植物筛选标记基因应用进展_王相春
一种与植物抗逆性相关的TaALDH7-5A蛋白及其编码基因与应用[发明专利]
![一种与植物抗逆性相关的TaALDH7-5A蛋白及其编码基因与应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b79dd006f8c75fbfc67db26f.png)
专利名称：一种与植物抗逆性相关的TaALDH7-5A蛋白及其编码基因与应用
专利类型：发明专利
发明人：张相岐,陈加敏,卫波,李国良,范仁春,王献平
申请号：CN201510023695.X
申请日：20150116
公开号：CN104531626A
公开日：
20150422
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种与植物抗逆性相关的TaALDH7-5A蛋白及其编码基因与应用。
该蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与植物抗逆性相关的蛋白质。
通过实验证明，本发明的蛋白具有提高植物抗旱胁迫的功能，该蛋白在植物育种方面具有重要应用价值。
申请人：中国科学院遗传与发育生物学研究所
地址：100101 北京市朝阳区北辰西路1号院
国籍：CN
代理机构：北京纪凯知识产权代理有限公司
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agriculture
知识创新工程试点领域方向研究专题报告之一农业高新技术领域研究报告（征求意见稿）农业高新技术领域研究组一九九九年八月农业高新技术领域专家名单组长：李振声遗传所副组长：朱祯遗传所甘国辉地里所成员：薛勇彪发育所武志杰沈阳应用生态所张相歧遗传所戈峰动物所陈凡发育所周健民南京土壤所董丽松长春应化所宋庆元动物所康跃虎地址所联络员：苏荣辉生物局刘健资环局专家组秘书陈蕾遗传所徐鸿林遗传所目录摘要项目设置简表1．农业高新技术是推动农业发展的动力6 1．1 第一次农业技术革命 6 1．1 第一次农业技术革命对农业发展的重要贡献 6 1．1．2农作物育种的成就 6 1．1．3农用化学品的广泛应用7 1．1．4灌溉技术的发展7 1．2．第一次农业技术革命7 1．2．1第二次农业技术革命的特点8 1．3．2第二次农业技术革命的内容8 1．2．3现代农业生产面临的巨大变革8 2．有关领域国内钻研的发展趋势2．1农业基因组学2．2农业生物技术领域2．2．1转基因植物技术2．2．2细胞与染色体工程育种技术2．2．3动物克隆技术和转基因动物技术2．3农业信息技术领域2．3．1农业生产上的信息技术2．3．2农业信息服务和农业管理信息技术摘要农业是国民经济的基础。
这去五十年间，我国以占世界7%的耕地养活了世界22%的人口，取得了举世公认的巨大成就。
然而，在世纪之交，由于人口的迅速增长、资源短缺与环境恶化以及人民需求增长及经济的飞速发展，我国农业正面临越来越严峻的挑战。
农业生产力的提高主要取决于科技进步。
发端于19世纪后半叶，一直持续到20世纪后半叶的第一次农业技术革命，是建立在品种改良、农用化学品的广泛应用、改善灌溉条件，以及农业机械化的基础上取得的。
在此期间，世界粮食亩产量以2.8公斤的速度递增。
我国从本世纪50年代至80年代30年内，粮食亩产从78公斤增长到252公斤，年增长5.89公斤，是世界平均增长的一倍以上。
本世纪80年代迎来了第二次农业技术革命的曙光，此次技术革命是一次以生物技术和信息技术为主导的新的农业技术革命。
SRAP标记在植物性状标记和遗传图谱构建中的应用研究进展
SRAP标记在植物性状标记和遗传图谱构建中的应用研究进展王从彦
【期刊名称】《河南农业科学》
【年(卷),期】2012(041)009
【摘要】由于SRAP标记简便、快速、不需预知物种的序列信息,近年来已广泛应用于植物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图谱构建、基因连锁标记、基因定位、比较基因组学研究及杂种优势预测等研究.基于此,综述了SRAP分子标记在植物性状标记和遗传连锁图谱构建方面的应用进展,以便为今后的研究提供相应的理论依据.
【总页数】6页(P1-5,21)
【作者】王从彦
【作者单位】南通大学生命科学学院,江苏南通226019
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
【相关文献】
1.长果种黄麻SRAP标记遗传连锁图谱的构建及3个质量性状基因定位 [J], 陈晖;陈美霞;陶爱芬;张广庆;徐建堂;祁建民;方平平
2.利用EST-SSR标记构建中国老芒麦品种DNA指纹图谱及种质遗传多样性 [J], 张俊超;谢文刚;赵旭红;张宗瑜;赵永强;王彦荣
3.应用SSR和SRAP标记构建青虾遗传连锁图谱 [J], 乔慧;吴滟;傅洪拓;龚永生;蒋速飞;熊贻伟
4.一组新的小麦EST-SSR标记开发及其在遗传图谱构建中的应用 [J], 吕冰冰;代畅;彭正松;YAMAMOTO Naoki;吴一超;魏淑红;杨在君
5.应用SRAP标记对茄子品种进行遗传多样性分析与指纹图谱构建 [J], 李怀志;张峻;李翔;陈火英
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215502050_基因编辑技术在植物启动子编辑中的研究进展
生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 3 期 321 ~ 328Current Biotechnology ISSN 2095‑2341进展评述Reviews基因编辑技术在植物启动子编辑中的研究进展盖思宇1§ ， 陈子奇2§， 夏涵超1 ， 赵仁贵1* ， 刘相国2*1.吉林农业大学农学院，长春 130118；2.吉林省农业科学院，长春 130119摘要：植物基因的表达决定了植物的表型特征，而基因的表达受启动子的直接调控。
启动子作为基因的一个组成部分，控制着基因表达(转录)的起始时间和表达程度。
利用基因编辑技术对启动子进行定向编辑之后，会因为基因序列特有的重组排列、顺式表达等因素使得植物中的某个或某些基因的表达模式发生改变，进而影响基因功能。
这些改变最终直接或间接地改变了植物的外在表型特征，而一些正向改变会对植物的品质起到优化和改良作用。
综合近几年基因编辑技术对启动子的研究，主要从启动子的构成与分类、基因编辑技术和启动子编辑的研究进展这3个方面对启动子的编辑在植物中的应用进行了概述和总结，以期为启动子编辑技术应用于植物改良提供参考。
关键词：基因编辑技术；启动子编辑；植物品质改良DOI ：10.19586/j.20952341.2023.0001 中图分类号：Q37 文献标志码：AResearch Progress of CRISPR/Cas9 Technology in Plant Promoter EditingGAI Siyu 1§， CHEN Ziqi 2§， XIA Hanchao 1 ， ZHAO Rengui 1* ， LIU Xiangguo 2*1.Faculty of Agronomy ，Jilin Agricultural University ，Changchun 130118，China ；2.Jilin Academy of Agricultural Sciences ，Changchun 130119，ChinaAbstract ：Plant gene expression determines plant phenotypic characteristics ， and gene expression is directly regulated by pro⁃moters. As a component of genes ， promoters control the initiation time and expression degree of gene expression （transcription ）. After directed editing of promoters by gene editing technology ， the expression pattern of one or some genes in plants would be changed due to the unique recombination and arrangement of gene sequences ， cis -expression and other factors ， thus affecting the function of genes. These changes ultimately directly or indirectly change the external phenotypic characteristics of plants ， andpositive changes would help to optimize and improve plant quality. In this paper ， the application of promoter editing in plants was summarized from three aspects ： the structure and classification of promoters ， gene editing technology and the research progress of promoter editing ， which was expected to provide reference for plant improving by promoter editing.Key words ：gene editing technology ； promoter editing ； plant quality improvement2019年，一种突破基因编辑瓶颈、优化传统基因编辑的新策略——启动子靶向编辑［1］，给研究者提供了一个新的研究思路。
农业基因资源发掘于种质创新利用取得了新进展
农业基因资源发掘于种质创新利用取得了新进展
农业基因资源发掘与种质创新利用研究取得新进展，目前已发掘出一批植物新种质，有效加快了农林植物新品种的培育。
利用SSR标记技术、AFLP分析对粮食作物、棉油作物、园艺作物、林木、花卉共1300余份种质材料进行了遗传多态性分析，构建了这些材料的分子身份证，分析与发掘出了水稻、麦类、玉米、高粱、粟类、棉花与麻类、豆类、园艺作物等农林植物抗病、矮化、优质、抗逆、氮磷高效利用等优异种质基因源，创制了一批突破性的新种质，部分资源已开始在育种中得以应用。
植物基因定位和基因功能分析的方法研究
植物基因定位和基因功能分析的方法研究随着现代生物学和遗传学的发展，人们对植物基因定位和基因功能分析的方法进行了深入研究，这不仅可以帮助人们更好地理解植物发育和生长的机理，还能为植物育种和生产提供有用的信息和工具。
本文将重点介绍当前主要的植物基因定位和基因功能分析方法。
一、植物基因定位方法1.遗传连锁图谱遗传连锁图谱是一种利用遗传标记来分析不同基因之间遗传联系的方法。
通过对多个遗传标记在植物基因组中的位置进行测定和分析，可以建立起一张遗传图谱，用于揭示不同基因之间的距离和相对位置。
这种方法通常使用分子标记进行，如限制性片段长度多态性（RFLP）、简单重复序列（SSR）、随机扩增多态性（RAPD）等等。
2.基因组关联分析基因组关联分析是一种利用大规模基因组数据来解析复杂性状遗传基础的方法。
这种方法可以在典型生境群体中寻找有影响的变异位点，并确定它们与复杂性状之间的关系。
这种方法使用的主要技术是基因芯片和全基因组二代测序等高通量技术。
3.定位克隆定位克隆是一种在表型、遗传连锁图谱和基因组关联分析的基础上，利用分子遗传学的技术从候选区域中精确定位基因的方法。
这种方法最初是通过描述多态性突变体的表型特征并与别的单基因遗传性神经病的解决方案进行议会比较，通过遗传性状继承模式的推断、基因组DNA库筛选和分子标记标示等技术逐渐细化到定位至遗传连锁图谱中的一个小区域或物理图谱上的一小段碎片。
目前随着技术不断升级，整个过程已经极度自动化，能够对基因进行深准碎片定位和氨基酸序列注释，进一步明确植物基因的功能和作用机制。
二、基因功能分析方法1.反相留出反向遗传（反相留出）是一种采用RNA干扰技术降低或抑制嘌呤和非嘌呤物种基因表达的途径。
这种技术利用RNAi的调控机制，特异性破坏mRNA分子，并通过RNA的剪切或配对等方式，实现对靶基因的抑制。
这种技术能够有效地研究基因在发育、生长、代谢等过程中的功能，并探究不同基因之间的互相作用。
如何利用遗传标记技术进行植物品种鉴定和选育
如何利用遗传标记技术进行植物品种鉴定和选育遗传标记技术在植物品种鉴定和选育中的应用人工选择和培育植物品种是提高农作物产量和质量的重要手段之一，而遗传标记技术则为植物品种鉴定和选育提供了一种更为准确和高效的方法。
本文将介绍遗传标记技术的原理、常见的鉴定和选育方法，并探讨其在农业生产中的应用前景。
一、遗传标记技术的原理遗传标记技术是一种基于遗传物质中特定DNA序列的变异来进行鉴定和选择的方法。
其原理基于不同个体间的遗传差异，通过检测DNA中的特定位点，从而确定个体之间的遗传关系，并进一步对个体进行鉴定和选育。
遗传标记可分为分子标记和形态标记两种类型，分子标记以DNA序列上的遗传变异为依据，形态标记则以植物个体的形态特征为依据。
本文主要介绍基于分子标记的遗传标记技术。
二、植物品种鉴定中的遗传标记技术1. RAPD分子标记技术RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）是一种常用的分子标记技术，它通过PCR扩增特定位点上的DNA片段，从而区分不同个体之间的遗传差异。
该技术简便易行，无需事先了解待分析物种的基因组信息，因此在植物品种鉴定中得到广泛应用。
2. SSR分子标记技术SSR（Simple Sequence Repeat）是一种以重复单元为基础的分子标记技术，它通过PCR扩增具有特定重复序列的DNA片段，从而实现对植物品种进行鉴定。
相比于RAPD技术，SSR技术具有更高的位点稳定性和遗传信息丰富性，因此在植物品种鉴定和亲本筛选中被广泛应用。
三、植物品种选育中的遗传标记技术1. QTL定位QTL（Quantitative Trait Locus）即数量性状基因座，是影响植物数量性状的基因所在的特定位点。
通过遗传标记技术，可以对数量性状与遗传标记之间的关系进行研究，进而定位QTL，从而为植物品种的选育提供依据。
QTL定位技术在提高农作物产量、抗病虫害性等方面具有重要应用价值。
植物生物学中的分子标记技术与应用
植物生物学中的分子标记技术与应用植物生物学是研究植物的生物基础、生命过程及其变异规律的学科，而分子标记技术则是在植物生物学领域中起到重要作用的一种技术手段。
本文将介绍植物生物学中常用的分子标记技术及其应用。
一、PCR技术PCR（聚合酶链反应）是一种高效、快速、特异性强的基因分子标记技术。
通过PCR技术，可以在短时间内扩增目标DNA片段，从而进行后续的基因分析工作。
在植物学中，PCR技术被广泛应用于植物基因组分析、物种鉴定、遗传多样性研究等方面。
例如，通过PCR技术对植物基因组中的特定基因进行扩增，可以研究该基因的结构与功能，进而深入了解植物的生物学特性。
二、RFLP技术RFLP（限制性片段长度多态性）技术是一种用于刻画DNA序列差异的分子标记技术。
通过将DNA样本经酶切后的片段进行电泳分离并与探针杂交，可以检测到不同基因座上特异的DNA序列差异。
在植物生物学研究中，RFLP技术常用于物种遗传多样性鉴定、亲缘关系分析等方面。
通过对不同植物种群的RFLP图谱进行比较，可以研究植物的遗传背景及其与环境的关系。
三、SSR技术SSR（简单序列重复）技术是通过扩增重复序列区域来进行分子标记的一种方法。
由于植物基因组中存在大量的SSR位点，因此SSR技术在植物生物学研究中得到广泛应用。
通过对SSR位点进行PCR扩增并进行电泳分析，可以获得具有一定长度差异的DNA片段，从而实现对不同植物品种或个体之间的分辨与鉴定。
此外，SSR技术还可以用于构建遗传图谱、研究基因型-表型关系等方面的研究。
四、SNP技术SNP（单核苷酸多态性）技术是目前应用最广泛的分子标记技术之一。
SNP位点是指基因组中存在的单核苷酸替代变异，其在植物基因组中广泛存在。
通过对特定SNP位点的检测与分析，可以研究不同植物品种或个体之间的遗传关系、物种起源与进化、基因功能等。
近年来，高通量测序技术的发展使得SNP技术的应用更加便捷，为植物学研究提供了强大的工具。
基于分子标记的植物种群遗传多样性研究
基于分子标记的植物种群遗传多样性研究植物种群遗传多样性是种群进化和生态发展的基础，它反映出种群内遗传差异的程度和分布状况。
作为植物保育的重要指标之一，研究植物遗传多样性可以为种群保护和生态修复提供科学依据。
目前，随着生物信息学和分子生物学的发展，种群遗传多样性的研究方法也得到了大幅度提升。
分子标记是遗传学领域中的一种研究工具，通过对某一特定DNA序列进行研究，可以快速揭示出物种间遗传多样性的程度。
在植物学的研究中，常用的分子标记包括核酸序列和蛋白质序列。
其中，核酸序列分子标记的研究主要包括限制性片段长度多态性 (RFLP)、序列标记间隔法 (SSR)、随机扩增多态性DNA (RAPD)、DNA指纹图谱 (AFLP)、单倍型分析 (HAPLOTYPE)、SNP等等。
这些分子标记方法有不同的优缺点，可以根据实际需要选择适合的方法来深入研究植物物种间的遗传多样性。
限制性片段长度多态性(RFLP)法是一种可以对DNA特定部位进行定性、定量分析的方法。
它通过限制性内切酶的作用将DNA片段分割成若干不同长度的碎片，然后利用电泳法分离这些碎片，得到有相对特异性的DNA带谱图。
该方法优点在于能够研究复杂的基因多态性，可以避免PCR扩增过程中对GC含量和DNA质量的要求，缺点在于步骤繁琐、时间长、成本高。
序列标记间隔法 (SSR)是基于微卫星分子进化的一种分子标记方法。
这种方法依托细胞质基因组中的微卫星序列来构建一个高分辨率的多态性标记。
高度多态性的核酸片段不仅在植株自交系动态变化过程中具有稳定的遗传学特征，同时该标记还可以锁定一段DNA特定区域，避免了较复杂酶切和PCR扩增过程中的非特异性DNA等因素的干扰，因此使用范围广泛。
随机扩增多态性DNA (RAPD)是利用PCR扩增DNA片段，然后在EA界面上用电泳分离并可视化DNA片段，再把不同的PCR产物的可视化图谱进行比较，确定不同个体的分子特征。
由于RAPD标记在PCR反应扩增中对操作者、PCR反应条件、反应系统组成及质量等方面的要求较高，同时仅能分析0.5~10kb左右大小的DNA片断，因此被SSR和AFLP方法所替代。
授粉后红球姜雌性生殖器官qRT-PCR的内参基因筛选
授粉后红球姜雌性生殖器官qRT-PCR的内参基因筛选林浩川;钟春梅;孙姝兰【摘要】根据授粉后不同时间点的红球姜转录组数据库以及相关文献报道的传统内参基因,筛选出10个表达相对稳定的基因Actin-2 (ACT2)、Actin-7(ACT7)、Beta tubulin-1(TUB1)、Beta tubulin-5(TUB5)、Alpha tubulin-3(TUA3)、Ubiquitin(UBQ)、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、Elongation factor 1-alpha(EF-1α)、Cyclophilin(CYP)、Histone(H2A)作为候选内参基因,采用qRT-PCR技术,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对候选内参基因的表达稳定性进行分析.结果表明,在红球姜雌性生殖器官授粉后的发育过程中,GAPDH和UBQ的表达稳定性最好,均适合作为内参基因,同时使用2种作为内参基因能使实时荧光定量PCR标准化分析结果更精确.因此,最终选择GAPDH和UBQ作为实时荧光定量PCR标准化分析红球姜雌性生殖器官相关基因表达的内参基因.该研究将为探究红球姜败育的分子机理奠定基础,也为近源姜属植物内参基因的筛选提供线索.%Screening of reference genes of pollinated Zingiber zerumet (L.) Smith female reproductive organ at development process is crucial for analyzing the expression of key regulatory genes for Zingiber zerumet (L.) Smith abortion.According to the transcriptome database of Z.zerumet Smith and researches on traditional reference genes,we selected 10 relatively stable genes as candidate reference genes,including Actin-2 (ACT2),Actin-7 (ACT7),Beta tubulin-1 (TUB1),Beta tubulin-5 (TUB5),Alpha tubulin-3 (TUA3),Ubiquitin (UBQ),Clyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH),Elongation factor 1-alpha (EF-1α),Cyclophilin (CYP),and Histone (H2A),and analyzed their expressionstability by qRT-PCR and three statistic programs:GeNorm,NormFinder and BestKeeper.The results showed that GAPDH and UBQ are the most stable genes during the development process of pollinated Z.zerumet Smith female reproductive organ.These two genes were suitable to be reference genes,and it was more accurate for qRT-PCR normalization analysis using these two reference genes at the same time.This work indicated that GAPDH and UBQ are effective reference genes for qRT-PCR normalization analysis in pollinated Z.zerumet Smith female reproductive organ at different development stages,which can be used for the study of molecular mechanism of abortive in Z.zerumet Smith,and for the screening of reference genes in other Zingiber species.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(049)001【总页数】7页(P67-73)【关键词】红球姜;内参基因;qRT-PCR;GeNorm;NormFinder;BestKeeper【作者】林浩川;钟春梅;孙姝兰【作者单位】华南师范大学生命科学学院,广东省植物发育与生物工程重点实验室,广州510631;华南师范大学生命科学学院,广东省植物发育与生物工程重点实验室,广州510631;华南师范大学生命科学学院,广东省植物发育与生物工程重点实验室,广州510631【正文语种】中文【中图分类】Q786红球姜(Zingiber zerumet (L.) Smith)是一种良好的新型切花和药用材料，具有极高的经济价值[1]. 笔者的前期研究发现，虽然其大、小孢子发育正常，但存在败育现象，极大影响红球姜的发展前景. 目前，姜属植物的研究主要集中在形态解剖、药用价值等方面[1]，有关红球姜败育的分子机理尚不清楚. 实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)技术因其具有灵敏度高、重复性好等优点，常用于基因表达分析[2]，但其结果的准确性依赖于标准化分析的内参基因[3]. 应用qRT-PCR技术分析红球姜败育相关基因的表达模式，有助于阐明其败育的分子机制. 然而，目前尚未见任何姜科相关内参基因筛选的报道. 在植物学研究中，一些表达相对稳定的管家基因常被选为内参基因，如肌动蛋白基因(Actin)[4]、微管蛋白基因(Tubulin)[5]等，然而研究表明，管家基因在不同植物或不同实验条件中的表达水平并非持续稳定[6]，即使是近源种间，相同的管家基因也存在表达差异[7]. 因此，筛选适用于授粉后不同发育时期的红球姜雌性生殖器官实时荧光定量PCR标准化分析的内参基因是极其必要的.转录组测序(Transcriptome Sequence)可以从整体上反映基因表达水平，有助于研究基因组信息未知的非模式物种[8]. 基于转录组测序的qRT-PCR内参基因筛选是目前一种新的有效方法，SANG等[9]通过该方法筛选出适用于不同重金属胁迫下东南景天的内参基因；CHANG等[10]也通过该方法筛选出1对可用于侧柏不同组织的内参基因；该方法同样成功应用于动物[11]，真菌[12]等非模式物种内参基因的筛选中.本研究根据授粉后不同时间点的红球姜转录组以及相关文献报道的传统内参基因，筛选出10个表达相对稳定的基因Actin-2(ACT2)、Actin-7(ACT7)、Beta tubulin-1(TUB1)、Beta tubulin-5(TUB5)、Alpha tubulin-3(TUA3)、Ubiquitin(UBQ)、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、Elongation factor 1-alpha(EF-1α)、Cyclophilin(CYP)、Histone(H2A)作为候选内参基因，采用qRT-PCR技术，结合GeNorm[13]、NormFinder[14]和BestKeeper[15]3种常用统计学程序分析候选内参基因的表达稳定性，筛选出可用于实时荧光定量PCR标准化分析红球姜雌性生殖器官相关基因表达的内参基因，为探究红球姜败育的分子机理奠定基础.1.1 材料与处理以红球姜姜花为实验材料，采样地为广东省惠州市博罗县酥醪村罗浮山系. 开花前一天套袋以防止访花动物的干扰，开花后当柱头处于授粉期时进行异花授粉，于授粉后0、2、4、6、8、10、12、18、24 h取下整朵姜花，分离出雌性生殖器官(花柱和子房)，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存. 共9个样品，每个样品设3个生物学重复.1.2 总RNA提取和cDNA第一链合成冻存样品经液氮研磨后，使用华越洋超快型植物RNA提取试剂盒(华越洋生物科技有限公司，0416-50)提取总RNA. 利用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并用NanoDrop 2000c(Quawell，美国)检测总RNA的纯度和浓度. 使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara，RR047A)反转录合成cDNA第一链，置于-20℃冰箱保存. 反应体系：模板RNA 800 ng；5×PrimeScript© Buffer (for Real-time) 4 μL；PrimScript© RT Enzyme Mix I 1 μL；RT Primer Mix 1 μL；5×gDNA Eraser Buffer 2 μL；gDNA Eraser 1 μL；用RNase Free dH2O补至20 μL体系. 反应程序：37 ℃15 min，85 ℃ 5 s.1.3 候选内参基因的筛选和引物设计根据本实验室前期获得的授粉后不同时间点的红球姜转录组数据，计算各基因表达量的平均值(Mean)、标准差(Standard Deviation, SD)和变异系数(Coefficient ofVariation, CV)，结合常用内参基因[16]，筛选出10个表达相对稳定的ACT2、ACT7、TUB1、TUB5、TUA3、UBQ、GAPDH、EF-1α、CYP、H2A基因作为候选内参基因. 使用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物(表1). 所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.1.4 qRT-PCR反应qRT-PCR反应在ABI PRISM© 7500 PCR仪(Thermo，美国)上进行. 反应体系：cDNA模板2 μL (20×)；SYBR© Premix Ex TaqTM (2×) 10 μL；ROX Reference Dye II 0.4 μL；Forward primer 0.4 μL；Reverse primer 0.4 μL；用Nuclease-free water补至20 μL体系. 每个样品设3个重复. 反应程序：预变性95 ℃ 30 s；40个循环，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s. 反应结束后进行溶解曲线分析扩增产物特异性.1.5 绘制标准曲线及计算基因扩增效率取9个样品的cDNA模板等量混合，依次稀释5个梯度，每个梯度稀释5倍，即模板浓度分别为初始浓度的50、5-1、5-2、5-3、5-4倍. 通过qRT-PCR反应，获得候选内参基因在不同模板浓度下的CT值. 以模板的log值为横坐标，以CT值为纵坐标绘制标准曲线，得到斜率k和相关系数R2. 通过公式E=(5-1/slope-1)×100%，计算出扩增效率E.1.6 数据分析采用Excel 2007对得到的CT值进行整理，并通过3种常用的统计学程序GeNorm、NormFinder和BestKeeper对候选内参基因进行基因表达稳定性分析，筛选出适用于授粉后不同发育时期的红球姜雌性生殖器官qRT-PCR的内参基因. GeNorm和NormFinder需要先将CT值转换为相对表达量，而BestKeeper可直接使用原始CT值.2.1 样品总RNA的质量检测选取授粉后不同时间点的红球姜雌性生殖器官提取总RNA，经质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，RNA电泳条带清晰明亮，无可见的DNA污染(图1). NanoDrop 2000c(Quawell，美国)检测结果显示，OD260/OD280为1.8～2.1，OD260/OD230为1.9～2.2，表明RNA样品完整性较好，纯度较高，可进行后续实验.2.2 引物扩增效率和扩增特异性分析利用10个候选内参基因引物，分别对5个浓度梯度(5倍稀释)的cDNA模板进行qRT-PCR扩增，根据获得的数据绘制候选内参基因的标准曲线. 结果显示，所有候选内参基因的相关系数R2>0.990，且扩增效率在95.71%～108.63%之间(表1)，表明cDNA模板量与相应的CT值具有良好的线性关系，符合qRT-PCR对引物扩增效率的要求，确保实验结果的可靠性. 同时，溶解曲线分析结果表明，10个候选内参基因都有明显的单一信号峰，且同一样品重复性良好(图2)，表明所使用的引物特异性好，反应的专一性高，结果准确可靠，可进行后续实验.2.3 候选内参基因表达丰度分析对10个候选内参基因在不同样品下的CT值进行汇总，评估这些基因的平均表达丰度(图3). 结果显示，所有候选内参基因CT值处于20～29之间，其中大部分处于20～26之间，表明表达丰度比较适中. GAPDH和UBQ的CT值最低，范围分别为20.18～22.85和20.63～22.58，表明这2个基因的表达丰度最高. 而TUB1的CT值最高，范围为25.26～28.79，表明其表达丰度最低.2.4 候选内参基因稳定性分析采用3种常见但算法不同的统计学程序GeNorm、NormFinder和BestKeeper，分别对10个候选内参基因在授粉后不同发育时期的红球姜雌性生殖器官中的表达稳定性进行分析. 2.4.1 GeNorm分析 GeNorm通过计算候选内参基因在不同样品中的表达稳定值(Expression Stability Value，M)来量化候选基因的稳定性.GeNorm以1.5作为临界值，只有当M值小于1.5时，该候选基因才能作为内参基因使用，而且M值越小其表达稳定性越好. 分析结果显示，10个候选基因的M 值均小于1.5，都可以作为内参基因使用. 按照M值由高到低排列依次为：ACT7>TUB5>TUB1>CYP>ACT2>TUA3>EF-1α>H2A>GAPDH=UBQ(图4)，表明GAPDH和UBQ的表达最稳定，最适合作为内参基因使用. 其次为H2A和EF-1α.此外，GeNorm还能通过计算配对变异值(Pairwise Variation Value)来确定理想内参基因的数目. 默认以0.15为临界值，当有n个候选内参基因时，若Vn/(n+1)<0.15，表明此时n个内参基因已满足准确校正目标基因表达量的要求，而无需使用更多的内参基因. 分析结果显示，V2/3<0.15(图4)，因此内参基因的最适数目为2个，分别是GAPDH和UBQ.2.4.2 NormFinder分析 NormFineder基于组内和组间基因表达的差异程度来排序，和GeNorm类似，候选基因的表达稳定性M值越小，表达越稳定. 分析结果显示，10个候选内参基因按照M值由高到低排列依次为：ACT7>TUB5>TUB1>CYP>ACT2>H2A>UBQ>TUA3>EF-1α>GAPDH(图5)，表明GAPDH的表达最稳定，其次为EF-1α、TUA3和UBQ.2.4.3 BestKeeper分析 BestKeeper基于候选内参基因在不同样品中的CT值计算标准差(SD)和变异系数(CV)，SD值越小，表达越稳定. 程序默认SD的临界值为1，当SD大于1时，表明该基因不适合作为内参基因使用. 分析结果显示，ACT2、CYP和TUB1的SD均大于1，表明这3个基因稳定性差，不适合作为内参基因使用. UQB的SD值最小，表达稳定性最好，其次为TUB5、H2A和GAPDH(表2). 综合上述3种程序的分析结果，GeNorm分析得出表达最稳定的基因组合是GAPDH和UBQ，而NormFinder和BestKeeper则分别为GAPDH和UBQ，可见对最适内参基因的分析结果都集中在GAPDH和UBQ.2.5 内参基因稳定性验证分别使用GAPDH和UBQ作为内参基因，对与红球姜授粉后雌性生殖器官发育相关的A型细胞周期蛋白基因(A-type Cyclin-dependent Kinase 1, CDKA1)[17]的表达模式进行分析，验证这2个内参基因对qRT-PCR分析目的基因表达模式的影响. 结果显示，分别以GAPDH和UBQ作为内参基因时所得到的CDKA1的表达模式大致相同，CDKA1在授粉24 h后表达均显著上调(图6). 上述结果表明，GAPDH和UBQ适合作为授粉后不同发育时期的红球姜雌性生殖器官实时荧光定量PCR标准化分析的内参基因.近年来，qRT-PCR技术已成为研究基因表达量的重要方法，由于常用的内参基因存在不稳定性[18]，因此根据具体的实验条件筛选稳定合适的内参基因极为重要.基于转录组测序的qRT-PCR内参基因筛选是一种新兴的研究方法，能为缺乏基因组信息的非模式物种内参基因的筛选提供线索.本研究根据授粉后不同时间点的红球姜转录组数据库以及相关文献报道的传统内参基因，筛选出10个候选内参基因ACT2、ACT7、TUB1、TUB5、TUA3、UBQ、GAPDH、EF-1α、CYP、H2A，结合qRT-PCR技术和3种统计学程序GeNorm、NormFinder和BestKeeper对它们在授粉后红球姜雌性生殖器官中的表达稳定性进行了评价. 结果表明，3种程序得出的稳定性排序略有不同，这在黄瓜等植物内参基因的筛选研究中也曾出现，可能是由于程序的统计学算法不同所致[19-20]. 但从总体结果上看，排除差异显著的TUB5，3种程序得出表达稳定性较高的基因都是GAPDH、UBQ、H2A和EF-1α，表达稳定性较低的基因都是ACT7和TUB1. 其中，GeNorm分析得出表达最稳定的基因组合是GAPDH和UBQ，而NormFinder和BestKeeper则分别为GAPDH和UBQ，可见3种程序对最适内参基因的分析结果都集中在GAPDH和UBQ. 分别以GAPDH和UBQ作为内参基因时，CDKA1在授粉后不同发育时期的红球姜雌性生殖器官中的表达模式大致相同，进一步说明这2个候选基因适合作为该条件下的内参基因. 目前已有大量研究表明GAPDH和UBQ在植物发育的不同时期表达稳定，如ZHONG等[21]发现GAPDH在荔枝不同发育时期和不同实验条件下表达均较稳定；孙美莲等[22]也发现GAPDH在不同发育时期的叶片和愈伤组织中表达稳定；刘洪峰等[23]发现UBQ在牡丹不同发育时期的花瓣以及凤丹不同发育时期的种子中表达较稳定；王彦杰等[24]对牡丹内参基因的研究中，同样筛选出GAPDH和UBQ为最稳定的内参基因，上述报道均与本研究结果一致. 此外，GeNorm程序对10个候选基因的配对差异值进行计算，以0.15为临界值界定Vn/(n+1)的大小，最终确定本实验条件下的理想内参基因数目为2个，即GAPDH和UBQ. 许多研究者建议，在进行基因表达分析时，相较于使用单一内参基因校正目的基因的表达量，同时选择2个或以上的内参基因更有利于得到精确可靠的结果，而且对于检测表达差异极为微小的目的基因，这种方法更为有效[25-26]. 因此，本研究最终同时选择GAPDH 和UBQ，作为授粉后不同发育时期的红球姜雌性生殖器官实时荧光定量PCR标准化分析的内参基因.本研究首次报道了可用于实时荧光定量PCR标准化分析红球姜雌性生殖器官相关基因表达的内参基因GAPDH和UBQ，为探究红球姜败育的分子机理奠定基础，也为近源姜属植物内参基因的筛选提供线索.【相关文献】[1] YOB N J,JOFRRY S M,AFFANDI M M,et al. 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利用分子标记鉴定植物种属和DNA分型技术的应用
利用分子标记鉴定植物种属和DNA分型技术的应用植物是人类赖以生存的物种之一，而植物种属的鉴定则是植物科学研究中的重要环节。
为了更好地了解植物种属的基因信息，科学家们把目光投向了分子遗传学领域，并通过分子标记鉴定和DNA分型技术等手段，成功解决了许多植物种属的分类问题。
一、分子标记鉴定植物种属分子标记是指通过分子生物学技术鉴定分子相似性的一种方法。
在植物种属的鉴定中，分子标记被广泛用于DNA序列的测定和基因的克隆，进而确定植物之间的遗传关系。
1. DNA片段长度多态性分析DNA片段长度多态性分析（AFLP）被广泛应用于植物种属的鉴定。
这种分子标记技术是通过缩合酶反应将基因组DNA片段扩增，并将其进行电泳分离，然后在凝胶上观察不同长度的片段，从而鉴定植物种属。
2. 序列关联分析序列关联分析（SSR）也是一种常用的分子标记鉴定植物种属的技术。
SSR技术主要是通过PCR反应扩增核苷酸序列，并在凝胶上观察序列间的不同长度，从而实现鉴定不同的植物种属。
二、DNA分型技术在植物种属鉴定中的应用DNA分型技术是基于分子遗传学原理，通过PCR反应分析特定DNA区域的多态性，以此来确定不同植物种属的遗传关系。
在植物种属鉴定中，DNA分型技术可采取PCR-RFLP、SSCP、SNP和STR等多种技术手段。
1. PCR-RFLP技术PCR-RFLP（聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性）技术是将PCR扩增出的特定DNA序列加入酶切物并酶解，进而将其分离并观察。
PCR-RFLP技术能够明确不同植物种属的遗传差异，进而进行鉴定。
2. SSCP技术SSCP（单链构象多态性）技术是通过PCR扩增DNA片段，并将其进行单链分离，再通过凝胶电泳进行分析。
该技术能够比较直观地分析出不同植物种属之间的差异，进而鉴定植物种属。
3. SNP技术SNP（单核苷酸多态性）技术主要是通过PCR扩增目标DNA片段，然后进行DNA测序以观察SNP变异。
黄曲霉中pyrG筛选标记循环利用的方法
第50卷第2期2021年3月福建农林大学学报(自然科学版)Journal of Fujian Agriculture and Forestry University ( Natural Science Edition )黄曲霉中pyrG 筛选标记循环利用的方法聂鑫怡―2,薛 杨王银春"，丁霞飞汪世华'-2(1.福建农林大学生命科学学院;2.福建省病原真菌与真菌毒素重点实验室，福建福州350002)摘要：为解决黄曲霉遗传转化操作过程中遗传筛选标记受限及传统URA3/pyrG 环出系统存在重复序列残留的问题，以具 有尿嘧啶营养缺陷的黄曲霉CA14PTs ( A^u70ApyrG)菌株为出发菌，利用pyrG 筛选标记构建表达HA-SumO 的重组菌株 GHS(pyrG+)，再通过重叠PCR 法构建包含GHS(pyrG+)基因组中pyrG 整合位点上、下游片段的融合片段，导入GHS(pyrG+) 菌株原生质体，利用DNA 同源重组和5-氟乳清酸(5-FOA)的负筛选剔除pyrG 筛选标记，重新获得具有尿嘧啶营养缺陷的 重组菌株GHS( pyrG -).通过测序分析，确认GHS(pyrG-)重组菌株基因组中的pyrG 筛选标记已被剔除且无其他序列残留.免疫杂交分析结果表明，剔除pyrG 筛选标记不影响重组菌株的蛋白表达模式.关键词：pyrG 遗传筛选标记；循环利用；不依赖同向重复序列；黄曲霉中图分类号：Q784 文献标识码：A文章编号：1671-5470( 2021) 02-0270-06DOI ：10.13323/ki.j.fafu( nat.sci.) .2021.02.018开放科学(资源服务)标识码(OS1D )Establishment of a novel pyrG selectable marker recycling system in Aspergillus flavusNIE Xinyi 1，2, XUE Yang 1，2, WANG Yinchun 1，2, DING Xiafei 1，2, WANG Shihua 1，2(1.School of Life Sciences , Fujian Agriculture and Forestry University ； 2. Key Laboratory of Pathogenic Fungi andMycotoxins of Fujian Province , Fuzhou , Fujian 350002, China)Abstract : Due to limited number of selectable markers and residual repeatable sequences in traditional URA3/ yrG recycling sys tem ,a novel pyrG selectable marker recycling system was established for the genetic transformation of Aspergillus flavus . Using CA14PTs( A^u70ApyrG) , a A. flavus strain with uracil auxotroph as the original strain , the recombinant strain GHS( pyrG +) that expressing HA-SumO was screened by pyrG selectable marker. Without direct repeats , the flanking sequences of pyrG locus in GHS ( pyrG +) recombinant strain were fused by overlap extension PCR and transformed into protoplasts of the GHS( pyrG +) strain. The pyrG selectable marker was knocked out from the genome by homologous DNA recombination in the presence of 5-fluoroolactic acid using negative selection. The GHS( pyrG -) recombinant transformants were further identified by sequencing and auxotrophic analy sis. Moreover, western blotting was carried out to confirm that the protein expression pattern of GHS( pyrG -) was not affected in the absence of the pyrG selectable marker.Key words : pyrG selectable marker ； recycling system ； direct repeat-independent ； Aspergillus flavus乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因URA3/pyrG 是一类常用的真菌遗传转化营养缺陷筛选标记,其编码 产物是真菌尿嘧啶核苷酸合成过程中的关键酶，该基因突变或敲除会使乳清酸核苷-5’ -磷酸脱羧酶失活或 缺失，表现为尿嘧啶营养缺陷,只能通过外源添加尿嘧啶或尿嘧啶核苷(尿苷)才能在培养基上生长.URA3 筛选标记最早在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )转化中应用,后来应用范围扩大到其他酵母科真菌，如 白念珠菌(Candida albicans )[l-4].由于尿嘧啶生物合成途径非常保守，在丝状真菌中也有相似的合成过程. 黄曲霉(AspergiUu flavus )、烟曲霉(A.fumigatus )、构巢曲霉(A. nidulans )、黑曲霉(A. niger )、米曲霉(A. oryzae )和土曲霉(A.terreus )等真菌中的pyrG 基因都与酿酒酵母URA 3基因同源，在遗传转化中也得到了 广泛应用[5-9].除了 URA3/pyrG 筛选标记外，还有一些常见的筛选标记，如氮源和碳源营养缺陷标记基因、药物抗性 标记基因等•在比较菌株性状时，携带不同的筛选标记会造成菌株间遗传背景的不同和性状的差异，从而 收稿日期：2020-09-24 修回日期：2020-10-23基金项目：国家自然科学基金项目(31700050)；福建农林大学杰出青年科研人才项目(xjq201724).作者简介：聂鑫怡(1982-)，女，助理研究员•研究方向：微生物学与分子生物学.Email ：xinyi_nie@ .通信作者汪世华(1976 -)，男，教 授.研究方向：功能基因与病原真菌.Email : wshyyl@ .第2期聂鑫怡等:黄曲霉中pyrG筛选标记循环利用的方法-271-影响研究结果的准确性.URA3/pyrG环出系统的出现解决了这一难题.该系统仅用URA3/pyrG一个筛选标记，配合5-氟乳清酸(5-F0A)的负筛选，使URA3/pyrG筛选标记插入真菌细胞的基因组-环出-再插入-再环出，如此循环，进行多次遗传操作[1°-11].但URA3/pyrG环出系统也存在缺陷，如使用该系统前必须要在URA3/pyrG基因两端分别插入一段同向重复序列(direct repeat)，该操作过程繁琐、耗时，且由于存在两段同向重复序列，PCR扩增基因重组片段时特别容易造成引物的错配，出现非特异条带.此外，URA3/pyrG环出后会在基因组上残留一段重复序列，该重复序列是否会影响菌株的性状尚未可知.针对这些问题，本研究在黄曲霉中建立了一种新的pyrG筛选标记循环利用的方法.1材料与方法1.1材料黄曲霉WT(AAu7°)菌株和CA14PTs(AAu7°ApyrG)菌株由美国农业部南方研究中心Perng-Kuang Chang教授惠赠,黄曲霉GHS(pyrG+)菌株由本研究构建，构巢曲霉FGSC A4菌株(ATCC38163)和烟曲霉AF293菌株(ATCC MYA-4609)由福建省病原真菌与真菌毒素重点实验室购买保存.质粒pUC18-HA-Sum0上携带的639bp的HA-sumO CDS-3-UTR核苷酸片段由通用生物系统(安徽)公司全基因合成.高保真DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶和未染色蛋白质分子质量标准购自上海翊圣生物科技公司，DNA分子质量标准购自东盛生物科技公司，凝胶回收试剂盒为0MEGA公司产品，酵母提取物和琼脂糖为奥赛公司产品，RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术公司，预染蛋白质分子量标准和HA标签抗体购自赛默飞公司,Actin抗体为CST公司产品,5-氟乳清酸、尿嘧啶和尿苷均购自上海生工公司.1°°°x微量元素母液(1°°mL):ZnS04-7H202.2g，H3B031.1g，MnCl2-4H20°.5g，FeS04-7H20°.16g，CoCl2-5H20°.16g，CuS04-5H20°.16g，(NH4)6Mo7024-4H20°.11g，Na4EDTA5g,溶于去离子水，过滤除菌.YGT固体培养基(1L):酵母提取物5g,葡萄糖2°g，1°°°x微量元素母液1mL,琼脂粉2°g.在YGT 培养基中分别加入1mg-L-'尿嘧啶和尿苷即为YGTUU液体培养基.本研究所用引物见表1.表1本研究所用引物Table1Primers used in this study编号引物核苷酸序列(5'-3‘)扩增核苷酸片段P1GGATCGTTGATGCTAATCP2GGGTGAAGAGCATTGTTTGAGGCGGTTCTTGACTAGTTGTAAG P3GCCTCAAACAATGCTCTTCACCCP4GTCTGAGAGGAGGCACTGATGCP5GCATCAGTGCCTCCTCTCAGACGAGGAATTGGAGGTAGCATAG P6GATGAATATACTGAAGATGGGP7ACCCCGCTTGAGCAGACATCACATGTACCCCTACGACGTCCC P8CTATGTCGTAAGTAGTTAP9CTGCCAGGTGTTCGCTTCP1°AATAGCCTATCCACAGCCP11CAAGCCTTCGACATCCGGATGGGTTCTTGACTAGTTGTAAGP12CTTACAACTAGTCAAGAACCCATCCGGATGTCGAAGGCTTGP13GGCGGACAGACGGGGCAAAG sumO基因上游非转录区5-UTR片段pyrG筛选标记片段3'-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子gpdA(p)片段HA-sumO CDS-3,-UTR,片段巢式引物扩增5'-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumO CDS-3'-UTR融合片段sumO基因上游非转录区5'-UTR片段3'-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子gpdA(p)片段巢式引物扩增5'-UTR-gpdA(p)融合片段1.2GHS(pyrG+)重组菌株的构建以尿嘧啶营养缺陷型黄曲霉CA14PTs(AAu7°A P yrG)菌株为出发菌，构建GHS(pyrG+)重组菌株，构建策略如图1所示.步骤如下：以黄曲霉CA14PTs(AAu7°A P yrG)菌株基因组DNA为模板，用引物P1和P2扩增长度为1171bp的sumO基因上游非转录区5'-UTR片段;利用引物P3和P4从烟曲霉AF293菌株基因组DNA中扩增长度为189°bp的pyrG表达元件;利用引物P5和P6从构巢曲霉FGSC A4菌株基因组DNA中扩增长度为151°bp的3'-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子gpdA(p)片段;利用引物P7和P8从质粒-272-福建农林大学学报(自然科学版)第50卷pUC-18-HA-SumO中扩增长度为639bp的片段HA-sumO CDS-3f-UTR；将上述各片段用重叠PCR法连接到一起，以巢式引物P9和P10扩增长度为5146bp的融合片段5'-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumO CDS-3r-UTR,转化黄曲霉CA14PTs(A^u70A?yrG)菌株原生质体，通过DNA同源重组使融合片段整合到基因组的sumO基因座上替换掉内源的sumO基因，在不含尿嘧啶和尿苷的复苏培养基上37°C培养3d后筛选、鉴定，获得GHS(pyrG+)重组菌株.CA14PTs(A^u70Aj9yrG)为出发菌株,GHS(pyrG+)为按常规方法以pyrG作为遗传筛选标记对黄曲霉sumO基因位点改造后的重组菌株，GHS(pyrG-)为pyrG筛选标记被剔除后的黄曲霉sumO基因位点改造重组菌株.“5'-UTR”表示黄曲霉sumO基因上游非转录区DNA片段，“pyrG”表示来源于烟曲霉的表达元件,“gpdA(p)”表示来源于构巢曲霉的3'-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子序列，“HA”表示来源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇HA标签蛋白编码序列，“sumO CDS”表示来源于黄曲霉的翻译产物为SumO蛋白的编码核苷酸序列，“3,-UTR”表示黄曲霉sumO基因下游非翻译区DNA片段.图1GHS(pyrG+)和GHS(pyrG-)重组菌株构建策略示意图Fig.l Schematic diagram of the strategy for the construction of GHS(pyrG+)and GHS(pyrG-)strains1・3pyrG遗传筛选标记的剔除以GHS(pyrG+)重组菌株为受体菌，剔除pyrG筛选标记，构建GHS(pyrG-)重组菌株,构建策略如图1所示.步骤如下:利用引物P1和P11从黄曲霉GHS(pyrG+)重组菌株基因组中扩增长度为1171bp的sumO基因上游非转录区5，-UTR片段;利用P12和P6从黄曲霉GHS(pyrG+)重组菌株基因组中扩增长度为1510bp的3'-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子gpdA(p)片段;将上述两个片段用重叠PCR法连接到一起,用巢式引物P9和P13扩增长度为2372bp的融合片段5-UTR-gpdA(p)，转化黄曲霉GHS(pyrG+)重组菌株原生质体,在含有2mg・mL-15-氟乳清酸、1mg-L-1尿苷和1mg-L-1尿嘧啶的复苏培养基上37C培养3d.抽提转化子基因组DNA,用引物P3和P4扩增pyrG片段进行PCR鉴定,用引物P9和P13扩增5，-UTR-gpdA(p)片段并用引物P9进行测序分析.1.4营养缺陷表型观察取103个黄曲霉GHS(pyrG-)重组菌株阳性转化子的新鲜抱子，分别接种于YGT和YGTUU固体培养基平板的中心点,37C持续培养3d,用佳能IXUS相机(16.1MEGA PIXELS)观察并拍照.1.5免疫杂交分析黄曲霉总蛋白的提取、电泳和免疫杂交方法参考文献[5].2结果与分析2.1表达HA・SumO的黄曲霉重组菌株GHS(pyrG+)的构建构建GHS(pyrG+)重组菌株的过程如图2A所示.将5'-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumO CDS-3f-UTR融合片段转化黄曲霉CA14PTs(A^u70A?yrG)菌株原生质体，并筛选、鉴定GHS(pyrG+)阳性转化子，抽提总蛋白并用HA标签抗体和Actin抗体进行Western blot免疫杂交，分析黄曲霉GHS(pyrG+)重组菌株中的HA-SumO的表达水平和SUMO化修饰状态，结果如图2B所示.GHS(pyrG+)重组菌株中可以检测到HA-SumO 蛋白单体的条带，被SUMO化修饰的多种靶标蛋白条带也能被检测到，呈现阶梯状分布,而对照CA14PTs (L ku70L pyrG)菌株和WT(A^u70)菌株中都检测不到特异性杂交条带.第2期聂鑫怡等:黄曲霉中pyrG筛选标记循环利用的方法-273-AM123457.0kb4.0kb2.0kb1.0kb0.5kbA.构建5,-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumO CDS-3'-UTR融合片段的琼脂糖凝胶电泳图谱(M为DS10000DNA分子质量标准，泳道1为长度约1.2kb的sumO基因上游非转录区5'-UTR片段，泳道2为长度约1.9kb的pyrG表达元件，泳道3为长度约1.5kb的gpdA(p)片段，泳道4为长度约0.6kb的HA-sumO CDS-3'-UTR片段，泳道5为长度约5.2kb的5-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumO CDS-3'-UTR融合片段)；B.免疫杂交检测GHS(pyrG+)重组菌体内的SUMO化修饰状态［泳道1为CA14PTs(A^u70ApyrG)菌株总蛋白，泳道2为WT(A^u70)菌株总蛋白，泳道3为GHS(pyrG+)重组菌株总蛋白］.图2GHS(pyrG+)重组菌株的构建和验证Fig.2Construction and identification of the GHS(pyrG+)strain2.2GHS(pyrG+)重组菌株中pyrG遗传筛选标记的剔除分别从黄曲霉GHS(pyrG+)重组菌株基因组中扩增长度约1.2kb的sumO基因上游非转录区5'-UTR 片段和1.5kb的3’-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子gpdA(p)片段(图3A),并用重叠PCR法连接到一起,以巢式引物P9和P13扩增长度约2.4kb的融合片段55-UTR-gpdA(p)(图3B)，转化黄曲霉GHS(pyrG+)原生质体,并筛选、鉴定GHS(pyrG-)重组菌株阳性转化子.经鉴定,挑取的12个转化子中有3个为阳性转化子，阳性率为25%.如图3C所示,用引物P3和P4进行PCR扩增,GHS(pyrG+)基因组DNA中可扩增出约1.9kb的pyrG片段，而T3#、T7#和T11#转化子的基因组和阴性对照中则无法扩增pyrG片段；同时，利用引物P9对转化子T3#、T7#和T11#中扩增出的5'-UTR-gpdA(p)片段进行测序分析表明，阳性转化子的5-UTR-gpdA(p)片段的实际序列与理论序列一致(图3D).这些结果说明：GHS(pyrG+)基因组上整合的pyrG筛选标记已被剔除，且剔除过程不依赖pyrG筛选标记两端的同向重复序列，剔除pyrG筛选标记后GHS(pyrG-)阳性转化子基因组上也未残留重复序列；除了pyrG筛选标记外,GHS(pyrG-)阳性转化子与GHS(pyrG+)菌株的遗传背景一致.5'-UTRA.PCR扩增5-UTR片段(泳道1)和gpdA(p)片段(泳道2)的琼脂糖凝胶电泳图谱(M为DS2000DNA分子质量标准)；B.重叠PCR扩增 5-UTR-gpdA(p)融合片段(泳道1、2)的琼脂糖凝胶电泳图谱(M为DS5000DNA分子质量标准)；C.GHS(pyrG-)重组菌株阳性转化子的PCR鉴定［M为DS2000DNA分子质量标准，泳道1的模板为蒸馏水，泳道2和3的模板为CA14PTs(A^u70ApyrG)菌株基因组，泳道4的模板为GHS(pyrG+)重组菌株基因组，泳道5、6和7的模板分别为GHS(pyrG-)重组菌株T3#、T7#和T11#转化子基因组］；D.GHS(pyrG-)重组菌株阳性转化子基因组扩增5,-UTR-gpdA(p)产物测序结果的序列比对.图3GHS(pyrG-)重组菌株的构建和筛选Fig.3Construction and identification of the GHS(pyrG-)strain-274 -福建农林大学学报( 自然科学版)第50卷2.3 GHS (pyrG -)重组菌株的pyrG 营养缺陷表型转化子T3扒T7#和T11#在YGTUU 固体培养基上能够正常生长出细密的菌丝，而在YGT 固体培养基 上则不能正常生长，呈现尿嘧啶营养缺陷表型(图4A).这一结果证明，GHS(pyrG -)阳性转化子T3#、T7# 和T11#的营养缺陷型是正确的.BT3# T7# T11#GHS(pyrG-)阳性转化子HA 标签抗休杂交72 ku -43 ku 一34 ku 一26 ku —SDS-PAGE66 ku —45 ku 一35 ku -25 ku —18 ku —1 2 3 4 5 6SUMO 化修 饰靶标蛋白HA-Sum O 单体A.GHS(pyrG -)重组菌株阳性转化子的尿嘧啶营养缺陷表型鉴定；B •免疫杂交分析GHS(pyrG -)重组菌株阳性转化子的SUMO 化修饰状态:泳道1为蛋白分子质量标准，泳道2为GHS(pyrG +)重组菌株总蛋白，泳道3为WT( Aku70)菌株总蛋白，泳道4、5和6分别为GHS(pyrG -)重组菌株转化子T3#、T7#和T11#的总蛋白］.图4 GHS (pyrG -)重组菌株的性状表型和SUMO 化修饰状态Fig.4 Phenotype and SUMO modification status of the GHS(pyrG -) strain2.4 GHS (pyrG -)重组菌株的HA ・SumO 的表达水平分别提取WT(Aku70)菌株、GHS(pyrG +)重组菌株以及GHS(pyrG -)阳性转化子T3#、T7#和T11#的 总蛋白，利用HA 标签抗体进行免疫杂交分析，从蛋白水平上比较pyrG 筛选标记剔除前后SUMO 化修饰 状态是否有差异，并以SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色结果作为上样量对照.从试验结果来看,WT(4ku70)菌 株检测不到特异性杂交条带，而GHS(pyrG +)重组菌株和GHS(pyrG -)阳性转化子T3#、T7#和T11#都特异 性地表达了 HA-SumO 单体蛋白，体内还有许多被SUMO 化修饰的不同分子质量的靶标蛋白，呈现阶梯式 的分布，且GHS(pyrG +)重组菌株和GHS (pyrG -)各个阳性转化子SumO 的表达量和表达模式之间没有差 异(图4B).这些结果说明，按本研究的方法剔除pyrG 筛选标记不影响菌株的蛋白表达模式.3讨论本研究建立了一种新的乳清酸核苷-5'-磷酸脱 羧酶基因pyrG 遗传筛选标记循环利用的方法，仅需一个pyrG 遗传筛选标记的循环利用即可实现多次遗传转化操作，避免了不同遗传筛选标记的差异对真菌遗传背景和性状的影响；同时，该方法在剔除基因组中的pyrG 遗传筛选标记时不需要依赖同向重复序列和在URA/pyrG 两端插入重复序列，操作简单易行,且剔除pyrG 筛选标记后在基因组上不会残留 重复序列.由于许多真菌都以URA3/pyrG 作为遗传筛选标 记，本方法除了用于黄曲霉外，也可应用到以乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因URA 3/pyrG 表达元件作为遗传筛选标记的其他真菌中(应用方法如图5所 示),使得重组菌株重新获得尿嘧啶营养缺陷，再次 作为出发菌株循环利用URA3/pyrG 筛选标记进行遗传转化，为多基因、多位点的真菌遗传改造提供支持.卄up down up up up 卄-尿昔，尿卩密喘包含pyrG 的任一基因 改造同源重组片段pyrG 上游一下游融合片段+5'-FOA +尿昔，尿卩密喘down pyrG+重组菌基因组PyrG XDNA [ down pyrG-出发菌基因组—II-pyrG-重组菌基因组down —仆“X DNA ”表示真菌基因组上需要利用pyrG 进行改造的任一 DNA 片段，“ up"和"down ”分别表示pyrG 整合位点 上游和下游DNA 片段.图5 pyrG 筛选标记循环利用示意图Fig.5 Schematic diagram for the pyrGselectable marker recyclingsystem第2期聂鑫怡等:黄曲霉中pyrG筛选标记循环利用的方法-275-参考文献[1]B0TSTEIN D,FALC0S C,STEWART S E,et al.Sterile host yeasts(SHY):aeukaryotic system of biological containment forrecombinant DNA experiments[J].Gene,1979,8(1):17-24.[2]STRUHL K,STINCHC0MB D T,SCHERER S,et al.High-frequency transformation of yeast:autonomous replication of hybrid DNA molecules[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1979,76(3):1°35 -1°39.[3]B0EKE J D,LACR0UTE F,FINK G R.A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activityin yeast:5-fluoro-orotic acid resistance[J].Molecular and General Genetics,1984,197(2):345-346.[4]HUANG G,WANG H,CH0U S,et al.Bistable expression of WOR1,a master regulator of white-opaque switching in Candidaalbicans[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2006,103(34):12813-12818.[5]NIE X,YU S,QIU M,et al.Aspergillus flavus SUM0contributes to fungal virulence and toxin attributes[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2°16,64(35)：6772-6782.[6]DU T,0UYANG H,V0GLMEIR J,et al.Aspergillus fumigatus Mnn9is responsible for mannan synthesis and required for covalent linkage of mannoprotein to the cell wall[J].Fungal Genetics and Biology,2°19,128：2°-28.[7]CHRISTMANN M,SCHMALER T,G0RD0N 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利用WGCNA筛选马铃薯块茎发育候选基因
利用WGCNA筛选马铃薯块茎发育候选基因荐红举;张梅花;尚丽娜;王季春;胡柏耿;Vadim Khassanov;吕典秋【期刊名称】《作物学报》【年(卷),期】2022(48)7【摘要】块茎是马铃薯的主要经济器官,解析其形成和发育机制对于马铃薯高产育种具有重要意义。
虽然结薯相关基因已有报道,但仍有大量参与结薯的基因有待进一步挖掘和鉴定。
随着测序技术的不断革新和发展,转录组数据愈加丰富和繁杂,利用加权共表达网络分析(weighted gene co-expression networkanalysis,WGCNA)筛选特定性状、组织或发育阶段相关基因的方法被广泛应用。
本研究利用WGCNA分别对马铃薯DM 1-3516 R44(DM)材料以及RH89-039-16(RH)材料各15个组织器官的转录组数据进行分析,构建共表达网络,筛选与块茎发育相关的共表达模块。
对筛选表达模块中的基因进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。
以模块中连通度前10的基因为核心基因,用PGSC数据库和NCBI数据库进行注释,并利用qRT-PCR进行验证。
通过WGCNA分析,在DM和RH材料中均得到13个共表达模块,其中DM材料的Cyan模块和RH材料的Black模块与块茎显著相关。
分析表明,2个模块的基因显著富集在激素代谢、淀粉和蔗糖代谢以及细胞形成等相关过程中。
此外,在Cyan中注释到已被证实与块茎发育相关的基因StGA2ox1,并且在共表达分析中StGA2ox1与模块中10个核心基因均相互关联。
核心基因的qRT-PCR结果与RNA-Seq的结果基本一致。
本研究运用WGCNA方法鉴别了2个块茎发育相关的共表达模块,筛选出多个与块茎发育相关的候选基因,为马铃薯高产育种奠定基础。
【总页数】11页(P1658-1668)【作者】荐红举;张梅花;尚丽娜;王季春;胡柏耿;Vadim Khassanov;吕典秋【作者单位】西南大学农学与生物科技学院;南方山地农业教育部工程研究中心;薯类生物学与遗传育种重庆市重点实验室;国家马铃薯工程技术研究中心;S.Seifullin Kazakh Agrotechnical University Avenue 010011 of Kazakhstan【正文语种】中文【中图分类】S53【相关文献】1.Solanum etuberosum（＋）双单倍体Solanum tuberosum的可育体细胞杂交种及其回交子代：基因组剂量与块茎发育和马铃薯病毒Y抗性的关系2.马铃薯块茎形成相关基因STI-LIKE在拟南芥植株发育中的功能验证3.马铃薯块茎发育机理及其基因表达4.利用基因芯片筛选甘蔗成熟期叶片差异表达候选基因5.整合GWAS和WGCNA筛选鉴定甘蓝型油菜生物产量候选基因因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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责任编辑
罗芸
责任校对
卢瑶
植物筛选标记基因应用进展
王相春，程在全，曾千春，罗 琼
* （ 云南农业大学， 云南昆明 650201 ； 云南省农业科学院生物技术研究所， 云南昆明 650223 ）
AtTSB1 基因过量表达增加了 Trp 含量并且增强对 Cd2 + 的耐 AtTSB1 转基因植物中积累 性。通过以上研究结果得出结论， Trp 可以限制 Cd2 + 和其他重金属的增加， 或者抑制金属转运 物的活动。因此， 重要的禾本科作物应用 AtTSB1 基因作为 筛选标记基因遗传转化得到的转基因植株能够种植在重金 属污染的土壤中。 1． 9 氨基糖苷腺苷酰转移酶基因（ aadA） 双子叶植物叶绿 体转化多采用 aadA 基因， 用壮观霉素（ spectinomycin） 进行筛 选， 获得同质叶绿体转化细胞的筛选周期不同受体材料差异 分化植株的前期筛选一般 2 ～ 8 个月， 甜菜叶绿体转化 很大， 筛选 8 个月后才分化植株
得非常重要。生物安全性标记基因的优点主要在于选择剂 的无毒副作用， 并且在多数情况下有利于转化植株的再生， 从而提高了转化效率。利用生物安全性标记基因的筛选体 系也被称为正向筛选（ positive selection） ， 该体系有利于转基 因细胞的生长及再生， 而非转基因细胞只受到饥饿抑制而非 被杀死 1 1． 1
［9 ］
。但随着转基因植物
转基因植物中选择标记基因的 种类和种植面积的迅猛增加， 生物安全性已成为人们普遍关注的问题之一。因为抗生素 和除草剂等抗性基因的使用虽然方便了植物的转化， 但一旦 标记基因便不再有用， 甚至对生态环境和食品安 转化成功， 全存在潜在威胁
［3 ］
。因此， 对生物安全性标记基因的研究显
。利用皱叶烟草
突变体对 TFL 或者 AMP 的抗性， 在植物体细胞杂交实验中 应用 TFL 或者 AMP 作为筛选剂效果很明显。这些研究结果 为将来有效地应用 TFL 作为植物转化体系的筛选剂提供了 依据。 1． 5 磷酸甘露糖异构酶（ PMI） （ manA） 编码 PMI 的 manA
［11 ］
［19 ］
商业化生产。生物安全性标记基因应用的选择剂无毒副作 用， 有效地避免了抗生素和除草剂等抗性基因的安全性问 题， 而且在多数情况下有利于转化植株的再生， 进而提高了 转化效率
［10 ］
nptⅡ基因最
即氨基糖苷磷酸 初是从大肠杆菌转座子 Tn5 中分离得到的， 转移酶 Ⅱ 基因 ， 它编码的氨基糖苷磷酸转移酶使抗生素被 基因作为筛选标记基因可以使转 磷酸化而失活。因此 nptⅡ G418、 巴龙霉素、 新霉素等产生 化细胞对抗生素如卡那霉素、 抗性， 进而达到筛选的效果。目前， 该基因仍是植物基因工 程中运用很广泛的选择标记基因。 1． 2 潮霉素磷酸转移酶（ HPT） （ hpt ） 从大肠杆菌中分离 使其具有潮霉素 B （ Hygromy出来的 hpt 基因可以编码 HPT，
国家自然科学基金项目（ NSFC 31060201 ） 。 王相春（ 1986 － ） ， 男， 吉林白山人， 在读硕士， 从事植物转基 因研究。* 通讯作者， 副教授， 硕士生导师， 从事水稻分子 Em生物学研究， 0425 收稿日期 2011基金项目 作者简介
［13 ］
现 AtTSB1 基因在植物转基因中可以作为一种新颖的非抗生 对 5甲基色氨酸（ 5MT） 或重金属的选择既简便 素筛选标记， 又快捷。在含有 75μM 5MT 或者 300 μM CdCl2 的 MS 培养基 上筛 选 转 化 植 株 效 果 很 明 显
［22 ］
。经 研 究 得 知 拟 南 芥 中
植物转基因技术是利用遗传工程手段有目的地将外源 通过外源基因的直接表达， 或者通 基因导入植物基因组中， 过对内源基因表达的调控， 甚至通过直接调控植物相关生物 使植物获得新性状的一种品种改良技术 如病毒的表达，
［1 ］
cinB） 的抗性［6］。该基因的作用机理是 HPT 可以将磷酸基团 使其发生磷酸化而失 共价地加到潮霉素 B 的第 4 位羟基上， 去活性， 从而使转化细胞产生潮霉素抗性， 非转化细胞死 亡
39 卷 22 期
王相春等
植物筛选标记基因应用进展
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6培养基上， 甘露糖磷酸只有在转化细胞中 PMI 的催化下 6才能转变成果糖磷酸， 进入糖酵解途径被细胞利用。 所 以， 转化细胞可以利用甘露糖作为碳源来进行生长和再生， 而非转化细胞则不能利用甘露糖作为碳源， 因此造成体内甘 6露糖磷酸积累， 使糖酵解途径减少，并导致 ATP 新陈代谢 受阻和磷酸根离子的大量消耗， 从而生长受到抑制。该选择 体系与抗生素或除草剂筛选体系的区别在于抗生素和除草 “杀死” 剂直接 未转化植物细胞， 而甘露糖选择体系中的未转 “碳饥饿” 化细胞尽管处于 状态， 但不会立即死亡。在该筛选 体系中， 转化细胞的生长和再生过程可以利用筛选剂甘露 糖， 因而被称为正向筛选体系
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热厌氧杆菌中分离出来的。木糖是半纤维素的主要组成部 是生物体内含量仅次于葡萄糖的糖类 分， 。同甘露糖一 样， 木糖也是许多植物细胞不能代谢利用的糖类， 例如烟草、 马铃薯和番茄不能用 D木糖作为唯一碳源。然而木糖异构 sylose ketolisomerse） 可以催化木糖成为 DD酶（ D木酮糖， 木酮糖可作为碳源
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。
从牛筋草中分离得到的 α － 微管蛋
白基因突变体对二硝基苯胺类除草剂（ TFL ） 具有抗性。 目 前， 已经作为筛选标记基因应用于单子叶植物和双子叶植物 遗传转化研究工作中
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。这些标记基因的发展为今后植物遗传转化工作
。在牛筋草中， α － 微管蛋白基因的
下面就简单介绍几种筛选标记基因。 提供了更大的动力， 筛选标记基因简介 新霉素磷酸转移酶 II （ NPT II ） （ npt II ）
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因其选择效率高、 基因型差异小、 对转化细胞不产生或很少 再生的转基因植株育性较好等优点在水稻、 产生毒害作用、 玉米和小麦等作物上得到了广泛应用 1． 3
［8 ］
。目前， 大多数转基 编码 PAT 的 bar
均以 HPT 作为抗性选择标记。 因水稻的有关研究中， 草丁膦 N － 乙酰转移酶（ PAT） （ bar） 基因最初是从吸水链霉菌中分离出来的。PAT 能使草丁膦 的自由氨基乙酰化， 从而使草丁膦对植物无毒害作用。 bar 基因作为筛选标记基因的作用原理是在筛选培养基中加入 草丁膦时， 转入 bar 基因的细胞生长正常， 未转入的细胞则被 草丁膦杀死。 这种筛选体系具有快速简便、 高效， 细胞产生的假转化 体少， 并且使植物获得优良的抗除草剂农艺性状的优点。它 是目前用得最多的选择标记基因之一 1． 4 α微管蛋白基因
基因最初是从大肠杆菌中分离提取出来的
， 目前在酵母、
动物及人体中都已分离得到编码该蛋白的基因。然而， 除肉 桂（ Cinnamomum cassia） 和一些豆类外， 自然界的植物中大都 没有编码 PMI 的基因， 因此以甘露糖为筛选剂的筛选体系在 绝大多数植物的遗传转化中都可以应用
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。在甘露糖筛选
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体胚性愈伤到获得同质叶绿体转基因植株则长达 18 个月 。 单子叶禾本科植物对壮观霉素具有天然抗性， 因此， 水稻叶 绿体转化时 aadA 基因的筛选采用链霉素， 链霉素的作用机 愈伤组织阶段 理主要抑制非转化细胞分化绿苗和根的形成， 筛选效果很不明显， 后期分化绿苗以及生根阶段效果才体现 其作为禾本科作物的筛选标记， 效果并不理想。 出来， 2 前景与结论 筛选标记基因在植物遗传转化中极为重要， 它可大大减 能够方便快捷的区分转化细胞和非转化细胞。笔 少工作量， hpt 基因和 bar 基因均属于这类标记基 者介绍的 nptⅡ基因、 因， 存在抗生素敏感性、 除草剂的大量使用以及人类健康和 生态环境等潜在的安全威胁
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。这种筛选方法比 nptII 基因的筛选效
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率高 10 倍左右， 并且发芽更快 1． 7
。研究证明这种酶是生物 ABC 蛋白是植
， 严重限制了转基因植物的
安全的并且在食品工业中得到普遍应用。 拟南芥 ATP 结合域（ ABC） 转运蛋白 物中普遍存在的蛋白质。在 ABC 蛋白质家族中它们有 30% ～ 40% 的结构是相似的。拟南芥 ABC 转运蛋白是依据它们 结构域的 同 源 性 来 分 类 的， 但是它们的功能还不是很清 楚
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。据研究表明， 甘露糖筛选
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体系转化效率要高于卡那霉素选择体系
。有研究将转基
因玉米和甜菜中 PMI 基因所编码的蛋白质进行了全面的分 析， 他们认为甘露糖筛选体系对环境和人体健康都十分安 全
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。由于这种体系在筛选过程中涉及到对植物生长有毒
。棉花叶绿体转基因从枪击受
6害作用的甘露糖磷酸的积累， 以及 ATP 和磷酸根离子的 消耗等， 所以容易受到培养基或外植体内其他糖类水平等生 理因素的干扰， 结果导致甘露糖筛选的敏感性降低。因此该 筛选体系的完善还有待进一步的研究。 1． 6 木糖异构酶（ xylA） xylA 基因是由赤褐色链球菌和嗜
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研究表明它们对一系列除草剂具有较高 等位基因已经鉴定， 的耐性， 例如二硝基苯胺类和硫代磷酰胺酯（ APM） 。Yemets 等应用 α － 微管蛋白基因突变体作为筛选标记基因转化龙 山稷、 大豆、 亚麻和烟草， 利用 TFL 作为选择剂， 结果表明应 用 TFL 筛选转化植株比卡那霉素更有效
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。
。hpt 基因被证明是单子叶植物较为理想的筛选基因，
标记基因可以为获得真正的转化体提供有利的判断依据， 在 植物遗传转化过程中发挥着至关重要的作用。因此， 标记基 因的发展成为基因工程的研究热点。目前在植物遗传转化 均属于 中广泛应用的标记基因有抗抗生素和抗除草剂基因， 其成熟的技术体系和广泛的适用性， 传统的选择标记基因， 使得转化工作能够更加顺利地开展