最新美国药典-微生物检测

〈61〉非无菌产品的微生物检测：微生物计数检测法

生长促进试验和计数方法的适用性

概述

在供试品存在的情况下，必须确立检测微生物的试验能力。

如果引入了可能影响试验结果的在测试性能或产品方面的变更，则必须确认其适用性。

供试菌株的制备

使用供试菌株的标准化稳定悬浮液或者按照以下所述制备。使用菌种保存技术（种子批系统）以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批不超过五代。按照表1中的描述，分别培养每种细菌和真菌供试菌株。

表1.供试微生物的制备和使用

用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲溶液或pH7.2的磷酸盐缓冲液配制供试悬浮液；为使黑曲霉孢子悬浮，可将0.05%的聚山梨醇酯80加入该缓冲液中。这些悬浮液需在2个小时之内使用，或存放在2o～8o 条件下24小时内使用。作为制备并稀释黑曲霉或枯草杆菌营养细胞的新鲜悬浮液的替代方法，可制备稳定的孢子悬浮液，然后将适量的孢子悬浮液用于试验接种。稳定的孢子悬浮液可在2o～8o下保存，保存期经过时间验证。

阴性对照

为了确认试验的条件，用所选的稀释液替代供试品阴性对照。必须没有微生物的生长。

培养基的生长促进

对每一批已制备好的培养基和每一批从脱水培养基或根据描述的组分制备出来的培养基进行测试。

在部分/整个平皿内的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基和大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu) 表1中指定的微生物，每种微生物均使用单独一部分/整个平皿培养基。在平皿内的沙氏葡萄糖琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu)表1中指定的微生物，每种均使用一个单独平皿的培养基。按照表１中描述的条件进行培养。

对于固体培养基，所获得的生长与标准化接种体的计算值之间的差异因素不大于2。对于刚刚制备好的接种体，发生的微生物生长与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。如果出现了与此前从上一个经过测试并通过的培养基批次获得的微生物生长相当、清晰可见的微生物生长，则液体培养基适用。

供试品计数法的适用性

样品的制备

样品制备方法取决于供试品的物理特征。如果以下描述的规程不能够被令人满意地证实，则必须开发一个适用的替代规程。

水溶性产品—溶解或稀释（通常制备1:10的稀释液）供试品，于pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液，pH7.2的磷酸盐缓冲液或大豆酪蛋白消化物肉汤培养基中。如有必要，调整pH值为6至8。需要时，用相同的稀释剂作进一步稀释。

不溶于水的非脂肪性产品—将供试品（通常制备1:10的稀释液）悬浮于pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液，pH7.2的磷酸盐缓冲液或大豆

酪蛋白消化物肉汤培养基中。可以加入表面活性剂，如1g/L的聚山梨酯80，以帮助难以与水混合的物质悬浮。如有必要，调整pH值为6至8。需要时，用相同的稀释剂进一步稀释。

脂肪性产品—溶解于以过滤除菌的豆蔻酸异丙酯，或者将供试品与所需最少量的、经过加热的无菌聚山梨酯80或另一种非抑菌性的无菌表面活性剂进行混合，如有必要，可加热至不超过40o或者在特殊情况下不超过45o。仔细混匀，如有必要，在水浴锅里中维持该温度。加入充足数量、经过预热的所选择稀释剂，制成原产品的1:10稀释液。仔细混匀，同时维持该温度至形成乳化剂所必需的最短的时间。可以用所选择的含有适当浓度的无菌聚山梨酯80或者另一种非抑菌性的无菌表面活性剂的稀释液，来制备后续的系列10倍稀释液。

液体或固体悬浮微粒状—以无菌操作将供试品转移至一个膜过滤设

备或无菌容器中做进一步取样。使用每个待检容器中的全部内容物或规定数量的一定剂量。

贴剂——去除贴剂的防护面（“释放衬板”）并将它们放置在无菌玻璃或塑料托盘上，将有粘性的一面朝上。用适当的无菌多孔材料（如：无菌纱布）盖住粘性面，以防止贴剂粘在一起，并将10片贴剂转移到所选的含有灭活剂（如：聚山梨醇酯80和/或卵磷脂）的适量稀释剂中。振摇供试品至少30分钟。

接种和稀释

加入足量的微生物悬浮液到按上述规定制备的样品及对照品（不含检测物）中，以获得一个不多于100 cfu的接种体。接种体的悬浮液

体积应当不超过被稀释供试品体积的1%。

为证明供试品有可接受的微生物回收率，必须使用已制备样品的最低可能稀释倍数来进行检测。如果由于抗菌活性或低溶解度而无法做到这一点时，必须进一步开发合适的规程。如果样品对生长的抑制不能避免，可以在中和、稀释或过滤后加入等量的微生物悬浮液。

抗菌活性的中和/去除

用制备好的样品按接种和稀释项下的描述稀释，并按供试品微生物的回收率规程培养，将从中回收的微生物数量与从对照品中回收的微生物数量进行比较。

如果生长被抑制（以大于2的因素减少），那么修改特定的计数测试规程以确保结果的有效性。规程的修改可以包括，例如：

1.稀释剂或培养基体积的增加；

2.将某个特定或通用的中和剂加合到稀释剂中；

3.膜过滤；或

4.综合以上措施

中和剂——中和剂可以用于中和抗菌剂（见表2）的活性。最好在灭菌前将它们加入到所选的稀释来论证它们的功效和无毒性。

表2.对干扰物质的常用中和剂/方法

如果没有找到合适的中和方法，则可以假定未能分离所接种有机体的原因是供试品杀灭微生物活性。这个信息帮助指出此物品不太可能被特定微生物种群污染。然而，有可能供试品只抑制这里所列出微生物中的某些，而并不抑制未包括在供试菌株之中其他微生物或者后者对其不具代表性的那些微生物。然后，用与微生物生长和具体接受标准相适应的最高稀释倍数进行试验。

供试品中微生物的回收

膜过滤—使用标准孔径不超过0.45 µm的膜过滤器。过滤器材质的类型按以下标准选择，即细菌保留效能不被待检测样品的成分所影响。对于所列出的每个微生物，单独使用一个膜过滤器。

将按照样品的制备、接种、稀释和抗菌活性的中和/去除项下描述所制备的适当数量的样品（最好相当于1克产品，在cfu数量预计较大时，可减用量）转移至膜过滤器，立即过滤，并用适量的稀释剂冲洗膜过滤器。

为确定总好氧微生物计数（TAMC），将滤膜转移至大豆酪蛋白消化物琼脂培养基的表面。为确定总酵母菌和霉菌联合计数（TYMC），将