最新美国药典-微生物检测
美国药典-微生物检测
〈61〉非无菌产品的微生物检测：微生物计数检测法生长促进试验和计数方法的适用性概述在供试品存在的情况下，必须确立检测微生物的试验能力。
如果引入了可能影响试验结果的在测试性能或产品方面的变更，则必须确认其适用性。
供试菌株的制备使用供试菌株的标准化稳定悬浮液或者按照以下所述制备。
使用菌种保存技术（种子批系统）以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批不超过五代。
按照表1中的描述，分别培养每种细菌和真菌供试菌株。
表1.供试微生物的制备和使用用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲溶液或pH7.2的磷酸盐缓冲液配制供试悬浮液；为使黑曲霉孢子悬浮，可将0.05%的聚山梨醇酯80加入该缓冲液中。
这些悬浮液需在2个小时之内使用，或存放在2o～8o条件下24小时内使用。
作为制备并稀释黑曲霉或枯草杆菌营养细胞的新鲜悬浮液的替代方法，可制备稳定的孢子悬浮液，然后将适量的孢子悬浮液用于试验接种。
稳定的孢子悬浮液可在2o～8o下保存，保存期经过时间验证。
阴性对照为了确认试验的条件，用所选的稀释液替代供试品阴性对照。
必须没有微生物的生长。
培养基的生长促进对每一批已制备好的培养基和每一批从脱水培养基或根据描述的组分制备出来的培养基进行测试。
在部分/整个平皿内的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基和大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu) 表1中指定的微生物，每种微生物均使用单独一部分/整个平皿培养基。
在平皿内的沙氏葡萄糖琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu)表1中指定的微生物，每种均使用一个单独平皿的培养基。
按照表１中描述的条件进行培养。
对于固体培养基，所获得的生长与标准化接种体的计算值之间的差异因素不大于2。
对于刚刚制备好的接种体，发生的微生物生长与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。
如果出现了与此前从上一个经过测试并通过的培养基批次获得的微生物生长相当、清晰可见的微生物生长，则液体培养基适用。
供试品计数法的适用性样品的制备样品制备方法取决于供试品的物理特征。
美国药典USP31无菌检查
美国药典USP31无菌检查简介美国药典（United States Pharmacopeia，简称USP）是美国公认的医药行业标准组织，负责制定和发布有关医药品质量的标准和方法。
无菌检查是USP31中的一个重要章节，它主要用于评估药品、医疗器械和其他与患者直接接触的产品的无菌状态。
本文将介绍无菌检查的定义、方法和注意事项。
无菌检查的定义无菌检查是指对药品或医疗器械进行的一系列检验，以确定其是否存在可繁殖的微生物，从而判断其无菌性。
无菌状态是指在没有任何活体微生物存在的情况下。
对于注射剂、眼药水等需要直接进入体内的产品，无菌状态非常重要，以防止微生物感染和其他不良反应的发生。
无菌检查方法无菌检查的方法有多种，常用的方法包括：厌氧培养方法这种方法用于检测生长于缺氧条件下的微生物。
样品通常放置在厌氧培养基中，然后在恒温条件下培养，观察是否有菌落的形成。
高压蒸气灭菌法这种方法通过将样品暴露在高温高压的环境中，使用蒸汽来灭活可能存在的微生物。
灭菌后，用无菌培养基接种样品，并在一段时间后观察是否有菌落的形成。
过滤方法这种方法通过使用无菌过滤器来过滤样品，将可能存在的微生物滤除。
过滤后，将过滤膜接种在无菌培养基上，观察是否有菌落的形成。
光谱学方法这种方法通过使用紫外线、红外线等光谱技术来检测微生物的存在。
由于微生物具有特有的光谱特征，因此可以通过光谱仪器来进行无菌检查。
注意事项在进行无菌检查时，需要注意以下事项：检测设备的无菌性检测设备（培养皿、培养基等）在使用前应进行无菌处理，以避免外源性微生物的干扰。
常用的处理方法包括高温蒸馏、紫外线照射等。
样品的收集和处理在收集样品时，应注意避免样品与外界环境的接触，以防止样品被外源性微生物污染。
在处理样品时，应采取无菌操作，避免微生物的传播。
结果的解读在进行无菌检查后，需要对结果进行解读。
有菌落的形成通常表示样品存在微生物污染，是不符合无菌要求的。
无菌检查的结果应与相应的标准进行比较，以确定样品是否合格。
美国药典微生物限度检测
61微生物限度检测（MICROBIAL LIMIT TESTS）此章提供方法来检测可能存在的好氧微生物其他制药过程中可能出现的微生物的数量，包括原材料和成品中的。
如果经过验证确认可以得到相同或更好的检测结论，也允许采用自动化的检测方法。
在样品检测过程中须进行无菌操作。
若无特别说明，则“培养（incubate）”一词指在30—35℃的培养箱内培养24至48小时；“生长（growth）”一词用于专门的判定，说明“存在和可能存在活的微生物”。
准备实验 (Preparatory Testing)本章涉及实验结果的有效性取决于：提供的被检测样品本身在实验条件下，被充分证明不会抑制可能存在的微生物的生长。
因此，在准备样品时，需要正规的实验操作和符合要求的实验条件，接种稀释样品到含有以下（微生物）培养物的培养基：金黄色（奥里斯）葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,大肠埃希氏菌（Escherichia coli）, 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa), 和沙门氏菌（Salmonella）。
方法如下：将用肉汤培养基培养24小时后的（微生物）不小于10-3稀释的微生物培养物，加1 ml（微生物）培养液到磷酸(盐)缓冲液(pH 7.2)，液体大豆酪蛋白消化物培养基（Fluid Soybean-Casein Digest Medium），或者液体乳糖培养基（Fluid Lactose Medium）。
相应培养基培养失败则需要采取以下方法更改检测程序：（1）增加稀释液体积，检测样品加入量仍维持不变；或者（2）中和一定数量的干扰因子；或者（3）结合（1）、（2）得出适当条件，使接种物得以生长。
以下是一些物质的成分和浓度，该物质及浓度可用于加入培养基、阻止物质发挥抑菌作用：大豆卵磷脂（soy lecithin, 0.5%）或者聚山梨醇酯20（polysorbate 20, 4.0%）。
各国药典微生物方法对比
各国药典微生物方法对比本篇文章旨在比较各国药典中微生物检测方法的不同之处。
微生物检测对于保证药品的质量和安全至关重要，各国药典都提供了相应的指导和标准。
然而，由于各国的文化、法律和技术差异，各国的药典在微生物检测方法上存在一定的差异。
以下将以中括号内的内容为主题，详细介绍各国药典中微生物方法对比。
[美国药典（USP）微生物方法]美国药典（USP）是全球最主要的药典之一，其微生物检测方法有着广泛的应用。
USP推荐的微生物方法主要基于美国食品药品监督管理局（FDA）的要求，主要包括细菌计数、限度测试和特定微生物检测。
其方法的特点在于简单易行、结果可靠且易于验证。
其中，细菌计数方法主要采用菲斯特计数法或冷凝液计数法。
而在限度测试方面，则主要采用的方法是逐级稀释、涂布法和培养法。
USP还明确规定了一些特定微生物的检测方法，如大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌等，其检测方法主要依赖于PCR技术和传统的培养法。
[欧洲药典（Ph. Eur.）微生物方法]欧洲药典（Ph. Eur.）是欧洲地区药典的统一标准，其微生物方法与美国药典存在一定的差异。
Ph. Eur.对微生物检测也有着详细的规定，包括细菌计数、限度测试和特定微生物检测。
在细菌计数方面，Ph. Eur.主要采用薄膜过滤法或蔗糖凝胶法。
而在限度测试方面，Ph. Eur.则主要采用稀释平板法、滚珠法和过滤膜方法。
与USP 不同的是，Ph. Eur.也明确规定了一些特定微生物的检测方法，如霉菌和酵母菌等。
这些检测方法涵盖了PCR技术、酶联免疫吸附试验（ELISA）和传统的培养法。
[中国药典（ChP）微生物方法]中国药典（ChP）是中国主要的药典标准，其微生物方法也存在一定的特点。
ChP的微生物检测主要分为总菌落计数、限度测试和特定微生物检测。
与美欧药典不同的是，ChP对微生物检测方法的规定相对较为简洁。
在细菌计数方面，ChP主要采用的方法有薄膜过滤法、落下法和滚珠法等。
微生物检测美国药典
微生物检测非无菌供试品的微生物检测：微生物计数检测修改：生长促进实验，计数方法的适应性以及阴性对照概论在供试品存在的情况下发现微生物检验能力必须被确定。
如果检验过程中发生变更或者供试品变更，且这些变更可能影响检验结果，适应性必须被确认。
检验菌株的准备使用稳定的标准菌悬液或者按照下面所述备制。
使用菌种保存技术（种子批系统），以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批开始不超过5代。
每种细菌和霉菌菌株的生长分别按照表一中的描述进行。
表一测试微生物的备制和使用使用pH7.0的缓冲氯化钠蛋白胨溶液或者pH7.2的磷酸盐缓冲溶液备制测试菌悬液；备制黑曲霉孢子悬浮液时，0.05%的聚山梨脂80可以被添加到缓冲液中。
测试菌悬液应在两小时内使用，或者在2-8℃的条件下24小时内使用。
也可以通过制备并稀释枯草芽胞杆菌营养细胞的新鲜悬液进行替代，制备稳定的胞子悬液，在接种测试中使用适当体积的胞子菌悬液，稳定的胞子悬液在2-8℃保存，保存期是经过验证的。
阴性对照为了确定检测条件，用选择好的稀释液代替测试备制来进行阴性对照。
必须没有微生物的生长。
当按照供试品检测中的描述进行检验时，也需要进行阴性对照。
如果阴性对照不合格需要进行调查。
培养基的生长促进检测每个批次的已经备制好的培养基以及通过脱水培养基或者描述的配料备制的每个批次的培养基。
在部分/盘大豆酪蛋白消化肉汤培养基以及大豆酪蛋白消化琼脂上接种少量（不超过100CFU）微生物，按表一中所示，每一种微生物应使用单独一部分/一盘培养基。
在沙氏葡萄糖琼脂上接种少量（不超过100CFU）微生物，按表一中所示，每一种微生物应使用单独的一盘培养基。
按照表一中所述的条件进行接种。
固体培养基的生长通过一个不大于2的系数的调节必须不能与标准接种体计算得到的数值有区别。
新鲜备制的接种体微生物的生长应与上一批通过检测的培养基的生长情形相同。
如果肉眼能清晰看到的微生物的生长与上一批通过检测的培养基的生长情形相同的话，液体培养基是适合的。
《美国药典》(USP42-NF372S)通则1227药品微生物回收的验证
第一作者简介：解慧，硕士研究生；研究方向：微生物学。
Ｔｅｌ：０２２ ２３５１３９８３；１３８２０２５５３３６；Ｅ ｍａｉｌ：ｘｉｅｈｕｉ０５ｑｓｄ＠１６３ ｃｏｍ《美国药典》（ＵＳＰ４２ ＮＦ３７２Ｓ）通则＜１２２７＞药品微生物回收的验证解慧，刘洪祥，杨倩，曹晓云（天津市药品检验研究院，天津３０００７０）摘要：《中华人民共和国药典》、美国药典（ＵＳＰ）及欧洲药典（ＥＰ）等均指出具有抑菌性产品的微生物计数、检测、抑菌效力检查或无菌检查，应首先中和其抑菌性，并需对中和抑菌性的方法进行验证。
《美国药典》通则＜１２２７＞药品微生物回收的验证首次详细阐释了中和方法验证方案的设计和试验结果的判定，对于完善药品微生物检查方法、保证微生物检测结果准确，具有指导意义。
本文将《美国药典》（ＵＳＰ４２ ＮＦ３７２Ｓ）通则＜１２２７＞章节译出，以期为医药界的科研工作者提供参考。
关键词：美国药典；微生物回收验证；抑菌性中图分类号：Ｒ９２１ ２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９－３６５６（２０２０）－２－０１４６－４ｄｏｉ：１０ １９７７８／ｊ ｃｈｐ ２０２０ ０２ ０１１Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｃｏｖｅｒｙｆｒｏｍｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａａｒｔｉｃｌｅｓｉｎｇｅｎｅｒａｌｎｏｔｉｃｅ＜１２２７＞ｏｆＵＳＰ４２ ＮＦ３７２ＳＸＩＥＨｕｉ，ＬＩＵＨｏｎｇｘｉａｎｇ，ＹＡＮＧＱｉａｎ，ＣＡＯＸｉａｏｙｕｎ（ＴｉａｎｊｉｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｏｐｅｒｔｙｓｈｏｕｌｄｂｅｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄｆｉｒｓｔｌｙａｎｄｔｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｍｕｓｔｂｅｖａｌｉｄａｔｅｄｗｈｅｎｔｈｅｔｅｓｔｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ，ｓｐｅｃｉｆｉｅｄｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｒｓｔｅｒｉｌｉｔｙａｒｅｐｅｒ ｆｏｒｍｅｄｆｏｒａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｓａｓｐｅｒＣｈＰ，ＵＳＰａｎｄＥＰ Ｔｈｅｄｅｓｉｇｎｏｆｖａｌｉｄａｔｉｏｎｐｒｏｔｏｃｏｌｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｍｅｔｈ ｏｄａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｊｕｄｇｅｍｅｎｔａｒｅｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎｄｅｔａｉｌｓｉｎｔｈｅｇｅｎｅｒａｌｎｏｔｉｃｅ＜１２２７＞（ＶａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｂｉａｌＲｅ ｃｏｖｅｒｙｆｒｏｍＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａＡｒｔｉｃｌｅｓ）ｏｆＵＳＰｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅ Ｔｈａｔｈａｓｔｈｅｇｕｉｄａｎｃｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｎｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｔｅｓｔｍｅｔｈｏｄａｎｄｅｎｓｕｒｉｎｇｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙｏｆｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅｇｅｎｅｒａｌｎｏｔｉｃｅ＜１２２７＞ｏｆＵＳＰ４２ ＮＦ３７２Ｓｉｓｔｒａｎｓｌａｔｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＵＳＰ；ｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｃｏｖｅｒｙ；ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｏｐｅｒｔｙ１ 概述本章节为以下检查方法的验证提供指导：制药产品的存活微生物计数法、指示菌或者控制菌检查法及无菌检查法。
美国药典微生物检测精要
美国药典微生物检测精要引言微生物检测在药品生产中起着至关重要的作用。
药品的微生物污染可能对患者的健康造成严重威胁。
为了确保药品的安全性、可靠性和有效性，美国药典（United States Pharmacopeia, USP）制定了一系列用于微生物检测的指南和标准。
本文将概述美国药典微生物检测的精要内容。
检测方法目视法目视法是最简单、最常用的微生物检测方法之一。
该方法通过对样品进行肉眼观察，检验人员可以检测到样品中是否存在明显的微生物污染。
目视法的优点是操作简单，不需要特殊的设备和试剂，适用于多种药品和原料的微生物检测。
然而，目视法存在主观性和局限性，无法检测到微生物的低水平污染。
营养物质法营养物质法是一种常用的培养基法。
该方法以适宜的培养基为基础，通过对样品进行培养，利用微生物的生长特性来检测样品中是否存在微生物污染。
营养物质法可以检测到微生物的低水平污染，并且可以进一步鉴定和计数微生物。
然而，营养物质法需要一定的培养时间，且存在一定的培养基选择性和适应性的局限性。
生物化学法生物化学法是一种通过检测微生物代谢产物来判断样品中是否存在微生物污染的方法。
该方法利用微生物的代谢反应，检测样品中的特定代谢产物的存在与否。
生物化学法可以快速、准确地检测微生物污染，并且不受培养基选择性和适应性的限制。
然而，生物化学法需要特定的试剂和设备，并且对检测人员的技术要求较高。
检测标准美国药典对药品的微生物检测制定了一系列的标准和要求。
这些标准主要包括微生物限度试验、总微生物数试验、鉴别试验和特定微生物试验等。
微生物限度试验微生物限度试验旨在确定样品中存在的微生物数量的限度。
该试验要求将样品接种在适当的培养基中，经过一定的培养时间后，观察并计数生长的微生物数量。
美国药典针对不同类型的药品和原料制定了不同的微生物限度指标，以确保药品的微生物安全性。
总微生物数试验总微生物数试验用于确定样品中所有可培养的微生物的数量。
该试验要求将样品接种在适当的培养基中，经过一定的培养时间后，观察并计数生长的微生物数量。
美国药典29微生物限度检查
它山之石------ USP29“微生物限度检查法”供大家学习参考，我认为USP29内确实有许多值得我们学习的东西，但在编辑《中国药典》时也要考虑到我国实际情况，本着真正能提高药品质量的目的，如一味地照抄照搬别人的东西，就会出现看看药品标准确实是上去了，体面、拿的出去，但在实际应用时不适宜操作，反而降低了对药品质量的控制。
我认为2005年版、2010年版的《中国药典》微生物限度检查法就是如此，2005版药典执行后就开始需要进行药品的验证工作，相同的药品不同的厂家之间要验证；既是同一厂家由于生产原料厂家的改变也要验证，因此各厂家之间出现了五花八门的都称已经验证的检验方法，有的说该方法可行，有的又说该方法不行，天知道这些验证方法的可信度？同时又出台了执行药典通知：以后未经验证的检品不能下“微生物限度检查符合规定”的结论。
我国有这么多的药品生产厂家，作为我国药品的监督检验单位，对药品检验来说怎样去验证，每做一个检品都去验证，这样的工作量现实吗？到今天药典还没有一个对具体样品经验证后较科学的检验方法或指导性方法。
我认为现行的“微生物限度检查”法参照USP的方法对具体的样品验证，并按经验证后的方法进行检验，这确实有利于微生物的检出率，提升药品检验标准。
但应分步进行：可先放在“药典附录指导性原则”内，然后再要求药品生产企业对自己生产的品种进行验证并报地市级以上药品检验所对该方法再次进行检验审核后，再报药典会汇总、审核，在《中国药典》具体品种项下写入检验方法后再开始实施。
目前这一步到位的做法，已从2005年版药典实施开始到2010年版的《中国药典》实施，效果到底怎样？我想：从有关专业杂志的相关文章内也可知一、二。
<61> 微生物限度检查本章所提供的检测程序用于测定包括原料药及制剂在内的各种药品中需氧菌数量以及不含有指定的微生物。
如果已有充分的证据证明某种自动化的方法可以给出与本章所提供的方法等效的或更好的实验结果，可以用该方法替代本章所提供的方法。
（最新）美国药典微生物检测精要
美国药典微生物检测精要培训小结一微生物实验室规范重要的控制点：无菌技术、培养基控制、菌种控制、设备操作与控制、数据记录与实验室布局和运作、员工培训等。
1无菌技术：防止和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作方法和管理方法。
可通过无菌环境、灭菌、消毒、卫生要求、无菌操作技术等手段来实现。
2培养基：是微生物实验工作的核心。
包括培养基制备、培养基储存、培养基质量控制。
2.1培养基制备2.1.1根据既定的目的选用正确的培养基2.1.2参考生产商的ＣＯＡ和说明书：关于配制、储存和菌种选用等。
2.1.3所用的水应为去离子水或蒸馏水，应记录用量。
2.1.4成分的称量应用校准过的天平，根据称量量的不同选择合适的天平。
使用清洁的容器和工具（<1051>玻璃器皿清洁）以防外来污染和抑制剂。
应记录称量量。
2.1.5加热帮助溶解时应防止过度加热，通常培养基颜色变深说明加热过度了。
2.1.6灭菌条件：●灭菌参数应验证，验证应同时考虑无菌和培养基生长能力●采用高压蒸汽灭菌或过滤灭菌。
湿热灭菌应考虑装载分布，加热速度过慢会使培养基过度加热，通常为121℃15min，此时间是指培养基温度达到121℃后15min。
●保证最低SAL，在无菌和过度加热之间平衡。
●与污染物分开灭菌●消毒结束后，不应在灭菌柜中储存培养基，过度加热会影响培养基颜色、澄清、pH和凝固能力。
2.2培养基储存2.2.1制备培养基的储存●琼脂培养基易受冷冻影响，低于0℃会破坏凝胶结构。
●应避光避热，密封防止水分蒸发（建议使用螺旋盖的瓶子密封，保存时间长）。
2.2.2培养基融化●不能超过一次，以防过度加热或潜在污染。
●融化可采用水浴、流通蒸汽或微波炉加热。
微波炉加热宜采用少量多次，以防过度。
●培养基融化后在40-50℃水浴中储存不应超过8小时，浇制平皿前应擦干以防污染。
2.2.3培养基标示●培养基名称●批号、制备批号●制备日期、有效期2.2.4有效期确定●根据成分、配方、容器、储存条件等确定●有生长能力试验数据支持2.2.5应在验证过的条件下储存2.2.6重要区域环控用培养基必须●双层包装●最终灭菌，否则进行全数培养及用前检查2.2.7根据当地生物危险品安全程序处置过期培养基2.3培养基质控2.3.1灭菌后培养基检查2.3.1.1生长能力●每批制备的培养基均需进行●测试菌种根据药典，供应商说明书及环境中分离得到●测试不合格应进行调查，如无原因，或无有效纠正措施，不得使用该批号2.3.1.2无菌2.3.1.3pH2.3.1.4容器/平皿的完整性2.3.1.5抑制或指示能力2.3.2定期稳定性检查以确认储存有效期3菌种保藏3.1建立标准程序处理、保存菌种，防止污染和特性变化3.2使用前确认菌种身份和纯度3.3根据生产商说明书复苏菌种，使用接种技术3.4-70℃以下或冷冻干燥保存储备菌种，可延长保存周期3.5开启后不要重新冷冻菌种，剩余部分应弃置3.6传代次数（每接种一次即为一代）不超过5次3.7保藏时间根据具体保藏条件确定4设备维护4.1定期校准、保养4.2定期性能检查4.3定期清洁、消毒5实验室布局和运作5.1防止交叉污染5.2活动分区：无菌、环控样品的处理和培养应在无菌环境中进行5.3当发现微生物生长，后续的工作应转移至“阳性”区5.4环控设备应放置在待取样区域环境中并小心操作5.5应在受控条件下小心取样6样品处理6.1大部分样品、水或环控样品中的微生物对操作、储存环境敏感6.2减少样品，取样与测试间的时间间隔6.3长时间的转移需确认转移条件对测试及样品的影响6.4在无菌条件下，使用无菌技术取样，即使是非无菌样品6.5取样记录：样品信息、取样日期、送样日期、人员/部门、实验室样品接受及确认7培养基培养时间7.1短于3天，用小时表示7.2长于3天，用天表示（上午、下午，相同时间段）8人员培训8.1每个岗位应有相应培训要求，进行上岗前资质确认9实验室文件9.1微生物人员培训和能力确认（上岗资质）9.2设备验证、校准和维护9.3测试中的设备性能（如温度记录）9.4培养基制备、无菌检查、生长能力测试、选择性测试9.5培养基清单与控制9.6根据程序（ＳＯＰ）进行测试的重要数据9.7数据和计算的确认9.8经ＱＡ人员或相应领导审核过的报告9.9超标结果调查10实验室结果维护10.1检测报告至少应包括：●日期●测试样品●微生物检验人员名字●程序编号●测试结果●偏差（如有）●测试参数（设备、菌种、培养基）●管理人员审核签名10.2数据纠错：错误的地方划一横线，签名和日期，必要时说明原因10.3测试结果●应包含平皿计数结果（如有）●数据分析方法应罗列在相关ＳＯＰ中●对粘贴的图表、数据骑缝签名10.4存档：记录应存档并防止丢失，应有记录留存计划11测试结果解释11.1微生物数据有时不容易解释●与人类相关的微生物群落被广泛的用于许多测试●人员污染是始终被关心的问题●样品或环境中的微生物并非均匀分布●微生物检测可变范围大：可能在+/-0.5log10单位左右11.2不符合的结果可能是由2个原因造成的：实验室错误或产品不符合。
美国药典微生物限度检测
61微生物限度检测（MICROBIAL LIMIT TESTS）此章提供方法来检测可能存在的好氧微生物其他制药过程中可能出现的微生物的数量，包括原材料和成品中的。
如果经过验证确认可以得到相同或更好的检测结论，也允许采用自动化的检测方法。
在样品检测过程中须进行无菌操作。
若无特别说明，则“培养（incubate）”一词指在30—35℃的培养箱内培养24至48小时；“生长（growth）”一词用于专门的判定，说明“存在和可能存在活的微生物”。
准备实验 (Preparatory Testing)本章涉及实验结果的有效性取决于：提供的被检测样品本身在实验条件下，被充分证明不会抑制可能存在的微生物的生长。
因此，在准备样品时，需要正规的实验操作和符合要求的实验条件，接种稀释样品到含有以下（微生物）培养物的培养基：金黄色（奥里斯）葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,大肠埃希氏菌（Escherichia coli）, 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa), 和沙门氏菌（Salmonella）。
方法如下：将用肉汤培养基培养24小时后的（微生物）不小于10-3稀释的微生物培养物，加1 ml（微生物）培养液到磷酸(盐)缓冲液(pH 7.2)，液体大豆酪蛋白消化物培养基（Fluid Soybean-Casein Digest Medium），或者液体乳糖培养基（Fluid Lactose Medium）。
相应培养基培养失败则需要采取以下方法更改检测程序：（1）增加稀释液体积，检测样品加入量仍维持不变；或者（2）中和一定数量的干扰因子；或者（3）结合（1）、（2）得出适当条件，使接种物得以生长。
以下是一些物质的成分和浓度，该物质及浓度可用于加入培养基、阻止物质发挥抑菌作用：大豆卵磷脂（soy lecithin, 0.5%）或者聚山梨醇酯20（polysorbate 20, 4.0%）。
USP3461非无菌产品的微生物检验：微生物计数检测
USP3461非无菌产品的微生物检验：微生物计数检测61 非无菌产品的微生物检验：微生物计数检测简介后面所提到的检测都是用于在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
设计这个实验旨在确定药物或制剂是否符合已建立的微生物质量要求规范。
当用作上述目的时，可参考下面的说明，包括所取样品的量及以结果的解释。
该方法不适用于将微生物作为有效成分的产品。
可以运用包括自动化方法在内的替代微生物方法。
但要求已被证明其等价于药典方法。
通用方法在拟定的条件下进行试验，拟定的条件旨在避免待测产品的外在微生物污染。
采取的避免污染的措施必须不影响任何测试中需要披露的微生物。
如果待测产品具有抗菌活性，尽可能取消或者解除这个活性。
如果是用灭活剂，则它的效用和毒性情况必须说明。
如果表面活性物质作为检测样品，则它们对微生物的毒性和与灭活剂的兼容性应作说明。
计数方法按照规定使用膜过滤法或者平板计数法。
最可能数目法（MPN）是微生物计数法中精密度最差的方法。
然而，对于特定的低生物负荷的产品组，可能是最适宜的方法。
方法的选择是基于如产品属性，微生物限度要求等因素进行选择的。
选择的方法必须进行大量的样品检测来判断是否符合规范。
并建立其方法的适用性。
促生长实验，计数方法的适用性和阴性对照总则需建立有样品进行试验的条件下微生物测试的性能状况。
检验条件改变或样品改变时，因影响其测量结果，则应确定其适用性。
试验菌株制备用标准的、稳定的试验菌株悬浮液或者将它们按以下步骤制备。
因使用种子批培养保留技术（种子批技术），则用于接种的可用的微生物从原始的第一代开始继代培养不能超过5代。
且按照表1表所示将每一批细菌和真菌等试验菌株进行独立培养。
表1．试验菌的制备及应用微生物实验菌株的制备促生长有样品的情况下，微生物计数方法的适用性总需氧微生物计数总酵母菌和霉菌的计数总需氧微生物计数总酵母菌和霉菌的计数金黄色葡萄球菌ATCC6538 NCIMB9518CIP4.83 NBRC13276 酪蛋白大豆琼脂培养基或酪蛋白大豆肉汤培养基30-35℃18-24h酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基≤100CFU30-35℃≤3天——酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃≤3天——绿脓假单胞菌ATCC9027 NCIMB8626 CIP82.118 NBRC13275 酪蛋白大豆琼脂培养基或酪蛋白大豆肉汤培养基30-35℃18-24h酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基≤100CFU30-35℃——酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃≤3天——枯草芽孢杆菌ATCC6633 NCIMB8054 CIP52.62 NBRC3134 酪蛋白大豆琼脂培养基或酪蛋白大豆肉汤培养基30-35℃18-24h酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基≤100CFU30-35℃≤3天——酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃≤3天白色念珠菌ATCC10231 NCPF3179 IP48.72 NBRC1594 沙氏-葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基20-25℃2-3天酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃≤5天沙氏-葡萄糖琼脂培养基≤100CFU20-25℃≤5天酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃≤5天沙氏-葡萄糖琼脂培养基≤100CFU20-25℃≤5天黑曲霉ATCC16404 IMI149007 IP1431.83 NBRC9455沙氏-葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄培养基糖琼脂培养基20-25℃5-7天，或直到获得好的芽孢酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃≤5天沙氏-葡萄糖琼脂培养基≤100CFU20-25℃≤5天酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃≤5天沙氏-葡萄糖琼脂培养基≤100CFU20-25℃≤5天使用pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液或者pH7.2磷酸缓冲溶液来制备实验所用的菌悬液。
美国药典USP36微生物限度检查
美国药典USP36微生物限度检查USP36 1117 优良微生物检测规范（中英文1/ 2）2013-08-09 15:30:46| 分类：USP|举报|字号订阅1117 MICROBIOLOGICAL BEST LABORATORY PRACTICES 优良微生物检测规范INTRODUCTION 介绍Good laboratory practices in a microbiology laboratory consist of activities that depend on several principles: aseptic technique, control of media, control of test strains, operation and control of equipment, diligent recording and evaluation of data, and training of the laboratory staff. Because of the inherent risk of variability in microbiology data, reliability and reproducibility are dependent on the use of accepted methods and adherence to good laboratory practices.优良微生物检测规范由一些活动组成，这些活动依赖于几个基本要素：无菌技术、培养基控制、检测用菌株控制、设备操作和控制、完善的记录和数据评估、化验室员工的培训。
由于微生物数据具有天生的不确定性，数据的可靠性和重复性取决于是否使用被接受的方法，以及是否严格遵守化验室规范。
MEDIA PREPARATION AND QUALITY CONTROL 培养基制备和质量控制Media Preparation 培养基制备Culture media are the basis for most microbiological tests. Safeguarding the quality of the media is therefore critical to the success of the microbiology laboratory. Media preparation, proper storage, and quality control testing can ensure a consistent supply of high-quality media.培养基是大多数微生物测试的基础。
美国药典 非无菌产品微生物限度检查
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法1.导言微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和霉菌的定量计数当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按照下述规定进行检验，包括样品的取样量，结果的判断。
本法不适用于活菌制剂的检查，可使用包括自动化法在内的替代方法，需确认其与药典方法的等同性。
2. 通用规程微生物计数环境应能防止外来微生物对供试品的污染。
防止污染的措施不能影响供试品中微生物的检出。
备注：检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
单向气流区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如果供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
若使用了中和剂或灭活剂，需确认其有效性及对微生物无毒性。
供试品制备过程中若使用了表面活性剂，需确认其对微生物无毒性以及与所使用的中和剂或灭活剂的相容性。
3.计数方法计数方法包括薄膜过滤法、平皿法和最可能数法（Most-Probable-Number 简称 MPN)。
MPN 法用于微生物计数时精确度最差，但用于微生物污染量小的供试品，MPN 法可能是最合适的方法。
（MPN法不适用于霉菌的检测，仅在供试品总需氧菌数没有适应计数方法的情况下使用。
）供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法。
所选择的计数方法应能够通过检测足量的供试品，判断与质量标准的符合性。
且该计数方法的适用性须经确认。
4. 促生长实验，计数法适用性试验4.1一般要求在有供试品存在的情况下，所选用的计数方法需能够检测微生物。
若检测程序或产品发生变化可能影响检测结果时，计数方法需重新进行适用性确认。
4.2试验菌液的制备试验菌液：使用试验菌株的标准化稳定悬浮液或按下述规定制备。
按表 1 规定程序分别培养各试验菌液。
菌株：采用适宜的菌种保藏技术（种子批系统），试验用菌株传代次数自主种子批（第 0 代）算起不得超过 5代。
菌液制备：取表 1各试验菌株的新鲜培养物，用 PH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或 PH7.2的磷酸缓冲液制备混悬液。
美国药典微生物试验说明
實驗數據判讀
不合格原因
–實驗室錯誤 –產品失敗 無論上述何種情況，管理階層必須立即被告知
OOS調查
–數據偏離的程度(嚴重性？) –實驗室環境 –取樣方法 –物料的特性(存活的污染微生物？) –留樣的評估
32/9
<1211>滅菌和無菌保證
每批產品不是通過<71>無菌試驗就可得到無 菌保證。
<1209> 滅菌–化學和物理化學指 示劑，及綜合指示劑
<1211> 滅菌與無菌保證
<1222> 最終滅菌藥品–參數放行
<1223> 微生物方法確效
<1227> 藥物的微生物回收率確效
<1231> 製藥用水
<2021> 微生物計數試驗–營養和 膳食補充劑
<2022> 特定菌的微生物檢查–營 養和膳食補充劑
Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests <62> 特定菌的微生物檢查 / Microbiological Procedures for Absence of Specified Microorganisms <71> 無菌試驗 / Sterility Tests <85> 細菌內毒素試驗 Bacterial Endotoxins Test
劑型 (投藥途徑) 口服固體 口服液劑
外用或鼻腔用藥
陰道用藥
直腸用藥 藥品主成分&賦型劑
<61> TAMC [CFU/g or CFU/ml]
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USP36 1117 优良微生物检测规范（中英文1/ 2）2013-08-09 15:30:46| 分类：USP|举报|字号订阅1117 MICROBIOLOGICAL BEST LABORATORY PRACTICES 优良微生物检测规范INTRODUCTION 介绍Good laboratory practices in a microbiology laboratory consist of activities that depend on several principles: aseptic technique, control of media, control of test strains, operation and control of equipment, diligent recording and evaluation of data, and training of the laboratory staff. Because of the inherent risk of variability in microbiology data, reliability and reproducibility are dependent on the use of accepted methods and adherence to good laboratory practices.优良微生物检测规范由一些活动组成，这些活动依赖于几个基本要素：无菌技术、培养基控制、检测用菌株控制、设备操作和控制、完善的记录和数据评估、化验室员工的培训。
由于微生物数据具有天生的不确定性，数据的可靠性和重复性取决于是否使用被接受的方法，以及是否严格遵守化验室规范。
MEDIA PREPARATION AND QUALITY CONTROL 培养基制备和质量控制Media Preparation 培养基制备Culture media are the basis for most microbiological tests. Safeguarding the quality of the media is therefore critical to the success of the microbiology laboratory. Media preparation, proper storage, and quality control testing can ensure a consistent supply of high-quality media.培养基是大多数微生物测试的基础。
《美国药典》(42NF37)1071无菌短货架期产品放行的快速微生物检查法依据风险评估的方法
第一作者简介：刘洪祥，主管药师；研究方向：微生物与生化药学。
Ｔｅｌ：０２２ ２３５１３８２１；１８６９８０３５７５９；Ｅ ｍａｉｌ：ｙａｎｇｊｕｎｓｈｅｎｇ１０＠１６３ ｃｏｍ《美国药典》（４２／ＮＦ３７）＜１０７１＞无菌短货架期产品放行的快速微生物检查法：依据风险评估的方法刘洪祥，李娅男译，白海娇，曹晓云校审（天津市药品检验研究院，天津３０００７０）译者按：随着我国经济和医药产业的发展，《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）作为我国药品的法典也在不断进行修订升级，以实现完善标准体系、提升质量控制、满足临床需求、接轨国际标准等目标［１ ３］。
近年来无菌短货架期产品，如各种细胞和基因产品成为临床研究和疾病治疗的热点［４ ５］，该类产品大多具有个体化生产、低剂量产出、短效期使用、终端产品无法采取灭菌措施等特点［６ ７］，在微生物安全性控制上与其它类产品有着显著的差异性［８ ９］。
现行《中国药典》２０１５年版中针对细菌、霉菌和酵母菌的无菌检测需要１４天，同时检验需大量产品以保证低污染产品检验的准确性。
尽管药典中传统的微生物检验方法是安全可靠的金标准，但现阶段无法满足该类产品质量控制和快速放行的要求。
因此，迫切需要建立科学合理的质量控制手段，以避免生产企业的巨额经济损失和患者的使用安全隐患。
采取改进和创新性的替代方法，弥补现行《中国药典》中微生物检查方法，实现产品微生物的安全性需求势在必行，故本文将《美国药典》于２０１９年１２月新增章节“＜１０７１＞无菌短货架期产品放行的快速微生物检查法：依据风险评估的方法［１０］”译出，以期为短货架期产品安全检查和新版药典增订相关通则及指导原则提供借鉴和参考。
关键词：美国药典；短货架期产品；快速微生物检查法中图分类号：Ｒ９２１ ２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９－３６５６（２０２０）－３－０１９５－７ｄｏｉ：１０ １９７７８／ｊ ｃｈｐ ２０２０ ０３ ００３ＵＳＰ（４２／ＮＦ３７）＜１０７１＞Ｒａｐｉｄｍｉｃｒｏｂｉａｌｔｅｓｔｓｆｏｒｒｅｌｅａｓｅｏｆｓｔｅｒｉｌｅｓｈｏｒｔ ｌｉｆｅｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ａｒｉｓｋ ｂａｓｅｄａｐｐｒｏａｃｈＬＩＵＨｏｎｇｘｉａｎｇ，ＬＩＹａｎａｎ，ＢＡＩＨａｉｊｉａｏ，ＣＡＯＸｉａｏｙｕｎ（ＴｉａｎｊｉｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，Ｃｈｉｎａ）Ａｓｔｈｅｔｒａｎｓｌａｔｏｒ′ｓｃｏｍｍｅｎｔｓ：ＷｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＣｈｉｎｅｓｅｅｃｏｎｏｍｙａｎｄｔｈｅｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，ａｓａｃｏｄｅｆｏｒＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，ｉｓｃｏｎｓｔａｎｔｌｙｂｅｉｎｇｒｅｖｉｓｅｄａｎｄｕｐｇｒａｄｅｄｔｏａｃｈｉｅｖｅｔｈｅｇｏａｌｓｏｆｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｓｙｓｔｅｍ，ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌ，ｍｅｅｔｉｎｇｃｌｉｎｉｃａｌｎｅｅｄｓ，ａｎｄｃｏｎｆｏｒｍｉｎｇｔｏｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｔｈｅｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ，ｓｔｅｒｉｌｅｓｈｏｒｔ ｌｉｆｅｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｓｕｃｈａｓｖａｒｉｏｕｓｃｅｌｌａｎｄｇｅｎｅｐｒｏｄ ｕｃｔｓｗｉｔｈｈｏｔｓｐｏｔｓｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｄｉｓｅａｓｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｈａｖｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｉｎｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｌｏｗ ｄｏｓｅｏｕｔｐｕｔ，ｓｈｏｒｔ ｔｅｒｍｕｓｅ，ａｎｄｔｅｒｍｉｎａｌｐｒｏｄｕｃｔｓｃａｎｎｏｔｂｅｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ，ｗｈｉｃｈｏｆｔｈｏｓｅｐｒｏｄｕｃｔｓｈａｖｅｓｉｇ ｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｗｉｔｈｏｔｈｅｒｔｙｐｅｓｉｎｔｅｒｍｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｓａｆｅｔｙｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇｏｆｂａｃｔｅｒｉａ，ｍｏｌｄｓａｎｄｙｅａｓｔｓｉｎｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ２０１５ｒｅｑｕｉｒｅｓ１４ｄａｙｓ Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ａｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｐｒｏｄｕｃｔｓａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｔｏｅｎｓｕｒｅｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙｏｆｌｏｗ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ ＡｌｔｈｏｕｇｈｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｔｅｓｔｍｅｔｈｏｄｉｎｔｈｅＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａｉｓａｓａｆｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅｇｏｌｄｓｔａｎｄａｒｄ，ｉｔｃａｎｎｏｔｍｅｅｔｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｒａｐｉｄｒｅｌｅａｓｅｏｆｓｕｃｈｐｒｏｄｕｃｔｓａｔｔｈｉｓｓｔａｇｅ Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔｉｓｕｒｇｅｎｔｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｎｄｒｅａ ｓｏｎａｂｌｅｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｍｅｔｈｏｄｓｔｏａｖｏｉｄｈｕｇｅｅｃｏｎｏｍｉｃｌｏｓｓｅｓｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓａｎｄｈｉｄｄｅｎｄａｎｇｅｒｓｔｏｐａｔｉｅｎｔｓａｆｅｔｙ Ｉｔｉｓｉｍｐｅｒａｔｉｖｅｔｏａｄｏｐｔｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅｄａｎｄｉｎｎｏｖａｔｉｖｅａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｓｔｏｍａｋｅｕｐｆｏｒｔｈｅｃｕｒ ｒｅｎｔｍｉｃｒｏｂｉａｌｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｉｎｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，ｔｏａｃｈｉｅｖｅｔｈｅｓａｆｅｔｙｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ Ｔｈｉｓａｒｔｉ ｃｌｅｔｒａｎｓｌａｔｅｓａｎｅｗａｄｄｅｄｃｈａｐｔｅｒｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａｉｎＤｅｃｅｍｂｅｒ２０１９＜１０７１＞Ｔｈｅｒａｐｉｄｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｔｅｓｔｓｆｏｒｒｅｌｅａｓｅｏｆｓｔｅｒｉｌｅｓｈｏｒｔ ｌｉｆｅｐｒｏｄｕｃｔｓ：ａｒｉｓｋ ｂａｓｅｄａｐｐｒｏａｃｈ，ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒ ｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｓｈｏｒｔ ｌｉｆｅｐｒｏｄｕｃｔｓａｆｅｔｙｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｒｅｌｅｖａｎｔｇｅｎｅｒａｌｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓｏｆｔｈｅｎｅｗｅ ｄｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａＫｅｙｗｏｒｄｓ：ＵＳＰ；ｓｈｏｒｔ ｌｉｆｅｐｒｏｄｕｃｔｓ；ｒａｐｉｄｍｉｃｒｏｂｉａｌｔｅｓｔｓ１ 概述依据微生物生长情况对结果作出评判的无菌检查法至少需要１４ｄ的培养周期（见＜７１＞无菌检查法），该法不适用于那些短货架期产品或即制即用产品，即在无菌检查结束前已被使用的产品。
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USP36 1117 优良微生物检测规范（中英文1/ 2）2013-08-09 15:30:46| 分类：USP|举报|字号订阅1117 MICROBIOLOGICAL BEST LABORATORY PRACTICES 优良微生物检测规范INTRODUCTION 介绍Good laboratory practices in a microbiology laboratory consist of activities that depend on several principles: aseptic technique, control of media, control of test strains, operation and control of equipment, diligent recording and evaluation of data, and training of the laboratory staff. Because of the inherent risk of variability in microbiology data, reliability and reproducibility are dependent on the use of accepted methods and adherence to good laboratory practices.优良微生物检测规范由一些活动组成，这些活动依赖于几个基本要素：无菌技术、培养基控制、检测用菌株控制、设备操作和控制、完善的记录和数据评估、化验室员工的培训。
由于微生物数据具有天生的不确定性，数据的可靠性和重复性取决于是否使用被接受的方法，以及是否严格遵守化验室规范。
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〈61〉非无菌产品的微生物检测：微生物计数检测法生长促进试验和计数方法的适用性概述在供试品存在的情况下，必须确立检测微生物的试验能力。
如果引入了可能影响试验结果的在测试性能或产品方面的变更，则必须确认其适用性。
供试菌株的制备使用供试菌株的标准化稳定悬浮液或者按照以下所述制备。
使用菌种保存技术（种子批系统）以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批不超过五代。
按照表1中的描述，分别培养每种细菌和真菌供试菌株。
表1.供试微生物的制备和使用用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲溶液或pH7.2的磷酸盐缓冲液配制供试悬浮液；为使黑曲霉孢子悬浮，可将0.05%的聚山梨醇酯80加入该缓冲液中。
这些悬浮液需在2个小时之内使用，或存放在2o～8o 条件下24小时内使用。
作为制备并稀释黑曲霉或枯草杆菌营养细胞的新鲜悬浮液的替代方法，可制备稳定的孢子悬浮液，然后将适量的孢子悬浮液用于试验接种。
稳定的孢子悬浮液可在2o～8o下保存，保存期经过时间验证。
阴性对照为了确认试验的条件，用所选的稀释液替代供试品阴性对照。
必须没有微生物的生长。
培养基的生长促进对每一批已制备好的培养基和每一批从脱水培养基或根据描述的组分制备出来的培养基进行测试。
在部分/整个平皿内的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基和大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu) 表1中指定的微生物，每种微生物均使用单独一部分/整个平皿培养基。
在平皿内的沙氏葡萄糖琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu)表1中指定的微生物，每种均使用一个单独平皿的培养基。
按照表１中描述的条件进行培养。
对于固体培养基，所获得的生长与标准化接种体的计算值之间的差异因素不大于2。
对于刚刚制备好的接种体，发生的微生物生长与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。
如果出现了与此前从上一个经过测试并通过的培养基批次获得的微生物生长相当、清晰可见的微生物生长，则液体培养基适用。
供试品计数法的适用性样品的制备样品制备方法取决于供试品的物理特征。
如果以下描述的规程不能够被令人满意地证实，则必须开发一个适用的替代规程。
水溶性产品—溶解或稀释（通常制备1:10的稀释液）供试品，于pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液，pH7.2的磷酸盐缓冲液或大豆酪蛋白消化物肉汤培养基中。
如有必要，调整pH值为6至8。
需要时，用相同的稀释剂作进一步稀释。
不溶于水的非脂肪性产品—将供试品（通常制备1:10的稀释液）悬浮于pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液，pH7.2的磷酸盐缓冲液或大豆酪蛋白消化物肉汤培养基中。
可以加入表面活性剂，如1g/L的聚山梨酯80，以帮助难以与水混合的物质悬浮。
如有必要，调整pH值为6至8。
需要时，用相同的稀释剂进一步稀释。
脂肪性产品—溶解于以过滤除菌的豆蔻酸异丙酯，或者将供试品与所需最少量的、经过加热的无菌聚山梨酯80或另一种非抑菌性的无菌表面活性剂进行混合，如有必要，可加热至不超过40o或者在特殊情况下不超过45o。
仔细混匀，如有必要，在水浴锅里中维持该温度。
加入充足数量、经过预热的所选择稀释剂，制成原产品的1:10稀释液。
仔细混匀，同时维持该温度至形成乳化剂所必需的最短的时间。
可以用所选择的含有适当浓度的无菌聚山梨酯80或者另一种非抑菌性的无菌表面活性剂的稀释液，来制备后续的系列10倍稀释液。
液体或固体悬浮微粒状—以无菌操作将供试品转移至一个膜过滤设备或无菌容器中做进一步取样。
使用每个待检容器中的全部内容物或规定数量的一定剂量。
贴剂——去除贴剂的防护面（“释放衬板”）并将它们放置在无菌玻璃或塑料托盘上，将有粘性的一面朝上。
用适当的无菌多孔材料（如：无菌纱布）盖住粘性面，以防止贴剂粘在一起，并将10片贴剂转移到所选的含有灭活剂（如：聚山梨醇酯80和/或卵磷脂）的适量稀释剂中。
振摇供试品至少30分钟。
接种和稀释加入足量的微生物悬浮液到按上述规定制备的样品及对照品（不含检测物）中，以获得一个不多于100 cfu的接种体。
接种体的悬浮液体积应当不超过被稀释供试品体积的1%。
为证明供试品有可接受的微生物回收率，必须使用已制备样品的最低可能稀释倍数来进行检测。
如果由于抗菌活性或低溶解度而无法做到这一点时，必须进一步开发合适的规程。
如果样品对生长的抑制不能避免，可以在中和、稀释或过滤后加入等量的微生物悬浮液。
抗菌活性的中和/去除用制备好的样品按接种和稀释项下的描述稀释，并按供试品微生物的回收率规程培养，将从中回收的微生物数量与从对照品中回收的微生物数量进行比较。
如果生长被抑制（以大于2的因素减少），那么修改特定的计数测试规程以确保结果的有效性。
规程的修改可以包括，例如：1.稀释剂或培养基体积的增加；2.将某个特定或通用的中和剂加合到稀释剂中；3.膜过滤；或4.综合以上措施中和剂——中和剂可以用于中和抗菌剂（见表2）的活性。
最好在灭菌前将它们加入到所选的稀释来论证它们的功效和无毒性。
表2.对干扰物质的常用中和剂/方法如果没有找到合适的中和方法，则可以假定未能分离所接种有机体的原因是供试品杀灭微生物活性。
这个信息帮助指出此物品不太可能被特定微生物种群污染。
然而，有可能供试品只抑制这里所列出微生物中的某些，而并不抑制未包括在供试菌株之中其他微生物或者后者对其不具代表性的那些微生物。
然后，用与微生物生长和具体接受标准相适应的最高稀释倍数进行试验。
供试品中微生物的回收膜过滤—使用标准孔径不超过0.45 µm的膜过滤器。
过滤器材质的类型按以下标准选择，即细菌保留效能不被待检测样品的成分所影响。
对于所列出的每个微生物，单独使用一个膜过滤器。
将按照样品的制备、接种、稀释和抗菌活性的中和/去除项下描述所制备的适当数量的样品（最好相当于1克产品，在cfu数量预计较大时，可减用量）转移至膜过滤器，立即过滤，并用适量的稀释剂冲洗膜过滤器。
为确定总好氧微生物计数（TAMC），将滤膜转移至大豆酪蛋白消化物琼脂培养基的表面。
为确定总酵母菌和霉菌联合计数（TYMC），将膜转移至沙氏葡萄糖琼脂培养基的表面。
按表1中规定培养这些平皿，进行计数。
平板计数法—每种培养基至少进行两次平板计数法，并使用计数结果的平均值。
倾注平板法—在直径为9cm的平皿中，加入按样品的制备、接种、稀释和抗菌活性的中和/去除项下的描述所制备的样品1 mL以及15～20 mL大豆酪蛋白消化物琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基加入至平皿，此两种培养基的温度均保持在不超过45o。
如果使用较大的平皿，琼脂培养基的量也相应地增加。
对于表1中所列出的每一个微生物至少要使用两个平皿。
按表 1 中的指示培养这些平皿。
取每培养基计数的算术平均值，计算在最初的接种体中的菌落数（cfu）数量。
表面铺展法—对于直径为9cm的平皿，倾入15～20 mL、温度约为45o 的大豆酪蛋白消化物琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基至每个平皿中，静置凝固。
如果使用较大的平皿，琼脂的数量也需相应地增加。
干燥平皿，例如，在层流柜或恒温箱里。
对于表1中列出的每个微生物，至少使用两个平皿。
将已称量好的体积不少于0.1 mL、按照样品的制备、接种、稀释和抗菌活性的中和/去除项下的规定所制备的样品，铺展在培养基的表面。
按照倾注培养法项下的规定进行培养和计数。
最大可能数（MPN）法—MPN法的精密度和准确度低于膜过滤法或平板计数法。
所获得的霉菌计数的结果尤其不可靠。
由于这些原因， MPN法被保留用于当没有其它可行方法情况下的总好氧微生物计数。
如果该方法的使用有据可可循，则按如下进行。
按样品的制备，接种和稀释，以及抗菌活性的中和/移除这些项下的描述，制备一系列至少三个连续、每级稀释10倍的产品稀释液。
从每个水平的稀释液中将1克或者1毫升的三等分的试样接种到三管装有9～10毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基的试管中。
如有必要，加入表面活性剂，如聚山梨醇酯80或抗菌灭活剂到培养基中。
因此，如果制备了三水平的稀释液，则会接种九个试管。
在30o～35o温度下培养所有的试管不超过3天。
如果由于供试品的性质导致结果的读数很困难或不确定，则在相同温度下，在同样的肉汤培养基或大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中在同样温度下放置1～2天再次培养，并且使用这些结果。
从表3确定每克或每毫升供试品中微生物的最大可能数。
表3 微生物的最大可能数值结果和说明当确认膜过滤法或平板计数法的适用性时，任何供试微生物的平均计数与在没有产品的情况下，从培养和稀释项下规定的对照组的数值差距必须不超过2。
当确认最大可能数法的适用性时，从接种体得到的计算值必须是在从对照组取得结果的95%置信区间内。
如果上述标准不能用任何一种所叙述的方法符合检测有机体中的一种，那么使用最接近标准的方法和检测条件来检测该供试品。
供试品的测试供试品的检测膜过滤使用能够将滤膜转移至培养基中的过滤设备。
按生长促进测试和计数方法的适用性项下描述的、已经证明适用的方法制备样品，转移合适的量至两个膜过滤器中的每一个，并立即过滤。
按照以下已经证明适用的规程清洗每个过滤器。
对于总好氧微生物计数的测定，转移滤膜中的一个至大豆酪蛋白消化物琼脂培养基的表面。
对酵母菌和霉菌联合计数的测定，转移另一个滤膜至沙氏葡萄糖琼脂培养基的表面。
在温度30o～35o之间培养大豆酪蛋白消化物琼脂培养基的平皿3～5天，并在温度20o～25o之间培养沙氏葡萄糖琼脂培养基的平皿5～7天。
计算每克或每毫升供试品的菌落数（cfu）数量。
当检测贴剂时，分别将样品的制备项下描述的制备品数量的10%过滤通过两个无菌滤膜中的一个。
为总好氧微生物计数将一个滤膜转移至大豆酪蛋白消化物琼脂培养基，以检测总好氧微生物计数，而将另一个滤膜转移至沙氏葡萄糖琼脂培养基，以检测总酵母菌和霉菌联合计数。
平板计数法倾注培养法——使用已经证明适用的、在生长促进测试和计数方法的适用性项下描述的方法制备样品。
对于每种培养基，为每个稀释水平准备至少两个培养平皿。
在温度30o～35o之间，培养大豆酪蛋白消化物琼脂培养基的平皿3～5天，并在温度20o～25o之间，培养沙氏葡萄糖琼脂的平皿5～7天。
选择总好氧微生物的数量不超过250个和总酵母和霉菌的数量不超过50的稀释平板进行计数。
取每培养基计数的算术平均值，并计算每克或每毫升供试品的cfu数量。
表面铺展法——使用已经证明适用的、在生长促进测试和计数方法的适用性项下描述的方法制备供试品。
为每种培养基和每个稀释水平准备至少两个培养平皿和不同程度的稀释液。
对于培养和cfu数量的计算，直接按倾注培养法进行。
最大可能数法使用已经证明适当的、在生长促进测试和计数方法的适用性项下描述的方法制备和稀释样品。
在温度30o至35o之间时，培养所有试管3到5天。
如有必要，则使用已经证实适合的规程再次培养。