞的培养处于最佳状态，了解环境因素对其影响无疑是很重要的， 影响动物细胞生长、繁殖的环境因素很多，主要有温度、PH值、营养成分、溶氧、 气体环境、渗透压以及其他因素。
3、固定化培养
固定化培养是既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培 养方式，具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点。 由于所培养的细胞的不同，固定化培养的方式也有不同，一般对于贴壁依赖 性细胞通常采用胶原包埋，而对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。 常用的细胞固定化的方法主要有 吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和 微囊化等。
2、培养基的组成
4、细胞代谢产物CO2对细胞生长有何作用？
培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养最重要的条件。 用于动物细胞的培养基可以分为天然培养基和合成培养基两 大类。
天然培养基 是使用最早、最为有效的动物细胞培养基，它主要取自于动物体
液或从动物组织分离提取而得，其优点是营养成分丰富、培养效果良好；缺点是成 分复杂、个体差异大、来源有限。
三、动物细胞培养生物反应器
自70年代以来，用于动物细胞培养的生长反应器有了很大的发展，种类越来越多， 规模也越来越大。根据生物反应器的不同用途，有悬浮培养用、贴壁培养用、包埋 培养用生物反应器等，其种类大致上有塑料增殖器、填充床增殖器、多层板增殖器、 螺旋增殖器、管式螺旋增殖器、陶质矩形通道蜂窝状增殖器、流化床反应器、中空纤 维及其他膜式反应器、桨式搅拌反应器、棒式搅拌反应器、船舶推进桨反应器、倾斜 桨叶搅拌反应器、般帆形搅拌反应器、往复振动锥孔筛板搅拌反应器、笼式通气搅拌 反应器、双层笼式通气搅拌反应器、空气提升式反应器等。