最新5凝胶电泳技术
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凝胶浓度 浓度越小，孔径越大，浓度越大，孔径 越小 。
不同浓度琼脂糖凝胶的有效分离范围
浓度%（W/V）
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线状DNA分子的有效 分离范围（kb）
5－60 1－20 0.8－10 0.5－7 0.4－6 1.2－3 0.1－2
DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围
载样缓冲液的作wk.baidu.com：
①增加样 品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉 入加样孔内；
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比 如质粒分子，泳动率的大小顺序为：共价闭合环状 DNA（covalently close circular DNA，ccc DNA， 超螺旋构型） ＞lDNA（linear form，线型，质粒 的两条链均断裂；线性分子）＞ocDNA（开环DNA， open circularDNA，ocDNA，它的双链中的一条保 持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切 口）。
1-5V/cm（低压），低压时，线性DNA迁移率与电压成 正比，而对于大片段电泳，甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。
电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分 离范围随着电压增大而减小。
高电压影响凝胶的分离范围，使分辨率下降：因为 随电压上升，不同长度DNA泳动的增加程度不同， 凝胶有效分离范围随电压上升而下降 。
4) DNA上样量过多 减少凝胶中DNA上样量；
5) DNA样含盐过高 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐；
6) 有蛋白污染 电泳前酚抽提去除蛋白；
7) DNA变性 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释 DNA。
二、核酸电泳的指示剂与染色剂
核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc） 呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的 迁移率比溴酚蓝慢。
聚丙烯酰胺 浓度 有效分离范围（bp） 二甲苯青FF
3.5
1000－2000
460
5.0
80－500
260
8.0
60－400
160
12.0
40－200
70
15.0
25－150
60
20.0
6－100
45
溴酚蓝
100 65 45 20 15 12
（三）电场强度
电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯 度。
TNE（Tris 醋酸钠，EDTA）：电流大，适合于长时间低 压电泳，分辨率高。
在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制 DNase，保护DNA。
TBE一般配10 ×或5 ×的贮存液，都以1×TBE作为 使用液进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备 足够的缓冲容量；进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲 液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使 用1×TBE以提供足够的缓冲容量。
5凝胶电泳技术
电泳（electroghoresis）：带电物质在电场中向相反 电极移动的现象 。
电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样 品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等 性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从 而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
2、分子的空间构型：即使分子量相同，构型不同， 其迁移率也不同。
4、碱基组成： 对迁移率影响不明显，单链DNA形成 发头结构，影响迁移率，单链（1kb）小于双链DNA （1kb）
(二)支持物介质（种类和浓度）
核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同 浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同， 适于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶 由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺 （TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长 链，并通过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉 连接而成，其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定。
TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一 问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液或高压灭菌。
DNA电泳带模糊的原因：
1) DNA降解，应 避免核酸酶污染；
2) 电泳缓冲液陈旧 电泳缓冲液多次使用后，离子强 度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电 泳效果。建议经常更换电泳缓冲液；
3) 所用电泳条件不合适 电泳时电压不应超过20V/cm， 温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃； 核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力 ；
高压电泳（20-600V/cm（电场强度）,10002000V（电压））,必须用PAG作介质。
（四）电泳缓冲液（种类、pH、离子强度）
1、pH值：决定带电颗粒的解离程度，缓冲液pH常偏 碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。 2、离子强度：离子强度小，溶液的导电性小，带电 颗粒泳动慢 ；离子强度大，溶液的导电性高，带电颗 粒泳动快（过高，产生大量热，胶熔化，或使DNA变 性。
在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰 的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链 线性DNA片段大致相同。 在 1%和1.4%琼脂糖中电泳 时，二甲苯青的迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线 性DNA大致相似。
指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液 （loading buffer）。
但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和 溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。
3、带电量：核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基 上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离， 所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3 时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分 子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的 电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。
3、种类 ：
TAE（Tris、醋酸、EDTA）：缓冲能力差，电流大易发 热，长时间使用阴极为碱性 ，阳极为酸性 ，需要循环使 两极的pH一致；但价格便宜。
TBE（Tris、硼酸、EDTA）：缓冲能力强。首选TBE。
TPE（Tris 磷酸，EDTA）：缓冲能力强，但回收DNA 易与DNA一起沉淀，影响酶反应。
不同浓度琼脂糖凝胶的有效分离范围
浓度%（W/V）
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线状DNA分子的有效 分离范围（kb）
5－60 1－20 0.8－10 0.5－7 0.4－6 1.2－3 0.1－2
DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围
载样缓冲液的作wk.baidu.com：
①增加样 品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉 入加样孔内；
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比 如质粒分子，泳动率的大小顺序为：共价闭合环状 DNA（covalently close circular DNA，ccc DNA， 超螺旋构型） ＞lDNA（linear form，线型，质粒 的两条链均断裂；线性分子）＞ocDNA（开环DNA， open circularDNA，ocDNA，它的双链中的一条保 持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切 口）。
1-5V/cm（低压），低压时，线性DNA迁移率与电压成 正比，而对于大片段电泳，甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。
电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分 离范围随着电压增大而减小。
高电压影响凝胶的分离范围，使分辨率下降：因为 随电压上升，不同长度DNA泳动的增加程度不同， 凝胶有效分离范围随电压上升而下降 。
4) DNA上样量过多 减少凝胶中DNA上样量；
5) DNA样含盐过高 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐；
6) 有蛋白污染 电泳前酚抽提去除蛋白；
7) DNA变性 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释 DNA。
二、核酸电泳的指示剂与染色剂
核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc） 呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的 迁移率比溴酚蓝慢。
聚丙烯酰胺 浓度 有效分离范围（bp） 二甲苯青FF
3.5
1000－2000
460
5.0
80－500
260
8.0
60－400
160
12.0
40－200
70
15.0
25－150
60
20.0
6－100
45
溴酚蓝
100 65 45 20 15 12
（三）电场强度
电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯 度。
TNE（Tris 醋酸钠，EDTA）：电流大，适合于长时间低 压电泳，分辨率高。
在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制 DNase，保护DNA。
TBE一般配10 ×或5 ×的贮存液，都以1×TBE作为 使用液进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备 足够的缓冲容量；进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲 液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使 用1×TBE以提供足够的缓冲容量。
5凝胶电泳技术
电泳（electroghoresis）：带电物质在电场中向相反 电极移动的现象 。
电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样 品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等 性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从 而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
2、分子的空间构型：即使分子量相同，构型不同， 其迁移率也不同。
4、碱基组成： 对迁移率影响不明显，单链DNA形成 发头结构，影响迁移率，单链（1kb）小于双链DNA （1kb）
(二)支持物介质（种类和浓度）
核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同 浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同， 适于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶 由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺 （TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长 链，并通过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉 连接而成，其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定。
TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一 问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液或高压灭菌。
DNA电泳带模糊的原因：
1) DNA降解，应 避免核酸酶污染；
2) 电泳缓冲液陈旧 电泳缓冲液多次使用后，离子强 度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电 泳效果。建议经常更换电泳缓冲液；
3) 所用电泳条件不合适 电泳时电压不应超过20V/cm， 温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃； 核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力 ；
高压电泳（20-600V/cm（电场强度）,10002000V（电压））,必须用PAG作介质。
（四）电泳缓冲液（种类、pH、离子强度）
1、pH值：决定带电颗粒的解离程度，缓冲液pH常偏 碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。 2、离子强度：离子强度小，溶液的导电性小，带电 颗粒泳动慢 ；离子强度大，溶液的导电性高，带电颗 粒泳动快（过高，产生大量热，胶熔化，或使DNA变 性。
在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰 的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链 线性DNA片段大致相同。 在 1%和1.4%琼脂糖中电泳 时，二甲苯青的迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线 性DNA大致相似。
指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液 （loading buffer）。
但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和 溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。
3、带电量：核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基 上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离， 所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3 时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分 子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的 电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。
3、种类 ：
TAE（Tris、醋酸、EDTA）：缓冲能力差，电流大易发 热，长时间使用阴极为碱性 ，阳极为酸性 ，需要循环使 两极的pH一致；但价格便宜。
TBE（Tris、硼酸、EDTA）：缓冲能力强。首选TBE。
TPE（Tris 磷酸，EDTA）：缓冲能力强，但回收DNA 易与DNA一起沉淀，影响酶反应。