变形梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳《变性梯度凝胶电泳》是一种有效的分离技术，它可以帮助科学家快速有效地分离不同类型的分子。
它和其他分离技术相比，有着独特的优势和不可替代的优势。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）采用特殊的凝胶在不同变性环境中电泳，以有效地分离不同类型的DNA片段和蛋白质。
正常情况下，由于更多的低能量的片段的存在，特定的变性环境会吸引这些较低能量的片段，并且它们走的路程也会比较短，而其他高能量的片段则会走的路程会更长。
因此，将凝胶改变到一种低能量的片段可以吸引，而走得路程更长的片段，则可以有效地将这些片段分离开来。
DGGE的优点是它可以有效分离不同片段的DNA和蛋白质，并且可以更快地分离出更多的细小片段。
此外，由于DGGE有一个独特的低能量环境，它可以更好的区分不同的片段，而不会受到其他分离技术的限制。
另外，DGGE是一种半定量的分离技术，可以让研究者比较不同片段之间的相对含量。
除了上述优势，DGGE还具有一些缺点。
首先，由于梯度凝胶电泳系统搭建起来比较复杂，使用它来进行分离技术需要比较复杂的实验技术。
其次，由于梯度凝胶电泳系统比较复杂，对系统的调整和控制非常复杂，只有熟练的实验室人员才能处理好这些技术。
变性梯度凝胶电泳的应用非常广泛，它可以用来分离和分析不同类型的DNA片段和蛋白质，甚至可以用来检测细菌的抗药性。
它也可以用来研究基因的多样性，用于癌症和免疫系统的研究，以及对特定疾病的诊断。
最后，它也可以作为一种植物鉴定技术，用于比较不同植物类型间的分子差异。
总之，变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种有效的分离技术，它可以用于研究不同类型的DNA片段和蛋白质，还可以用于分析肿瘤细胞的分子结构，对特定疾病的诊断和植物鉴定。
它具有独特的低能量环境，可以更好的区分不同的片段，而不会受到其他分离技术的限制。
它具有快速、高效和半定量的优势，是研究DNA分子和蛋白质的有效分离技术。
变性梯度凝胶电泳技术及其在人工湿地及养殖水体中应用的研究进展
（ １ ． 南京农业 大学无锡渔业学院 ， 江苏无锡 ２ １ ４ ０ ８ １ ；
２ ． 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心／ 农业部 淡水渔业和种质资源利用重点实验室， 江苏无锡 ２ １ ４ ０ ８ １ ）
摘要 ： 简要 介绍了 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术的基本原理及技术路线 ， 概述 了该技术在检测 中存在 的主要优缺点并对其存在的主 要缺点进行 了技术优化 ， 重点综述了 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术在人工湿地及养殖水体微 生物群落 多样 性和动态性 研究 中的最新进
Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术是所有可 以不依赖培养指 纹技术 中应用最广
泛 的技术之一 ， 它经 常被用 来评估环境样 品 中的微 生物群落 结构， 并且 随着 相应 的环 境变 化来 决定 微生 物群 落 的动态 性 。所采 用的 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术与以往 的电泳技 术不 同， 它不是
将分子量不 同的 Ｄ Ｎ Ａ分 子分开 ， 而是将序列 不 同的 Ｄ Ｎ Ａ分 子分开 ， 该Ｄ Ｎ Ａ分子在 聚丙烯酰胺凝胶电泳中根据变性剂浓 度梯度 的不 同彼此之 间相 互分离 。该技术 的主要原理如 下 ： 当双链 Ｄ Ｎ Ａ分子 在含梯度 变性剂 （ 尿 素、 甲酰胺 ） 的聚丙烯
的微生物群落 ， 然后开发微生物制剂 。研究发现 ， 微生物群落 对有机物质 的矿化 和 氮、 硫、 磷 等物 质 的移 除 至关 重 要 。
一
稳定 和提高提供理论基础 ， 而此是 一个值得研 究的课题 。本
文简要概述 了 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ相 关 的原 理及 技 术路 线 ， 重 点介 绍 了 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术在人工湿地和养殖池塘中应用 的最新研究进展。
目前 ， 关于湿地科学 的研 究主要集 中在湿地资 源的开发
变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳摘要：变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelE1ectrophoresiS，DGGE）是由Fisher 和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其主要是基于突变型和野生型棱酸序列的不同而导致其变性浓度的差异，利用变性梯度凝胶进行分离, 该手段分辨率达一个碱基。
恒定变性凝胶电泳(CDGE)、瞬时温度梯度电泳(TTGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)是由DGGE经改进而成。
它们在突变分析上都有着重要的作用。
关键词：变性梯度凝胶电泳、恒定变性凝胶电泳、瞬时温度梯度电泳、温度梯度凝胶电泳1、前言：随着结构基因组计划接近尾声，人类基因神秘的面纱已逐步揭开，GenBank中已知基因的数目也与日俱增，各种遗传病的相关基因也了解得越来越多。
但是，在找到了候选基因后，还需要在相关的遗传病病人中进行突变检测，只有找到了相应的突变。
才能真正确定该基因与疾病的关系，从而服务于临床。
变性梯度凝胶电泳就是一种很有实用价值的突变分析方法。
该方法经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel elec—trophoresis，CDGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperature gradient electrophoresis，TTGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel elec—trophoresis，TGGE)。
现在上述方法已经广泛应用于遗传病的诊断、突变分析和肿瘤相关基因的筛查等许多方面。
2、基本原理2.1变性梯度凝胶电泳由Fisher和Izrman口3于1983年创立，以后该技术和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。
它主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。
电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子太小有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降低了迁移速率。
《中国药典》(2020版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）SDS-PAGE法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。
本法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
本法用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂（1）水。
（2）分离胶缓冲液（4×，A液） 1.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调节pH值至8.8，加水稀释至100mL。
（3）30%丙烯酰胺溶液（B液）称取丙烯酰胺58.0g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200mL，滤纸过滤（避光保存）。
（4）10%SDS溶液（C液）称取十二烷基硫酸钠10g,加水溶解并稀释至100mL。
（5）四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）商品化试剂。
（6）10%过硫酸铵溶液（E液）称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100mL。
建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。
（7）浓缩胶缓冲液（4×，F液）0.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。
（8）电极缓冲液（10×）称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至约800mL，用盐酸调节pH值至8.1~8.8之间，加水稀释至1000mL。
（9）非还原型供试品缓冲液（4×）称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40m1，加水溶解并稀释至约80mL，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至100mL。
TGGE变性梯度凝胶电泳DGGE-Equl
变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）变性梯度凝胶电泳（DGGE）产品说明DGGE变性梯度凝胶电泳系统包括内置式温度控制系统、可编程控电源、梯度凝胶生成器、内置式缓冲液循环泵及搅拌桨、电泳槽、梯度生成器、制胶配件及玻璃板等。
DGGE介绍：变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。
基本原理基于当双链DNA 在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。
由于变性梯度凝胶电泳法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。
DGGE原理：变性梯度凝胶电泳系统(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)的原理是使用一对特异性引物，PCR扩增微生物自然群体的16s rRNA基因，产生长度相同但序列有异的DNA片段的混合物。
然后用变性梯度凝胶电泳分离产物混合物。
变性梯度凝胶电泳DGGE胶是在6％聚丙烯酰胺胶中添加线性梯度的变性剂，变性剂的浓度由上到下，从低到高成线性梯度。
在一定温度下，在同一浓度的变性剂浓度下，序列不同的产物，其部分解链程度也不同，而产物解链程度又直接影响其电泳迁移率，结果不同的产物在凝胶上分离开来。
在引物的5’端加上40个碱基左右的G-C串可使变性梯度凝胶电泳DGGE对序列差异的分辨率提高到近100％。
所以变性梯度凝胶电泳法可用于微生物群落结构的研究、微生物种群动态的分析、富集培养物及分离物的分析、核糖体RNA同源性的分析。
(完整)PCR-DGGE技术
PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变 .Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。
后来又发展出其衍生技术,温度梯度凝胶电泳(TGGE）。
该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷.不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样,因此不能被区分.DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。
一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链.当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。
当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样.然而一旦DNA片段迁移到一特定位置,其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。
部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。
因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度,因此它们会在胶中不同的位置分开.然而，一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域变性剂浓度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子,此时他们又能在胶中继续迁移.因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。
变性梯度凝胶电泳.
4.平行变性梯度凝胶电泳
变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度,制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶,检测各标本是否存在突变。
PCR产物加上样缓冲液后,25μl~30μl/孔,电压150V,温度60℃,时间3~6小时。
实验材料
∙DNA样品
试剂、试剂盒
∙尿素
∙去离子甲酰胺
∙丙烯酰胺
∙甲叉双丙烯酰胺
∙琼脂糖
仪器、耗材
∙PCR扩增仪
∙变性梯度凝胶电泳仪
∙凝胶成像及分析系统
∙ห้องสมุดไป่ตู้外透射仪
∙高速离心机
∙电泳仪
∙电泳槽
∙微量加样器
∙Tip头
∙Tip头盒
∙Eppendorf管
∙Eppendorf管架
一、实验原理
变性梯度凝胶电泳(DGGE是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链,称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度(Tm。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下:温度50~60 ℃,变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时,此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值,此区便开始熔解,而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变,达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列,即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此,DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。
为了提高DGGE的突变检出率,可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。GC夹(GC clamp就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构,这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区,使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此,DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。
PCR-DGGE技术
PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。
Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。
后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（TGGE）。
该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷。
不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。
DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。
一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。
当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。
当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。
然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。
部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。
因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度，因此它们会在胶中不同的位置分开。
变性梯度凝胶电泳技术在微生物实验教学中的应用
物多样性的Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 检测结果的重要 因素 ， 学生通过 比较不 同提取 方 法对 Ｄ Ｎ Ａ 产量 和纯 度 的影 响 ，确 定 了针 对不 同的 实验样品（ 土壤或污泥 ） 的最佳提取方法 ， 在这一过程中加 深 了对Ｄ Ｎ Ａ 提取原理和方法的认识 。通过Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 图谱的分 析 ，学 生可 以直 观地 了解 到 污染胁 迫 等环 境 条件 下微 生物 群落结构的改变及优势菌群形成的动态过程 ，更加深刻地 理 解 富集 培养技 术 在分 离特 定功 能微 生物 上 的应 用 。学生 通 过后 续 的序列 比对分 析 ，可 以学 习到相 关环 境 中常 见 的 微 生物 优势 菌 属 ，特 别 是一 些非 培养微 生 物序 列 的 出现 丰 富 了学 生对 微 生物 多样 性 的认 识 。通 常 面 向本 科 生开 设 的
、
生物 以未可培养的形式存在。Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 是一种不依赖微生物 培养 技术 的研 究方 法 ，能快 速 、准确 鉴定 环 境 中微 生物 种 群 ，在揭 示复 杂微 生物 群落 演替 规律 和 功能 基 因多 样性 方 面具 有独 特 的优越 性 ，已被 广泛 应用 于微 生 物分 子 生态 学 研 究 各领 域闭 。Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 技 术的基 本 原理 是在 聚丙 烯酰 胺凝 胶
力、 动 手能 力有 着积 极 的作用 ＿ ｌ ＿ １ 】 。 本校 非 常重 视实 验教学 改 革工 作 ，鼓励 学 生在 掌握 基 本实验技能后 ， 积极参加设计性 、 研究性实验 ， 包括院校两 级 的大学 生科 研 立项 或教 师 的研究 课题 ，并 给 予相 应 的创 新学分。 通过 该项 措施 进 一步激 发 了学 生 的学 习兴趣 ， 并 有 效提 高 了学 生 的实 验技 能 及分 析 问 题 和解 决 问题 的能 力 。 目前 微 生 物 实验 教 学 主要 包括 传 统 的微 生 物 实验 技 术 ， 随 着分 子生 物技 术 的发 展 ， 微 生 物研究 技 术 突破 了 以往 主要
变性梯度凝胶电泳DGGE实验报告
变性梯度凝胶电泳DGGE刘琳 1131428 环境科学一、 实验目的1． 学习掌握变性梯度凝胶电泳的原理和方法。
2． 练习变性梯度凝胶电泳的操作步骤。
3． 分析并掌握变性梯度凝胶电泳的思路，并了解其在微生物群落研究中的地位。
二、 实验原理双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。
不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在凝胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。
DGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。
不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。
同样长度但序列不同的DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。
然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移。
因此，如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。
DNA 片段在DGGE 胶中的迁移行为（如下图）：变性剂LowHigh在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（一般30-50个碱基对），使DNA 片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA 片段在DGGE/TGGE 胶中完全解链。
当加了GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开（Myers, 1985)。
DGGE 有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。
垂直电泳是为了确定变性剂梯度；而水平电泳则是对比分析不同样品的微生物差异。
本次试验做的是水平电泳，主要对比分析不同样品的微生物差异。
三、 实验器材与药剂器材：DGGE system (D-Code, Bio-Rad)、移液管、移液枪、枪头、制胶设备、30ml 针筒、聚乙烯细管、电泳仪试剂：16s rDNA V3区PCR 扩增产物、胶浓度为8%变性剂浓度分别为0%和90%丙烯酰胺胶、50×TAE buffer、去离子甲酰胺、尿素、去离子水、10%过硫酸铵(Aps)、TEMED 、sDNA 染料 变性剂Low high四、实验步骤1．首先按照实验要求将50x TAE buffer稀释为1×TAE buffer，并利用90%和0%的变性胶分别配置15.5ml的35%和55%的变性胶溶液。
变性梯度凝胶电泳在微生物多样性分析中的应用及其技术发展
变性 梯 度 凝 胶 电泳 在 微 生 物 多样 性 分析 中 的应 用及 其 技 术 发 展
徐玲玲 ， 刘亚洁 ， 李 江 ， 徐蔚云
（ 华 理 工 大学 ， 两 抚 州 东 汀 ３４０ ） ４ ０ ０
摘
要： 变性 梯 度 凝 胶 电泳技 术是 目前研 究微 生物 群 落遗 传 多样 性 及 种 群 动 态 性 有 效 手段 已被 广 泛 应 用 于 土 壤 、 性 污 活
薛凯在pcrdgge研究土壤微生物多样性中应用gc发卡结构的效应期刊论文生态学报200310利用时间进程法优化活性污泥dgdgge图谱期刊论文生物技术200602红树林土壤细菌群落16srdnav3片段pcr产物的dgge分析期刊论文微生物学报200502dgdgge分析产氢发酵系统微生物群落动态及种群多样性期刊论文生态学报200507采用fishdgge和cloning对短程脱氮系统中硝化菌群的比较分析期刊论文环境科学学报2006059burrdenaturinggradientgelelectrophoresiscanrapidlydisplaybacterialdiversitycontained16srdnaclonelibraries外文期刊20060410cocolinl
泥 、 物 膜 、 物 肠 道 、 泉 、 泊 等环 境 微 生物 生 态 学研 究 。 阐述 了 变性 梯 度 凝 胶 电 泳 的 原 理 ， 析 其 在 微 生 物 多样 性 分 生 动 热 湖 分
析 方 面 的优 越 性 及 局 限 性 ； 着 重介 绍 了 Ｐ Ｒ Ｄ Ｇ 应 用 过程 中的技 术发 展 ， 并 Ｃ —Ｇ Ｅ 包括 Ｃｏｉｇ Ｄ Ｇ Ｇ — Ｇ Ｅ， ｅｔｄＰ Ｒ ｌｎｎ／ Ｇ Ｅ， Ｃ Ｄ Ｇ Ｎ ｓ Ｃ — ｅ
(新)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)
样品制备：
蛋白质样品需变性并结合SDS，形成所带负电荷相 对一致的非折叠衍生物。 四人一组，取一1.5离心管，加入30ul鼠IgG样品 和30ul样品缓冲液，混匀后沸水浴5分钟， 3000rpm离心数秒，每人取10ul加样。
电泳
连接电泳仪，选择电压为40伏，蓝色指示剂移动 至凝胶底部即停止电泳。 取出玻璃板，用保鲜膜包好，置冰箱待明日做蛋 白印渍（Western－Blotting）。
5. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入已制好分离 胶的玻璃板间，灌满后，小心插入梳子，静置 30分钟。 6. 待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。小心取出玻 璃板，取掉垫条后，缺口朝内放入电泳槽主体， 插入斜楔板。 两组用一个电泳槽主体，两组玻璃板间即为上 槽。 7. 装好的电泳槽主体放入下槽，往上下槽加入 Tris－甘氨酸电极缓冲液。用滴管冲洗凝胶顶 部，并赶走底层的气泡。
制备顺序为先灌制分离胶，然后在分离胶上灌制 浓缩胶： （四人一组） 1. 在两块玻璃板间夹以垫条，用手夹住玻璃板放入 电泳槽主体内，缺口朝外，再插入斜楔板。 2. 拿一小烧杯，按下表加入各试剂： （12％分离胶） 单体溶液 4ml 分离胶缓冲液（pH8.8） 2.5ml 超纯水 3.3ml 10％SDS 100ul 10％TEMED 30ul 10%过硫酸铵 70ul
3. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入两玻璃板间， 灌注高度为红色背景下沿线。然后滴上少量水饱 和异丁醇，静置约15分钟。 4. 待凝胶与异丁醇出现分层时，倒去异丁醇，用洗 瓶冲洗凝胶顶部，然后拿一烧杯，按下表加入各 试剂： （4％浓缩胶） 单体溶液 0.4ml 浓缩胶缓冲液（pH6.8） 0.38ml 超纯水 2.15ml 10％SDS 30ul 10％TEMED 15ul 10%过硫酸铵 30ul
PCRDGGE技术
PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。
Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。
后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（TGGE）。
该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷。
不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。
DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。
一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。
当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。
当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。
然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。
部分解链的DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧下降。
因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度，因此它们会在胶中不同的位置分开。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)
DGGE在微生物生态学中的应用
1）广泛应用于各微生物生态系统，包括土壤 ， 活性污泥，人体和动物肠道，温泉，植物根系， 海洋，淡水湖，油藏等。绝大部分研究都是通 过扩增细菌或古细菌的 16S rRNA 基因来研究 各生态系统中的细菌或古细菌群落多样性。也 有用真菌的通用引物扩增 18S rRNA 基因 ， 从而研究真菌的群落多样性。
做DGGE注意事项
1、配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的 各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污 染。 2、制胶是实验的关键，用连有聚乙烯管标有‘高浓 度’的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶 操作同上，在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮， 将凝胶液匀速地灌入玻璃板。 3、分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统 的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确! 再将注射器的聚丙烯管同 Y 形管相连。
微生物生态学中应用的缺点
除了前面提到过的一些优缺点，分析微生物群落结构组 成是还存在以下缺点： 1、分析微生物群落结构组成时，有很多偏差。不同细菌 的基因组大小和核糖体 RNA 拷贝数不同；提取基因 组总 DNA 时细胞的裂解效率不同；DNA提取和纯化 时有偏差；PCR 扩增过程中有偏差。 2、DGGE一般只能分析 500 个碱基对以下的 DNA 片段， 因此得到的系统进化相关的信息就很少
2）能快速同时对比分析大量的样品。因此它既可以对比 分析不同的微生物群落之间的差异，也可以研究同一 个微生物群落随时间和外部环境压力的变化过程。 3）它可以跟踪监测细菌的富集和分离，从而评价不同培 养基及培养条件对分离菌种的影响 4）检测单个纯菌 rRNA 基因的微异质性；比较不同的 DNA 提取方法；另外，它还可以辅佐筛选克隆以 及检测 PCR 和克隆过程中的偏差
变性梯度凝胶电泳 DGGE
变性梯度凝胶电泳Denaturing Gradient Gel Electrophoresis变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)的方法应用于探究微生物的多样性，使得DGGE技术迅速成为了一项简单、可行的微生物多样性检测手段。
DGGE技术是根据长度相同但序列不同的DNA片段特点，在含有变性剂梯度的凝胶上，因其解链的变性浓度的不同而导致迁移率不同的原理而将DNA片段分离开的一种方法。
理论上DGGE能将仅存在一个碱基差异的DNA片段分开，而实际上，其分辩率较低且操作重复性差使得该方法仍然存在一些问题。
更重要的是，随着科技的突飞猛进，DGGE技术已逐渐被高通量测序所取代。
一、试剂与仪器1. 材料1.1 实验试剂表1.1 实验试剂一览表Table 1.1 The list of reagents试剂来源或生产公司EDTA Genebase®，Genebase Gene-Tech公司去离子甲酰胺分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司十二烷基磺酸钠Genebase®，Genebase Gene-Tech公司Tris碱Genebase®，Genebase Gene-Tech公司APS Genebase®，Genebase Gene-Tech公司TEMED Genebase®，Genebase Gene-Tech公司N，N’甲叉双丙烯酰胺Genebase®，Genebase Gene-Tech公司Gel-red染色液Biouim，美国氯化钠，二氯甲烷，甲醇等江苏永华精细化学品有限公司1.2 主要仪器设备表3.2 实验仪器一览表Table 3.2 The list of instruments and equipments仪器名称来源或出厂公司DGGE电泳仪Bio-Rad公司，美国EL 104电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司pH计梅特勒-托利多仪器有限公司-20℃低温冰箱海尔公司Milli-Q纯水系统Millipore公司，美国G-560E型旋涡混合器Eppendorf公司，德国5810D型低温冷冻离心机Eppendorf公司，德国全套微量移液器Eppendorf公司，德国1.3 相关溶剂及试剂配制(1) EDTA溶液(0.5 M，pH 8.0)：取1000 mL的烧杯加约800 mL超纯水，称取186.1 g EDTA逐量加入并用磁力搅拌器搅拌加速其溶解，随后用NaOH调节溶液的pH值至8.0，然后用1000 mL的容量瓶定容至1000 mL。
变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳是一种比较新型的电泳技术，它可以有效地用于分离和分析复杂的蛋白质组。
变性梯度凝胶电泳的原理是建立一种特殊的梯度，使用不同的离子强度来分离和收集分子。
由于离子强度是一个逐步变化的量，可以提供不同的环境条件，从而形成分子的各种簇，并将其运转至电泳柱的不同部位。
变性梯度凝胶电泳技术主要用于蛋白质分离和分析。
它可以更好地分离具有相似分子量的蛋白质，因为它可以根据溶解度，分子大小和芳香性等其他因素来调节电泳条件来实现有效的分离。
因此，变性梯度凝胶电泳技术可以用于解决较难分离的蛋白质，因为它可以根据空间分布来分辨蛋白质，并且实验结果更精确。
另外，变性梯度凝胶电泳可以应对大量的样品，更有效地分离出病毒感染的蛋白质，便于研究蛋白质的分子结构、活性和功能等相关信息。
变性梯度凝胶电泳的实验操作非常简单，准备一个用于变性梯度凝胶电泳的实验室，需要一台变性梯度凝胶电泳仪，并准备一种特殊的凝胶，可以在改变离子强度的基础上建立梯度。
然后将样品和标准样品混合后，放入变性梯度凝胶电泳仪中，开始电泳，随着离子强度的不断改变，蛋白质分子会呈现出不同的分布状态，最后在合适的时间内收集电泳带，完成变性梯度凝胶电泳的实验。
由于变性梯度凝胶电泳技术是一种比较新型的分析技术，所以也可以用于核酸分离和定量鉴定。
这种技术可以检测DNA和RNA的结构和数目，并可以调整梯度条件以更好地分离反应物，以达到最佳测定结果。
此外，变性梯度凝胶电泳技术还可以用于生物分子组学研究，以充分发挥它的作用。
总的来说，变性梯度凝胶电泳是一种新型的分析技术，可用于蛋白质和核酸的分离、定量和分析，以及组学研究，具有习惯性，灵敏度和效率高等特点，已经成为了当今生物分析中常用的分析手段。
变性梯度凝胶电泳技术在发酵微生物多样性研究中应用
变性梯度凝胶电泳技术在发酵微生物多样性研究中应用摘要：研究发酵过程中微生物多样性情况对于了解微生物群落结构以及优势功能菌群的动态变化具有十分重要的意义。
文章综述了变性梯度凝胶电泳技术的基本原理、研究方法及其在发酵微生物多样性研究中的应用，为该技术能够在发酵微生物分子生态学研究中得到更广泛的应用起到推动作用。
关键词：变性梯度凝胶电泳技术；发酵；微生物中图分类号：ts201.3 文献标识码：a 文章编号：1674-0432（2012）-11-0049-2微生物发酵是利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。
微生物发酵生产水平主要取决于微生物种类、菌种本身的遗传特性和培养条件。
因此，微生物在发酵工程中起着核心作用。
在发酵的各个阶段，不同的微生物发挥着不同的作用，研究发酵过程中微生物多样性情况对于了解微生物群落结构以及优势功能菌群的动态变化具有十分重要的意义。
随着分子生物学的快速发展，环境微生物多样性免培养研究近年来逐步开展起来，该方法克服了经典培养方法的不足以及引起种群丢失等的缺陷，利用分子生物学技术准确高效地获得环境样品中各种微生物的菌落指纹和特征性核苷酸序列，确定微生物的多样性及其分类地位，揭示和丰富了生态环境的微生物资源，突破了环境微生物多样性研究的瓶颈，大大加速了微生物分子生态学的研究进程。
其中基于核糖体rna（rrna）分子标记的变性梯度凝胶电泳（denaturing dradient gel electrophoresis，dgge）技术，现已成为开展微生物物种多样性和动态变化研究的分子检测工具之一，广泛应用于微生物研究领域。
1 dgge分析技术的原理dgge分析技术最早是由fischer等[1]在1983年提出的一种检测点突变的电泳技术，muyzer等[2]于1993年首次将这种技术应用于微生物群落结构研究中。
该技术是使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶对一组特定引物所扩增出的具有相同长度的特定dna 片段进行电泳，因为特定片段碱基序列不同，这就决定了它们具有不同的解链区域，因此在进行变性梯度凝胶电泳时，长度相同而在碱基序列上存在差异的dna双链的解链需要不同的变性剂浓度。
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变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE），是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。
具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导致其迁移速率变慢。
由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用的分子标记方法。
DGGE最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。
Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究，并证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。
此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，现已广泛应用于生物多样性调查、亲缘关系鉴定、基因突变检测等多个领域。
这一技术能够提供群落中优势种类信息，并同时分析多个样品，具有可重复和操作简单等特点，适合于调查种群的时空变化。
而且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析，鉴定群落组成。
DGGE通过逐渐增加的化学变性剂线性浓度梯度，可以把长度相同但只有一个碱基不同的DNA片段分离。
作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。
DGGE的突变检出率为99%以上。
（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。
（3）非同位素性。
DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。
（4）操作简便、快速。
DGGE一般在24小时内即可获得结果。
（5）重复性好。
但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。
DGGE的基本原理及方法：DGGE不是将分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开。
该方法的原理是根据DNA 的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同，混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时，相对应的DNA发生解链变性，导致电泳迁移速率降低。
由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同，从而使不同DNA分子得以分离。
根据变性剂梯度方向的不同，DGGE可分为：垂直DGGE，即变性剂梯度与电场方向垂直，常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围；平行DGGE，其变性剂的梯度和电场方向平行，主要用于解链范围明确的DNA片段的检测。
DGGE对微生态的分析一般包括三个步骤：核酸提取、16SrRNA序列的PCR扩增以及DGGE指纹图谱分析。
有些学者通过克隆、测序建立微生物区系的16SrRNA/DNA文库，通过系统发育分析，建立进化树，从而获得微生物多样性信息，但这种方法相对于指纹图谱技术来说，费时费力，价格也相对昂贵。
核酸提取：微生物总DNA的提取是整个分子生物学技术的基础，是否能获得具有代表性的总DNA样品将决定后续分析的可行性。
一般认为微生物提取总DNA的方法分为细胞裂解和核酸抽提两个步骤。
细胞裂解有三种：机械法、化学法和酶法。
机械法包括玻璃珠法、超声波法、冻融法等；化学法包括加入SDS、苯酚等；酶法包括加入裂解酶、蛋白酶K 和溶解酶等。
而许多研究者用其中两种或三种方法进行组合，发现组合后提取总DNA 的效果较好。
Stahl等（1988）在含有SDS和酚的体系中加入适量的玻璃微珠，机械法裂解瘤胃样品中的菌体细胞。
Zhu等用酶法和玻璃珠相结合的方法提取鸡盲肠内容物的微生物总DNA。
核酸抽提一般用酚-氯仿-异戊醇抽提，这种方法对去除杂蛋白有良好的效果。
Reichardt等（1994）认为，CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法也是常用的方法，不需要贵重仪器，操作较为简单，能广泛适用于各种植物的核酸提取，纯度也能满足许多分子生物学操作的要求，所以使用日趋广泛。
16SrRNA基因序列的PCR扩增：细菌按沉降系数分为5S、16S和23S三种，16SrRNA 基因是细菌染色体上编码该rRNA的相应DNA系列。
16SrRNA基因序列全长1540bp，有保守区和可变区之分，每种细菌的保守区都是相同的，能反映生物种类的亲缘关系，为系统发育重建提供线索；可变区因细菌种类而异，通过保守区设计引物，扩增出可变区，就可以得知微生物多样性信息。
大多数情况下，可根据16SrRNA V3区和V6-V8区设计细菌特异性引物进行PCR扩增，有时为了更加准确得获得微生物多样性的信息，可先通过细菌16SrRNA序列全长通用引物进行PCR扩增，再对V3或V6-V8区进行扩增。
Yu等的研究表明，通常使用16S的V3区进行PCR扩增后进行DGGE分析，如果所测的序列长度比较长时，也可以使用16S的V3-V5或V6-V8区。
DGGE指纹图谱分析：目前，DGGE电泳图谱的分析最常用的是相似性聚类分析法。
DGGE胶通过扫描仪输入计算机，通过Molecular Analysis软件进行相似性分析。
通过DGGE后得到的指纹图谱，每一个条带代表某个微生物优势菌群，通过测序和序列比对，可以得出此优势菌群的种类。
DGGE 操作步骤1、将海绵垫固定在制胶架上，把类似“三明治”结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。
2、共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm，短的那根长9cm。
将短的那根与Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在30ml 的注射器上。
3、在两个注射器上分别标记“高浓度”与“低浓度”，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置。
4、反时针方向旋转凸轮到起始位置。
为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。
将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。
例如16×16cm gels(1mm thick)：设体积调整装置到14.5。
5、配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。
6、每管加入18 μl TEMED，80 μl 10%APS，迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。
用连有聚乙烯管标有“高浓度”的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上。
7、通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动溶液到聚丙烯管的末端。
注意不要将胶液推出管外，因为这样会造成溶液的损失，导致最后凝胶体积不够。
8、分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确，再将注射器的聚丙烯管同Y 形管相连。
9、轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中。
10、小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时。
并把电泳控制装置打开，预热电泳缓冲液到60℃。
11、迅速清洗用完的设备。
12、聚合完毕后拔走梳子，将胶放入到电泳槽内，清洗点样孔，盖上温度控制装置使温度上升到60℃。
13、用注射针点样（预先准备好的活性污泥16S rDNA V3区PCR 扩增产物，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化）。
14、电泳（200V，5h）。
15、电泳完毕后，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘中。
用去离子水冲洗，使胶和玻璃板脱离。
16、倒掉去离子水，加入250 ml 固定液（10% 乙醇，0.5% 冰醋酸）中，放置15min。
17、倒掉固定液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入250 ml 银染液（0.2% AgNO3，用之前加入200μl 甲醛）中，放置在摇床上摇荡，染色15min。
18、倒掉银染液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入250 ml 显色液（1.5% NaOH，0.5% 甲醛）显色。
19、待条带出现后拍照。
DGGE操作注意事项1、配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。
2、制胶是实验的关键。
在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。
3、灌完胶后，立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。
4、DGGE的电泳缓冲液要超过“RUN”刻度线，不要超过“Maximam”刻度线。
5、点样时，要用小型注射器，伸入点样孔底部点样。
6、银染的整个过程中，一定要戴手套。
以避免手接触胶而带来的污染。
7、每次用完仪器后要及时清理，清洗玻璃板培养皿等玻璃仪器。
实验中常见问题分析1、DGGE图谱的优化：利用DGGE分析复杂样品时，获得高分辨率的图谱是重要的前提条件。
影响DGGE 分辨率的因素很多。
如DNA(或RNA) 提取效果、PCR(或RT-PCR) 扩增效果、电泳时间、电泳温度、凝胶浓度、变性剂梯度、染色方法等。
在DGGE 的操作过程的每一个环节都会对后续分析产生影响并导致误差的产生，因此为了获得DGGE 的最大分辨率，必须对全部环节进行优化。
2、DGGE图谱的分析：在获得DGGE 图谱后，需要对图谱中条带的核酸序列进行分析，并对图谱进行统计学分析，阐述不同样品间的关系，从而合理的解释复杂的指纹图谱。
随着DGGE 的广泛应用，一些统计学方法也不断应用于图谱的分析。
这些分析方法从不同角度对图谱进行归纳总结。
如解释群落结构和演替规律，种群遗传多样性，优势条带的位置和强度分析等。
无论选择哪种分析方法，对数据分析时得到的结论都应该是一致的。
参考文献J. 萨姆布鲁克，E.F. 弗里克，T. 曼妮阿蒂斯. 1992. 分子克隆实验指南，第二版. 金冬雁等译. 北京：科学技术出版社邢德峰，任南琪. 2006. 应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析[J]. 微生物学报46（2）：331-335宫曼丽，任南琪，邢德峰. 2004. DGGE/TGGE 技术及其在微生物分子生态学中的应用.微生物学报[J]，2004 ，44（6）：845-848Muyzer G，Smalla K. 1998.Application of denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）and temperature gradient gel electrophoresis （TGGE）in microbial ecology[J].Antonie van Leeuwenhoek，1998，73：127-141Kisand V，Wikner J. 2003.Limited resolution of 16S rDNA DGGE caused by melting properties and closely related DNA sequences[J]. J Microbiol Methods，2003，54：183-191。