荧光和化学发光免疫分析方法
免疫荧光层析法 化学发光
免疫荧光层析法化学发光免疫荧光层析法（Immunofluorescence Assay，简称IFA）和化学发光（Chemiluminescence）是两种常用的检测技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程等领域。
本文将介绍这两种技术的原理、步骤和应用，以及它们之间的区别和优缺点。
免疫荧光层析法是一种利用抗体与特定抗原结合后可发出荧光信号的检测方法。
它的原理是将标记有荧光染料（如荧光素）的抗体与待检样品中的目标抗原结合，形成免疫复合物。
通过荧光显微镜观察，可以检测到目标抗原的存在与否。
这种方法具有高灵敏度、高特异性和无需放射性标记物的优点，被广泛应用于病原微生物的检测、抗体的定量和细胞蛋白的定位等研究领域。
化学发光是一种利用化学反应产生的光信号来检测目标物质的方法。
它的原理是将待检样品中的目标物与标记有化学发光底物的抗体结合，形成免疫复合物。
当加入特定的激发剂后，底物会发生化学反应，产生可见的光信号。
通过光电倍增管或摄像机的检测，可以定量地测量化学发光强度，从而判断目标物的含量。
化学发光方法具有高灵敏度、宽线性范围和较低的背景信号等优点，因此在临床诊断和生物工程领域得到广泛应用。
免疫荧光层析法和化学发光在实验步骤上存在一些差异。
免疫荧光层析法的步骤包括样品制备、抗体标记、免疫反应、洗涤和显微镜观察等。
而化学发光的步骤则包括样品制备、抗体标记、免疫反应、洗涤和化学反应等。
两种方法的原理都是基于抗体与抗原的特异性结合，但在标记物和检测信号的产生上有所不同。
免疫荧光层析法和化学发光在应用上也存在一些差异。
免疫荧光层析法常用于检测细胞表面标记物、病原微生物和抗体等，广泛应用于免疫学研究和临床诊断。
而化学发光常用于检测肿瘤标志物、药物残留和基因表达等，被广泛应用于药物研发和生物工程领域。
两种方法在不同领域有着各自的优势和适用范围。
总的来说，免疫荧光层析法和化学发光是两种常用的生物分析技术，具有高灵敏度、高特异性和广泛应用的特点。
第5章 荧光分析法与化学发光分析法
散射光的影响
瑞利散射光
拉曼散射光
干扰荧光测定，应采取措施消除
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硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
31
5.1.3
荧光分光光度计
32
1. 激发光源
高压氙灯 ——强谱线的连续光谱
连续分布在250-700nm波长范围内，尤其是300-400nm波 长之间的谱线强度几乎相等
汞灯 ——线光谱
高压：近紫外区365nm,398nm，405nm，436nm，546nm，579nm 低压:紫外区，最强254nm
－Cl、－Br、－I等
第三类取代基：－R、－SO3H、－NH3＋等
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3．影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 pH值的影响
荧光熄灭剂的影响
散射光的干扰
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温度和溶剂
温度：温度升高，荧光物质的荧光效率 和荧光强度下降 溶剂：溶剂极性增大，荧光波长随着而 长移，荧光强度增强；溶剂粘度减小， 荧光强度减小
化学发光分析主要用于定量分析。 1．化学发光强度与反应物浓度的关系
I Cl （t）＝ Cl dc A dt
55
2．常用发光试剂
（1）鲁米诺类 （2）光泽精类
（3）钌(Ⅱ)-联吡啶配合物
（4）其它化学发光试剂
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5.2.5 应用与示例
1．无机化合物的分析 可以利用某些具有还原性的无 机阳离子和发光试剂作用对其进行测定；有些离子对 化学发光反应有增强或抑制作用，基于此，可直接测 定此类离子。此外，可利用置换偶合反应间接测定某 些离子。 2．有机化合物的分析 可以利用物质的还原性，直接 被氧化剂氧化发光测定。
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3．液相化学发光
常用的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉 碱、没食子酸、过氧草酸盐等，其中鲁米 诺是最常用的发光试剂 。
化学发光与免疫荧光方法学对比
化学发光与免疫荧光方法学对比一、《化学发光与免疫荧光方法学对比》1.概述化学发光（CL）和免疫荧光（IF）是用于检测特定病原体或病原体的特异性抗体的两种测定方法。
CL和IF之间的最显著差异是不同的技术原理，以及其具有不同的优势和劣势。
下面将比较这两种技术的方法学、特点和限制。
2.方法学对比化学发光和免疫荧光是两种完全不同的化学和物理技术。
（1）化学发光：CL技术使用放射性核素结合到抗体或含有特异性抗原的配体上，将其作为一种探针来检测特定目标物质。
检测物质特异性结合探针后，将其照射到发射波长范围的暗室，从而得到特定的发光细胞图像。
（2）免疫荧光：IF技术通过使用荧光标记抗体或特异性抗原，以可见光范围的荧光作为探针，检测特定的抗原或抗体。
被检测物质与荧光探针结合后，将其照射到可见光范围的暗室，从而得到特定的荧光细胞图像。
3.特点对比（1）CL技术可用于快速检测特定的物质：通过使用核素，可以迅速检测出特定的物质，这种技术不受受体或抗原的数量或特性影响。
（2）IF技术可以更简单、更灵敏地检测出特定物质：在IF技术中，荧光标记的抗体和抗原可以特异性地结合，使得能够更灵敏地检测出特定的物质，且不会受受体或抗原的数量或特性影响。
4.限制对比（1）CL技术存在一定的检测限制：CL技术受探针的数量的影响，抗原和抗体的结合特异性不强，因此无法准确检测受体或抗原的特定性。
（2）IF技术存在一定限度的检测效果：IF技术受荧光标记抗体和抗原的数量以及荧光强度的影响，因此无法准确检测受体或抗原的特定性。
综上所述，化学发光和免疫荧光有许多不同的方法学特点和限制，因此它们有不同的优势和劣势。
取决于检测病原体的要求，可以根据检测目标的特点，选择适合自己的技术来使用。
化学发光与荧光免疫技术及仪器与分析
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
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3．过碘酸盐氧化法
直接偶联
标记物可用发光剂或催化剂，适用于芳香伯胺或脂肪 伯胺发光剂，标记方法稳定标记物不易脱落，但此法不 适用于无糖基的蛋白质和含有糖基但氧化后会影响免疫 学活性的蛋白质。
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
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4．戊二醛法
间接偶联
氨基 芳香伯胺基
2．眯唑类化合物 较常用的是2，4，6-三苯基咪唑，即洛粉碱 (lophine)。
3．吖啶酯类 典型代表是N，N-二甲基二吖啶硝酸酯，即光泽精 (1ucigenin)。
4．苯酚类化合物 其中主要有邻苯三酚，即焦性没食子酸。 5．芳香草酸酯类 主要有双-(2，4，6，-三氯苯基)-草酸酯(TCPO)和 双-(2，4-二硝基苯基)-草酸酯(DNPO)。 6．(金刚烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物
熟悉电化学发光免疫分析的基本原理和标记物， 时间分辨荧光免疫分析法的基本原理及其标记物和螯 合物。
了解荧光偏振免疫分析法的基本原理和技术特点， 化学发光免疫分析的临床应用
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
3
第一节 化学发光免疫分析技术
基本原理 反应的底物 标记方法 反应类型 相关仪器
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
11
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
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三、标记方法
按照标记物的应用:
化学标记 生物标记
化学标记: 用于化学发光(酶)免疫测定
➢直接用发光物质(如鲁米诺、吖啶酯类等)标记抗体或抗原
➢以催化剂(如HRP、GOD等)和／或协同因子(如ATP、 NAD等)标记抗体或抗原
反应速度
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法荧光和化学发光免疫分析方法是一种常用的生物分析技术，广泛应用于生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域。
本文将详细介绍荧光和化学发光免疫分析方法的原理、应用以及优缺点等方面。
首先，荧光免疫分析方法利用标记有荧光物质的抗体或抗原与待检测物相互作用，通过检测荧光信号来定量分析目标物。
其原理是当荧光标记物被激发后，会发射出特定波长的荧光信号，利用荧光光谱仪测量荧光强度来确定目标物的浓度。
荧光免疫分析方法具有高灵敏度、高选择性和多样性的优点，可用于检测蛋白质、核酸、细胞等生物分子。
化学发光免疫分析方法则是利用特定的化学反应产生荧光信号来检测目标物。
常用的化学发光免疫分析方法有酶免疫分析和化学发光免疫分析。
在酶免疫分析中，酶标记的抗体或抗原与待检测物相互作用后，加入底物，酶催化底物发生化学反应产生荧光信号。
而化学发光免疫分析则是通过特定的化学反应产生激发态分子，激发态分子发生无辐射跃迁产生荧光信号。
化学发光免疫分析方法具有高灵敏度、快速、稳定性好的特点，常用于临床诊断和药物研发等领域。
荧光和化学发光免疫分析方法在生命科学研究中有广泛的应用。
例如，在蛋白质研究中，可以利用荧光免疫分析方法检测蛋白质的表达水平、相互作用以及酶活性等。
在细胞研究中，荧光免疫分析方法可以用于检测细胞的分子分布、内源性蛋白质的表达和细胞信号传导等。
此外，荧光和化学发光免疫分析方法还可以用于检测病原体、药物残留和环境污染物等。
荧光和化学发光免疫分析方法具有许多优点。
首先，这些方法具有高灵敏度，可以检测到非常低浓度的目标物。
其次，这些方法具有高选择性，能够在复杂的样品中准确地检测目标物。
此外，荧光和化学发光免疫分析方法还可以实现高通量分析，节省时间和成本。
然而，荧光和化学发光免疫分析方法也存在一些缺点。
首先，荧光信号受到背景干扰的影响，可能导致误差的产生。
其次，荧光标记物的稳定性较差，容易受到光照和温度等因素的影响。
不同方法学白介素6标准
不同方法学白介素6标准白介素6检测的不同方法学探讨白介素6（IL-6）是一种多功能细胞因子，在免疫调节、炎症反应以及多种疾病的发生和发展过程中起着重要作用。
因此，准确检测白介素6的含量对于基础研究和临床应用具有重要意义。
本文将探讨几种不同的白介素6检测方法，并分析其优缺点。
1. 酶联免疫吸附法（ELISA）酶联免疫吸附法是一种常用的检测白介素6的方法，其原理是利用酶标记的抗体与待测样本中的白介素6结合，形成酶-抗体-抗原复合物，然后通过底物显色反应来定量检测白介素6的含量。
这种方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，适用于大批量样本的检测。
但是，ELISA方法也存在一些局限性，如操作过程中容易受到温度、时间等因素的影响，导致结果的不稳定性。
2. 放射免疫分析法（RIA）放射免疫分析法是一种利用放射性同位素标记的抗体来检测白介素6的方法。
这种方法具有灵敏度高、准确性好的特点，尤其适用于微量白介素6的检测。
然而，由于RIA方法涉及到放射性物质的操作和处理，对实验条件和操作人员的要求较高，且存在一定的安全隐患，因此在一般实验室中的应用受到一定限制。
3. 化学发光免疫分析法（CLIA）化学发光免疫分析法是一种基于化学发光原理来检测白介素6的方法。
该方法利用化学发光物质标记的抗体与白介素6结合后产生的化学发光信号进行定量检测。
CLIA方法具有灵敏度高、线性范围宽、操作简便等优点，且无需使用放射性物质，因此在实际应用中得到了广泛推广。
但是，CLIA方法的试剂成本相对较高，且发光信号的稳定性可能受到多种因素的影响。
4. 荧光免疫分析法（FIA）荧光免疫分析法是一种利用荧光标记的抗体来检测白介素6的方法。
该方法通过荧光信号的强弱来定量检测白介素6的含量，具有灵敏度高、特异性好的特点。
同时，FIA方法还可以实现多色荧光的同时检测，适用于复杂样本中多种细胞因子的同时测定。
但是，FIA方法需要专业的荧光检测设备，且荧光信号可能受到光漂白等因素的影响。
化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析是一种常用的生物分析技术，其原理是利用化学发光反应检测目标分析物。
该技术主要应用于生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域。
化学发光免疫分析的步骤如下：
1. 样品处理：将待测样品进行处理，通常包括样品的稀释、蛋白质提取、核酸提取等步骤，以满足后续分析的要求。
2. 特异性结合：将待测样品与特异性抗体结合，这是化学发光免疫分析的关键步骤。
特异性抗体能够与目标分析物结合，形成抗原-抗体复合物。
3. 化学发光：在抗原-抗体复合物形成后，加入一种化学发光底物，底物与复合物发生化学反应，生成激发态分子或产生紫外、可见光等发光物质。
4. 光学检测：利用光学检测系统，测量发光信号的强度或荧光信号的荧光强度。
一般情况下，强度与待测样品中目标分析物的含量成正比。
化学发光免疫分析的优点是灵敏度高、特异性强，且能够同时分析多个目标分析物。
它在临床诊断中广泛应用，例如检测某些疾病标志物、药物浓度和病原微生物等。
此外，化学发光免疫分析还可用于药物研发中的蛋白质相互作用研究、基因表达分析等。
总之，化学发光免疫分析是一种重要的生物分析技术，通过特异性抗体与荧光底物的配对应用，实现对目标分析物的定量检测，具有灵敏度高、特异性强和多重分析的优势。
化学发光法检测分析中的应用
化学发光法检测分析中的应用化学发光法是一种应用广泛的分析方法，其可以被用于各种领域的检测分析，如医学、药学、食品科学、环境科学等等。
通过化学反应方式发生的化学发光，在定量和定性分析中都具有重要的应用。
本文将介绍化学发光法的检测原理、检测方法和应用案例。
一、检测原理化学发光是指某些物质在化学反应中释放出光的现象。
常见的化学发光反应有氧化还原反应、酶催化反应、亚硝胺反应等等。
这些化学反应所释放出的光与反应物的浓度成正比关系，因此可以通过测量光强来确定反应中物质的浓度。
二、检测方法1. 酶促发光法酶促发光法是基于酶催化反应和化学发光原理的检测方法。
此方法为生物技术和生物医学领域应用广泛的检测方法。
该方法主要采用双酶法，将触媒化学发光底物催化剂和酶学底物相互作用产生化学反应链，从而放出化学荧光。
通过测量荧光的强度，可以得出样品中酶的含量。
2. 气相色谱发光检测法气相色谱发光检测法是一种将气相色谱技术与发光检测方法相结合的新型检测方法。
该方法首先将样品通过气相色谱柱进行分离，然后在检测器中通过光的激发作用产生化学发光，通过检测这种化学发光的强度进行分析和检测。
3. 化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法是一种基于化学反应和免疫学原理相结合的检测方法。
该方法将样品与已知抗原或抗体进行反应，然后添加酶标记抗体或抗原，通过荧光或化学发光检测法分析产生的化学反应。
该方法可快速、准确、灵敏地检测出各种生物分子。
三、应用案例1. 生化污染的检测生化污染是指非法添加和假冒伪劣的生化制品的行为，而定量测定小分子抗生素中的残留成分是评价生化制品较重要的一个指标。
李梅等人通过化学发光法检测分析，发现处于贮存温度较高或贮存时间过长的青霉素、链霉素等抗生素，其残留量有较大增加，因此化学发光法被广泛用于生化污染的检测。
2. 药物纯度及含量的检测药学中常常需要检测药品的纯度及含量。
王丽等人通过化学发光法检测氨氯地平的药剂及体外生物样品，发现药品残留量与样品的浓度呈线性关系，因此化学发光法可被用于药物纯度及含量的检测。
(完整版)荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应, 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原.由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。
本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。
一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质,并通过免疫应答排除抗原性异物,以维持机体生理平衡的功能。
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康.特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制,针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体,只能对同一种抗原发挥免疫功能.而对变异或其他抗原毫无作用。
1、抗原1。
1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答（免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。
抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上.1。
2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。
如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1。
3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团,它直接决定免疫学反映的特异性.抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。
因此,抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。
2、抗体2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。
2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。
化学发光免疫测定、酶联免疫、时间分辨免疫荧光三种方法检测乙肝
时间分辨免疫荧光与化学发光法、酶联免疫法测定乙肝标志物的比较摘要目的: 比较化学发光免疫测定（CL）、酶联免疫（EIA）与时间分辨免疫荧光（TRFIA）三种方法检测乙肝病毒免疫标志物的优缺点。
方法: 用上述三种方法的检测试剂及仪器对189例临床血清标本分别进行检测，然后进行结果分析。
结果: 三者对乙肝表面抗原的检测灵敏度均达到了0.1ng/ml。
对HBcAb的测定，以CL的灵敏度最高，ELISA最低。
对表面抗体、E抗原及E抗体的检测，相互符合率均在95%以上，但对核心抗体的检测符合率，TRFIA与CL为83.23%，TRFIA与EIA为85.19%。
结论: 三种方法的检测性能相差不大，但操作性各有特点，应按各实验室具体情况加以选择。
关键词：化学发光法，酶联免疫试验，时间分辨荧光免疫测定本文作者:肖征周薇薇白立彦赵莉萍parison of chemiluminescence, ELISA and time-resolved fluoroimmunoassay in detecting Hepatitis B markers肖征，副主任医师，副教授周薇薇，主管技师白立彦，主管技师赵莉萍，主管技师解放军总医院微生物科，100853Zheng Xiao, Weiwei Zhou, Liyan Bai, Liping ZhaoGeneral Hospital of PLA, Beijing, 100853 PRCAbstractSubject:To pare three deferent assays to see their abilities in detecting hepatitis B markers.Methods：By using Chemiluminescence (CL), ELISA and Time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA), 189 serum samples were tested for hepatitis B markers, then the results were analyzed.Results:The three assays all can detect as low as 0.1ng/ml of HBsAg. But in HBcAb, The CL showed the highest sensitivity, ELISA showed the lowest sensitivity. The coincidences of the three methods in detecting HBsAb, HBeAg, and HBeAb are normally above 95%, but for HBcAb, the coincidence was 83.23% between TRIF and CL, and 85.19% between TRIFA and EIA.Conclusion:There were not much difference among these three methods regarding their abilities in detecting hepatitis B markers, but the maneuver flexibilities of each method differed a lot. One should consider his own lab's situation before making choice.Key words:chemiluminescence, ELISA, time-resolved fluoroimmunoassay自二十世纪七十年代以来，许多高灵敏度的测定方法应用于临床免疫学检测。
化学发光免疫分析方法
化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。
其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析。
化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。
化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。
免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。
化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。
待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。
一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为 3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。
（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。
目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。
1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。
鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。
在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。
因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。
酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。
鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。
鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。
2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。
免疫化学发光法
免疫化学发光法免疫化学发光法是一种具有高灵敏度、高特异性的免疫分析方法，在生物医学领域得到了广泛应用。
下面是关于免疫化学发光法的各个方面的介绍。
1.直接法直接法是一种简单的免疫化学发光技术，通过将特异性抗体与发光标记物直接结合，形成免疫复合物，然后测定复合物发出的光强度，从而实现对目标分子的定量检测。
直接法的应用范围广泛，如肿瘤标志物、病毒和细菌等微生物的检测。
使用直接法时需要注意保证抗体的特异性，以及避免非特异性结合的影响。
2.间接法间接法是通过将特异性抗体与酶或化学发光物质结合，形成酶或化学发光标记的抗体，然后将该抗体与目标分子反应，形成免疫复合物，最后加入相应的底物或激发剂，根据发光强度实现对目标分子的定量检测。
间接法的灵敏度较高，适用于多种生物分子的检测。
需要注意的是，要确保抗体的特异性以及发光标记物的稳定性。
3.竞争法竞争法是一种免疫化学发光技术，通过将特异性抗体与目标分子和发光标记的竞争性抗体结合，形成免疫复合物，然后测定复合物发出的光强度，实现对目标分子的定量检测。
竞争法的应用范围包括激素、病毒和肿瘤标志物等生物分子的检测。
使用竞争法时需要注意保证竞争性抗体的特异性，以及避免非特异性结合的影响。
4.夹心法夹心法是一种免疫化学发光技术，通过将特异性抗体与目标分子和发光标记的抗体分别结合，形成夹心状的免疫复合物，然后测定复合物发出的光强度，实现对目标分子的定量检测。
夹心法的灵敏度较高，适用于多种生物分子的检测。
需要注意的是，要确保抗体的特异性和发光标记物的稳定性。
5.斑点免疫法斑点免疫法是一种将特异性抗体或抗原点状固定在支持物上的免疫分析方法。
在斑点免疫法中，待测样品中的目标分子与已固定的抗体或抗原相互作用，形成免疫复合物，然后加入发光标记物，形成点状发光。
通过测量发光强度，实现对目标分子的定量检测。
斑点免疫法的优点是灵敏度高、特异性强、操作简便，适用于多种生物分子的检测。
需要注意的是，要确保固定化抗体或抗原的特异性和稳定性。
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法荧光和化学发光免疫分析方法是现代生物医学研究和临床诊断中常用的分析方法。
这两种方法在原理和应用中有一些差异，但都具有高灵敏度、高选择性和高自动化程度的特点。
以下将详细介绍荧光和化学发光免疫分析方法的原理、应用和优缺点。
荧光免疫分析方法是基于荧光分子的发射特性进行分析的一种方法。
其原理是，通过标记抗体或抗原的荧光物质，使其具有荧光，并与待测物发生特异性的免疫反应。
然后，通过荧光测定仪器对免疫反应产生的荧光进行检测和分析。
荧光免疫法具有高灵敏度、高选择性、多样化的荧光标记物选择以及可通过多色荧光分析多个指标等特点。
因此在生物医学研究、肿瘤标志物筛查、病毒感染和免疫补体等方面具有广泛的应用。
荧光免疫分析方法主要分为直接荧光免疫分析和间接荧光免疫分析。
直接荧光免疫分析通过将荧光标记物直接结合到抗体或抗原上，实现荧光信号的检测和分析。
间接荧光免疫分析则是先将抗体与细胞或蛋白质结合，然后再用荧光标记的二级抗体结合到一级抗体上，以增强荧光信号。
这两种方法各有优缺点，可以根据具体需要选择使用。
化学发光免疫分析方法是基于化学发光反应进行分析的一种方法。
其原理是，在特定的化学反应条件下，荧光标记的抗体或抗原与待测物发生免疫反应，产生化学发光信号。
然后通过化学发光仪器对化学发光信号进行检测和分析。
化学发光免疫方法具有高灵敏度、快速、特异性高、背景干扰低等优点，因此在临床诊断和分子生物学研究中得到广泛应用。
化学发光免疫分析方法主要分为催化化学发光和基因工程发光两种类型。
催化化学发光是通过特定的酶促发光底物，在酶的作用下产生化学发光信号。
催化化学发光免疫分析方法常用于免疫分析和临床诊断。
基因工程发光则是通过将荧光基因植入生物体内，利用生物体自身的酶促发光反应产生化学发光信号。
基因工程发光免疫分析方法主要用于分子生物学研究领域。
荧光和化学发光免疫分析方法在临床诊断和生物医学研究中具有广泛的应用。
它们可以用于检测血液中的肿瘤标志物、感染性疾病的病原体抗原和抗体、免疫系统功能等指标。
常用的抗原抗体检测方法
常用的抗原抗体检测方法抗原抗体检测是生物医学领域中常见的技术手段，主要用于检测样品中是否含有特定的抗原或抗体。
以下是几种常用的抗原抗体检测方法：1、酶联免疫吸附法（ELISA）：这种方法利用酶作为标记物，与抗原或抗体结合，通过酶催化底物反应产生颜色变化，从而检测抗原或抗体的存在。
ELISA 方法具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，因此在临床诊断、生物制品检测等领域广泛应用。
2、免疫荧光技术：该技术通过荧光物质标记抗原或抗体，利用荧光显微镜观察荧光信号，检测抗原或抗体的存在。
免疫荧光技术具有高灵敏度、高特异性、无放射性等优点，常用于组织切片、细胞表面抗原或抗体的检测。
3、放射免疫分析法：这种方法利用放射性同位素标记抗原或抗体，通过与样品中的抗原或抗体结合后，用放射性检测器检测放射信号，从而确定抗原或抗体的浓度。
放射免疫分析法具有较高的灵敏度和特异性，但放射性物质可能对环境和人体健康造成影响，因此使用时需特别注意安全问题。
4、胶体金免疫层析法：该技术利用胶体金标记抗原或抗体，通过与样品中的抗原或抗体结合后，利用层析原理将结合物分离并富集，再用光学仪器检测胶体金颗粒的聚集程度，从而判断抗原或抗体的存在。
胶体金免疫层析法具有简便、快速、可视化等优点，常用于临床床快速诊断和食品安全等领域。
5、化学发光免疫分析法：这种方法利用化学发光物质标记抗原或抗体，与样品中的抗原或抗体结合后，利用化学反应产生光信号，通过检测光信号的强度确定抗原或抗体的浓度。
化学发光免疫分析法具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，因此在临床诊断和生物制品检测等领域应用广泛。
这些方法各有特点和使用范围，选择合适的抗原抗体检测方法要根据具体实验条件和要求而定。
同时，为保证检测结果的准确性和可靠性，操作过程中需遵循规范，避免污染和交叉反应等问题的发生。
荧光和化学发光分析法
P15
02
A 跃迁的类型 n →π* εmax＜100 平均寿命10-5~10-7 s； π→π* εmax≥104 平均寿命10-7~10-8 s π*→π 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型，具有π*→π 共轭双键的分子才能发射较强的荧光。 2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系 荧光的产生是分子先经历π→π* 或n →π* 激发，然后经振动弛豫或其他非辐射跃迁再发生π* →π 或π* → n 而得到荧光。
光源
样品池
激发 单色器
检测器
数据处理 仪器控制
发射 单色器
斩波器（磷光镜）
利用荧光和磷光发射寿命的差别
通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。
2、定量方法
*
定量依据
定量分析方法
2.1.4 定量分析方法
*
1、定量依据 荧光强度 If 正比于吸收的光强度 Ia 和荧光量子产率Φ ： 由朗伯-比耳定律得： 荧光强度 If ：
外转换：激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而损失能量回到基态的非辐射跃迁。
02
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
2.1.1.1 荧光及其产生
*
（1）. 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态各振动能级，发射时间约为10-7～10-9 s 。 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。 e 2、辐射跃迁
实验条件对荧光强度的影响
溶液黏度和温度 黏度大，温度低，可减小碰撞引起的荧光熄灭，荧光强度增大。 温度升高，外转换的几率增加，荧光强度降低。
溶液的PH值 不同PH值下，荧光分子存在形式不同。
Cary Eclipse 荧光分光光度计
2.1.3 仪器装置
化学发光免疫分析方法.
为85.5％。Magliulo 等［20］建立了牛奶中黄曲霉毒素M1的化学发光酶
免疫分析方法，通过将黄曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，
通过酶标二抗在含有鲁米诺的基板上进行检测。该方法的最低检测限为
1 pg/mL，且板间板内数据的变异系数均低于9％，回收率在96％～
122％之间。 Lin 等［21］建立了农产品中黄曲霉毒素B1 的化学发光免 疫分析方法。该方法线性检测范围在0.05～10 ng/g 之间 ，检测灵敏度 为0.01 ng/g，板间及板内变异系数分别为12.2％及 10.0％。 农产品中样 品添加回收率在79.8％～115.4％之间。 同时， 将建立的分析方法与黄 曲霉毒素商品化酶联免疫试剂盒进行了相关性试验，相关系数为
菌素B1 的 ELISA 方法相比，其方法灵敏度提高了10 倍。 且通过样品的
添加回收率试验表明其有良好的回收率，其分析结果与ELISA 分析方法
与 HPLC 方法有良好的相关性。
Yang等［17］建立了食品中葡萄球菌肠毒素B（SEB）的碳纳米管的化
学发光免疫分析方法，通过将SEB 抗体吸附在碳纳米管表面 ， 然后将抗
方面报道还有Perschel 等［13］通过化学发光免疫分析对原发性醛固酮
过多症（PHA）进行快速筛选， Tudorache等［14］利用磁颗粒免疫支
持液膜方法（m-ISLMA）检测唾液中的孕酮含量，Iwata 等［15］利用双
夹心化学发光免疫分析方法测定血浆中内皮素－1的含量等。关于这方
面的应用，化学发光免疫分析方法应用的最为广泛，正是在医学检测方
种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点是反应速度
快，在很短时间内提供正确可靠的结果。在它的分子结构中有两个重要
发光法检测抗体
发光法检测抗体引言：抗体是一种特殊的蛋白质，具有高度的特异性，可与特定的抗原结合。
在生物医学研究中，抗体的检测十分重要，可以用于诊断疾病、监测治疗效果以及研究生物分子的功能等。
发光法是一种常用的抗体检测方法，能够通过测量物质发出的光来确定抗体的存在与否。
本文将详细介绍发光法检测抗体的原理、方法和应用。
一、发光法检测抗体的原理发光法检测抗体的原理基于化学发光反应。
常用的发光试剂有辉光素、琥珀酰亚胺酯、ATP等。
在发光试剂的作用下，抗体与抗原结合，形成特异性的免疫复合物。
随后，加入发光试剂，触发化学反应，产生发光。
发光强度与抗体的浓度成正比，通过测量发光强度的变化，可以定量检测抗体的含量。
二、发光法检测抗体的方法1. 酶免疫发光法酶免疫发光法是一种常用的发光法检测抗体的方法。
首先，在试验物质中加入抗原和抗体，形成特异性的免疫复合物。
然后，加入酶标记的二抗，与抗体结合形成二抗-抗体复合物。
最后，加入发光底物，触发酶催化反应，产生发光信号。
通过测量发光强度，可以确定抗体的存在与否。
2. 化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法是一种高灵敏度的发光法检测抗体的方法。
该方法利用化学荧光物质的特性，在特定条件下触发发光反应。
首先，在试验物质中加入抗原和抗体，形成特异性的免疫复合物。
然后，加入化学发光底物，触发化学反应，产生发光信号。
通过测量发光强度，可以准确检测抗体的含量。
三、发光法检测抗体的应用1. 临床诊断发光法检测抗体在临床诊断中有着广泛的应用。
例如，可以通过检测患者体内特定抗体的含量，判断某种疾病的存在与否。
同时，发光法还可以用于监测疾病的治疗效果，评估药物疗效以及预测疾病的进展。
2. 生物学研究发光法检测抗体在生物学研究中也扮演着重要角色。
例如，可以用于研究蛋白质的相互作用、信号转导以及细胞凋亡等生物过程。
此外，发光法还可以用于检测细胞内特定分子的定位和表达水平，帮助研究人员深入了解生物体内的分子机制。
化学发光基础临床应用
化学发光基础临床应用化学发光技术是一种利用物质发光原理的分析技术，广泛应用于生物医学领域。
通过化学反应产生的荧光信号，可以用于检测生物分子、细胞和组织，并在临床诊断、治疗和研究中发挥重要作用。
一、化学发光的基本原理化学发光是指物质在化学反应过程中吸收能量并发射光线的现象。
其基本原理是通过激发荧光染料或底物，使其处于激发态，随后发生光致电荷转移或荧光共振能量转移等过程，最终释放光子并发光。
化学发光技术具有高灵敏度、快速响应、不易被干扰等优点，逐渐成为生物医学领域的重要工具。
二、化学发光在临床诊断中的应用1. 荧光标记检测：利用荧光染料或荧光标记抗体、核酸等生物分子，可以实现对血液、尿液、组织等样本中特定分子的高灵敏检测，用于疾病的早期诊断和病理分析。
2. 免疫分析：化学发光免疫分析技术（CLIA）是目前临床常用的方法之一，通过荧光标记的抗原和抗体对，可以检测血清中的病毒、细菌、肿瘤标志物等，快速准确地确定疾病诊断和治疗方案。
3. 基因分析：利用化学发光的核酸探针技术，可对基因型、基因表达水平等进行检测，广泛应用于遗传病筛查、肿瘤基因诊断、药物代谢基因鉴定等方面。
三、化学发光在临床治疗中的应用1. 光动力疗法：利用荧光染料或光敏药物在特定波长下产生活性氧等，对癌细胞进行灭活，达到治疗作用。
光动力疗法作为一种微创治疗手段，已在肿瘤治疗中取得了一定的效果。
2. 荧光引导手术：通过荧光染料标记肿瘤组织，结合手术中的光源设备，可以帮助医生准确定位肿瘤边缘和淋巴结转移等，提高手术切除的准确性和成功率。
四、化学发光在临床研究中的应用1. 细胞成像：利用荧光标记细胞内的特定组分或功能蛋白，可以实现对细胞结构和功能的动态观察，为生物学研究提供重要信息。
2. 药物筛选：化学发光技术可以应用于高通量药物筛选平台中，快速评估药物的毒副作用、生物效应、代谢动力学等，为新药研发提供支持。
综上所述，化学发光技术作为一种先进的分析技术，已在临床诊断、治疗和研究中展现出广阔的应用前景。
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荧光和化学发光免疫分析方法
免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性 反应， 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的 特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析 是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。
通常反应体系受垂直偏振光激发后，在与激发光呈适当角度处用第二个偏振 器测量发射荧光强度，其偏振面既可垂直定位也可水平定位，在测定时样品中抗原 浓度越低产生的荧光抗原抗体复合物就越多，游离的荧光标记抗原越少，反之亦然，荧光抗原抗体复合物越多，偏振光就越强。根据荧光偏振的改变测定标本中抗原的浓度，偏 振光的强度与样品中抗原的浓度呈反比，用已知浓度的样品制备标准曲线，未知浓 度的样品则可通过与标准曲线比较得出分析结果与传统荧光分析相比 ，具有一些优点，如均相测量方案，易于快速进行，荧光标记物质半衰期长，结果 准确等。 但是由于FPIA是针对相对分子质量的大小进行测量的，
在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部 位。
2、分类
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传统的荧光免疫分析受到散射光、样品的背景荧光和荧光淬灭等因素的干扰 ，分析灵敏度较低。在这个背景下，两种现代荧光免疫分析方法迅速发展。荧光偏 振免疫分析法就是其中之一。它以其快速、精确和特异的优势很快便为人们广泛接 受。时间分辨荧光免疫分析是另一种现代荧光免疫分析技术。
2、分类
非标记免疫分析技术：免疫扩散、免疫电泳
标记的免疫分析技术：酶免疫分析、放射免疫分析、其它免疫分析法（荧光 免疫技术、胶体金免疫技术、发光免疫技术和铁蛋白免疫技术等）
3、免疫标记技术
3.1基本原理：采用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原 抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的测定，达到对免疫反应进行监测的目的 。
2.1直接化学发光免疫分析 (Direct chemical luminescence immunoassay, DCLIA)
基本原理：
用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反 应后，形成固相包被抗体-待测抗原吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶 酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。
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因此，对本身分子很大的物质不适合采用此方法。
（2）应用
FPIA技术在很早时便有应用于抗生素（庆大霉素）和抗癫痫药（苯妥英钠） 浓度测定的报道，人们也将之用于类固醇、儿茶酚胺、高半胱氨酸等物质的体内分 析。尤其适用于血清中或尿中微量半抗原的测定。FPIA也可用于中药和天然药物的 检测领域等。
1、抗原
1.1抗原的定义
抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。
抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。
1.2抗原的分类
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体外抗原抗体反应又称血清学反应
第一阶段为抗原和抗体的特异性结合，需时短，几秒至几分钟，无可见现象 出现。
第二阶段，可见反应阶段，表现为凝集、沉淀、细胞溶解等，时间较长，历 时数分钟、数小时以致数天
4、抗原抗体结合的特点
（1）抗原抗体结合具有高度特异性，即一种抗原分子只能与由它刺激所产生 的抗体结合而发生反应。抗原与抗体两者为非共价键结合，为可逆反应
四、化学发光免疫分析
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1、定义
化学发光免疫分析(Chemi-luminescence immunoassay, CLIA)是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体 的新型标记免疫分析技术。
抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞 ，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。
因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的 物质基础。
2、抗体
2.1抗体的定义
抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异 性结合的球蛋白。
目前用于TRFIA的三价稀土离子主要为镧系离子，其中铕离子最为常用。免疫 反应后形成的抗原-抗体铕标记物复合物在弱碱性缓冲液中经激发光激发所发生的荧光信号甚弱，主要因为 水是稀土离子产生荧光的淬灭剂，这时须加入一种含有β-二酮体(βNTA)、三辛基氧化膦(TOPO)、Triton X100、醋酸和邻苯二甲酸氢钾的酸性溶液（pH值2~3），使稀土离子从鳌合物中解离 下来。游离的三价铕离子在TOPO协同下，与β二酮体形成一种新的鳌合物，非离子型的表面活性剂可以有效地将复合物形成大分
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子的微囊，微囊的内侧为疏水性基团能有效地溶解脂溶性的βNTA；而其外层为亲水性基团，可以和水分子结合，这种微囊可最大限度地将能量 传递给Eu3+， 从而阻断了βNTA吸收能量传递给水所产生的淬灭效应，使原来的荧光信号增强近100万倍，大大 有利于荧光测量，因此我们也称之为“解离-增强的镧系荧光免疫分析”。
（4）合适的pH是抗原抗体反应必要的条件之一。pH过高或过低可直接影响抗 原和抗体的理化性质。
二、免疫分析
1、定义
免疫分析法利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白 质、微生物等）的分析方法。
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（2）抗原与抗体的结合，在一定浓度范围内，只有当两者分子比例合适时， 才出现可见反应；以沉淀反应为例，分子比例合适，沉淀物产生既快又多，体积大 。分子比例不合适，沉淀物产生少，体积小，或不产生沉淀物。
（3）特异性抗原和抗体有相对应的极性基，抗原和抗体的特异性结合，也就 是这些极性基的相互吸附。抗原和抗体结合后就由亲水性变为疏水性，此时易受电 解质影响。如有适当浓度的电解质存在，就会使它们失去一部分负电荷而相互凝聚 ，于是出现明显的凝聚或沉淀现象。若无电解质存在，则不发生可见反应。
稀土元素标记物体积小：为原子标记，标记后不会影响被标记物的空间立体结构， 既保证了被检测物质的稳定性，又可实现多位点标记，标记物稳定，可以保存1~2 年，克服了同位素以及酶标等不稳定的缺点。
（3）应用
TRFIA多应用于临床以及免疫、生物分析领域。但是，随着近些年来生物药物 的广泛开发，一些细胞因子、激素、功能性蛋白质均成为药物研制的热点，而TRFI A凭借其独有的特点，在药物分析中的应用也逐渐增多起来。
2.2抗体的结构
抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗 原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。
人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。
3、抗原抗体的结合
ing at a time and All things in their being are good for somet菌、病毒、异种动 物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原 性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性 ，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，
1.3抗原的性质
决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。
2.1荧光偏振免疫分析方法(Fluorescence polarization immunoassay, FPIA)
（1）基本原理
FPIA是一种利用反应分子在反应体系中的旋转速度与分子大小呈反比的特点 而对荧光标记抗原进行检测的技术，在免疫反应体系中抗原（相对为小分子物质） 的旋转要比抗原抗体复合物快，以荧光物质标记的抗原与待测样品中的抗原竞争结合特异性抗体， 形成荧光抗原抗体复合物，该复合物的旋转比单纯的荧光物标记抗原慢，当此时反应体系接受偏 振光的照射，如荧光抗原分子的长轴与投入的偏振光面平行，那么荧光物质吸收的 偏振光最多，分子呈激发态，回到基态时会发射出偏振荧光，而如果反应体系中的 分子发生旋转，发射的偏振光就会减弱，减弱的程度与分子旋转的速度呈正比，与 分子大小呈反比。
（2）特点
荧光光谱独特：激发光光谱带宽，激发最大波长在300~500nm，有利于增高激发能 ，提高标记物的比活性；发射光光谱带很窄，甚至不到10nm，有利于降低本底，提 高分辨率；
Stokes位移大：可以达到250~350nm，最大程度地排除了非特异性荧光背景的干扰 ；
荧光寿命长：一般镧系元素鳌合物的荧光衰变时间为60~900μs；因此，延迟测量 时间，待背景荧光完全衰减后测定，所测得的便是标记物的特异性荧光，从而消除 了蛋白质背景荧光的干扰；
化学发光（Chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂) 在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中 间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形 式释放出能量，这一现象称为化学发光。
2、分类