流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测血小板功能及其临床应用
流式细胞技术在血小板研究中的应用
流式细胞技术在血小板研究中的应用血小板在各种诱导剂作用下释放其颗粒内容物，产生生物学效应，在初期止血过程中发生粘附-变形-释放-聚集等反应，这些血小板的基本反应，统称为血小板活化反应。
血小板活化的检测对血小板相关疾病的诊断有重要价值。
然而，检测的方法常常是有争议的，通常是由于方法本身不完善或应用不当导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。
这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板活化的方法。
近几年来，随着流式细胞技术（Flow cytometry，FCM）的发展，FCM已广泛应用于基础与临床研究，并逐渐成为检测血小板活化的重要手段。
现就FCM检测血小板活化的方法及临床应用作一综述。
一、活化血小板标记物活化血小板与静息血小板相比，其质膜糖蛋白常发生显著的变化，这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物。
主要包括三类：1、第一类是血小板质膜表面糖蛋白（1）GPⅡb/Ⅲa（CD41-CD61）它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来，因此，使用其荧光单抗，就能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。
（2）GPIb-IX-V （CD42）则相反，与静息血小板相比，活化血小板上表达量显著降低。
可以作为活化血小板的分子标志。
（3）GPIV （CD36）虽然在静息血小板上也表达，但活化血小板上表达量更高，也可以作为血小板活化标志。
（4）另外还有GPⅠc/Ⅱa（CD49e-CD29）、GPⅠa/Ⅱa（CD49b-CD29）等与血小板活化有关。
2、第二类是血小板颗粒膜糖蛋白主要包括血小板α-颗粒膜蛋白（GMP-140，CD62）和溶酶体完整膜蛋白（LIMP，CD63）。
血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，在质膜上表达，成为活化血小板的分子标志。
3、第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原包括纤维蛋白原，Xa因子等，这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。
流式细胞术检测血小板功能及其临床应用
由于血小板的活化程度可由血小板 酶作外源激动剂时 ,为防止血小板聚集
膜糖蛋白表达水平的高低来判断 ,近年 并形成纤维蛋白凝块 ,可在全血标本中
来 ,文献报道利用流式细胞术 ,特别是全 加 入 四 肽 化 合 物 Gly2Pro2Arg2Pro
血法流式细胞术 ,检测血小板膜糖蛋白 ( GPRP) [3] 。固定这一步若不干扰单抗
它仅在血小板活化时才因构象变化而显 活化血小板检测的一些代表性单抗 。
21 血小板缺陷性疾病 :全血法流式
露出来 。因此 ,使用这个表位的荧光单 抗 ,我们能更精确地在更早阶段检测到
三 、诊断学意义及临床应用
细胞术提供了一个简单 、迅速的方法来
利用全血法流式细胞术检测上述血 诊断血小板膜糖蛋白缺陷性疾病 ,如巨
号 。探测器收集每个细胞的荧光讯号和 的百分率 。阳性血小板百分率法与荧光
光散射 ,然后传入计算机进行分析 。 传统的流式细胞术检测血小板膜糖
蛋白的表达 ,常用的样本是经洗涤的血 小板或富含血小板的血浆 。由于血小板 极易活化激惹 , 样本经离心 、洗涤等步 骤 ,容易人为地导致体外血小板激活 ,影 响临床诊断价值 。为此 ,Shatti 等[2] 引入 了全血法流式细胞术 。该技术能使用全 血样本测定循环中血小板的活化状态以 及血小板对激活剂的功能应答 。
抽血抗凝 →稀释 →生物素化的检测
板相关疾病的诊断中 ,检测血小板功能 用单克隆抗体 (单抗) →激动剂或缓冲液
的方法常常是有争议的 。这通常是由于 →固定 (1 %多聚甲醛) →FITC 标记的鉴
方法本身的原因造成的[1] ,譬如 ,静脉阻 别用单抗 →PE2卵白素 →稀释 。
滞 、抗凝剂选择 、离心 ,甚至标本处理不
流式细胞术在临床医学的应用
流式细胞仪在医学检验中的应用流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。
近年来，FCM的发展日新月异，技术不断有新的突破，新型仪器不断涌现，同时，FCM 在医学及其他科学的应用更加广泛和深入，涵盖了从基础研究到临床诊断的多个方面，涉及免疫学、血液学、肿瘤学等。
图1. 流式细胞术工作原理图一、流式细胞术的研究进展1. 流式细胞仪的进展近年来，随着将多种不同波长的新型激光器与新型荧光染料的新型染色剂相结合，流式细胞仪性能不断提升，体现在分析速度的提高、灵敏度和精密度的提升，以及激光通道和参数的增多。
此外，流式细胞仪不断打破传统的界限，实现了多学科的交叉发展，诞生了一些新理念、新技术融合的仪器。
例如，微流控芯片流式细胞仪，是基于微机电技术的一种小型流式细胞仪，具有结构简单、操作方便、体积小、价格低廉等特点；声波聚焦流式细胞仪是采用超声波原理将细胞聚焦于流动室的中轴上，代替传统的流体动力，实现高通量、高精确度分析；质谱流式细胞仪将传统流式细胞仪与质谱分析技术相结合，采用同位素标记特异性抗体，利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术，可以克服荧光素发光光谱相互干扰导致的波谱重叠、影响分辨的问题；将传统的流式细胞仪的荧光信号与荧光显微镜的形态学结合，形成了成像流式细胞仪，检测者可以目睹到每个细胞或颗粒的形态。
质谱流式细胞仪和成像流式细胞仪可以被称为二代流式细胞仪。
2. 流式细胞术的进展FCM主要用于分析荧光标记的细胞和颗粒，也是目前广泛的应用领域。
但是，新近研究打破了这一界限，实现了流式细胞仪由检测荧光标记的细胞，到可以检测无需荧光标记细胞的飞跃，这种技术对细胞无损坏、避免了荧光染料的干扰，将进一步提升FCM的应用范围和价值。
有学者研究出一种新的FCM，称为实时变形性流式细胞术(real-time deformability cytometry，RT-DC)，利用肿瘤细胞等细胞的内在特性——变形能力，对无标记的目标细胞分析，这种无标记的分析方法为流式细胞分析增加了新的可能。
FCM原理及临床应用
(2) 肿瘤实体标本的FCM检查 ● 耐药基因检查 ● 粘附分子检查 ● 细胞凋亡检查 ● 细胞DNA分析 ● 增殖性核抗原 ● 肿瘤细胞耐药性筛选 ● 肿瘤相关抗原 ● 激素受体 ● 及癌细胞生物行为有关的因子，如 CD44
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组织标本的正确处理：
去除脂肪、结缔组织 洗涤除去红细胞 用眼科剪剪成肉糜状 用250至350目的铜网过滤
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(4) 淋巴细胞功能分析：细胞介导细胞毒试验、 细胞内细胞因子的测定
● 自身免疫性疾病 ● 变态反应性疾病 ● 免疫缺陷性疾病 ● 感染性疾病(病毒、细菌、寄生虫感染) ● 免疫治疗监测 ● 肿瘤免疫监测 ● 移植免疫监测
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(二) FCM在临床血液学中的应用
1.白血病的MIC分型
● Morphology（形态学） ● Immunology（免疫学） ● Cytogenetics（细胞遗传学）
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(2) 淋巴细胞亚群细分 ● T细胞：Ts：CD8+ CD28Tc：CD8+ CD28+ Th：CD4+ CD29+
● B细胞：B1：CD5+ CD19B2：CD5 + CD19+
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根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同还可将CD4+、CD8+ 分为
CD4+:
Th1: CD4+ IFN-r+
Th2: CD4+ IL4+
③ CDl4、 CD64是单核细胞的标志，见于M4或M5。
④ FAB—M3，t(15；17)者典型的免疫表型是CDl3+、 CD33+、 CD9+、 CD38+、 CD34-、 DR-。
流式细胞术在临床分析方面的应用
流式细胞术得到广泛应用和发展，出现了第一代商业化流式细胞仪。
20世纪90年代至今
流式细胞仪不断升级换代，技术不断创新，使得FCM在临床分析方面应用更加广泛。
流式细胞术基本原理
流式细胞术采用液流进样方式，将单个细胞与特异性抗体或 荧光染料结合，通过激光激发荧光信号，同时对细胞进行多 参数检测和分析。
流式细胞术可以检测基因组中的结构 变异，如染色体易位、倒位等，为一 些遗传性疾病的诊断和治疗提供依据 。
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流式细胞术在临床分析中的优势与局限 性
流式细胞术的优势
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快速高效
流式细胞术可以同时对多个参数进行检测，且 样本处理速度较快，有利于缩短检测时间和提 高检测效率。
高敏感度
流式细胞术对细胞亚群的检测具有高敏感度， 可以检测到极低浓度的细胞亚群，从而有助于 早期发现疾病。
它通过将单个细胞与特异性抗体或荧光染料结合，实现对细胞表面和内部特征的 定量检测。
FCM最早在20世纪70年代应用于临床医学领域，现已成为一种广泛应用于免疫学 、肿瘤学、血液学等领域的重要工具。
流式细胞术发展历程
20世纪70年代
流式细胞术最早由美国科学家开发，用于检测细胞表面抗原和细胞内DNA、RNA等物质。
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基因突变检测
流式细胞术可以检测基因突变，如抑癌基因突变等，有助于癌症的诊断和治疗。
蛋白质组学研究实例
蛋白质表达谱分析
流式细胞术可以检测不同细胞或组织中蛋白质的表达谱，了 解蛋白质的功能和作用机制。
蛋白质修饰分析
流式细胞术可以检测蛋白质的修饰情况，如磷酸化、糖基化 等，有助于深入了解细胞的信号转导和代谢机制。
拓展应用领域方向
流式细胞术在临床检验中的应用
流式细胞术在临床检验中的应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种可对单细胞悬液进行快速定性、定量分析和分选的技术。
它不仅可以对细胞表面抗原进行检测，也能对细胞内部的生物大分子进行检测，能够在细胞水平上对相关疾病进行诊断和病程监测。
因此在临床医学及科学研究中发挥着非常重要的作用。
随着技术水平的不断提高及完善，FCM得到了更为广泛的应用。
目前，FCM在临床检验方面主要应用于血液学、免疫学、肿瘤、等临床医学和基础医学研究领域，具有检测样品快速、准确以及灵敏度性高等特点，为临床检验提供了一种强有力的手段和全新的医学视角，是临床检验工作中重要的一种研究工具。
FCM主要由液流系统、光学系统、电子系统组成。
其主要基本原理是将待测样本染色后制成单细胞悬液放入样品管中，通过气体的压力使样品进入鞘液，鞘液与样品之间会形成一定的压力，当压力达到一定程度后，在鞘液的带动下，单细胞悬浮样品会形成单细胞柱状经过激光聚焦区，样品柱与激光束垂直，由于样品经特异性染料处理，因此在激光激发下会产生特定波长的荧光。
流式细胞仪中的光学系统收集到荧光信号后进行信号处理，再经过计算机系统对这些数字信号收集、储存，以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来，然后做出统计分析从而获得所需要的检测结果。
1．FCM在血液学中的应用FCM主要通过对外周血细胞和骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析对各种血液病如白血病、淋巴瘤等血液系统疾病的分型、诊断、治疗及预后判断均有重要作用。
血细胞在白细胞系、红细胞系、巨核细胞系、血小板及非造血细胞均有不同的分化抗原表达，分布在细胞质、细胞膜中。
血液肿瘤细胞的特征是丧失了正常细胞的系类专一性和分化阶段的规律性，运用FCM将具有系列特异性并涵盖不同分化阶段的单克隆体作为分子探针来检测血液肿瘤细胞的内外抗原，可以反映其本质上与正常造血细胞的差异。
由于不同的血细胞系统都有其特有的表面抗原，FCM通过采用各种血细胞表面分化抗原特异的单克隆抗体，借助于各种不同的荧光染料（FITC、PE）可同时检测一个单细胞的不同参数，根据所测的参数结果来判断出该血细胞的属性。
FCM技术的临床应用
FCM技术的临床应⽤流式细胞技术的基本原理和临床应⽤浙江⼤学医学院附属第⼀医院传染病研究所徐陈槐流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是利⽤流式细胞仪对细胞等⽣物粒⼦的理、化及⽣物学特性进⾏分析的⽅法。
它集中了单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。
利⽤流式细胞仪可以对细胞等⽣物粒⼦的理化及⽣物学特性(细胞⼤⼩、DNA 含量、细胞表⾯抗原表达等)进⾏定量、快速、客观、多参数相关的检测。
流式细胞仪的基本原理是采⽤流体动⼒学聚焦以保证细胞按同⼀⽅式逐⼀通过激光束(检测区)。
当样本流中的细胞经过流动室中的检测区时，椭圆形的激光束即可检测到细胞信号。
包括细胞的散射光以及细胞上标有的荧光染料发出的激光。
⼀、流式细胞仪的基本结构：流式细胞仪的流动室中有⼀长⽅形通道，加压的鞘液从通道底部进⼊流动室向上流动，检测区位于通道的中央。
当鞘液在通道中流动时，样本流被射⼊鞘液中，鞘液包裹着样本，但并不与其混合。
鞘液的压⼒将样本流聚焦，使其在流动室中逐⼀通过激光检测区。
根据激光束检查到的信号不同，将其分为前向散射光、侧向散射光及荧光。
激光束上的低⾓度散射光被称为前向散射光(FS)，主要反映细胞的⼤⼩；与激光束成90度⾓收集的散射光信号称侧向散射光(SS)，主要反映细胞的颗粒特性。
如SS可以区分淋巴细胞，单核细胞及粒细胞。
除FS和SS外，细胞亦可发出荧光(FL)。
根据所应⽤的试剂不同，这些荧光可以使仪器得到细胞的⼀些特征，如：FL可以⽤于确认分⼦，像表⾯抗原等。
⼆、光的收集：前向检测器⽤来收集前向散射光，当有散射光到达前向检测器，即会产⽣电压信号。
根据检测器收集到的光信号的不同，电压信号亦不相同。
侧向散射光波长488nm，较荧光强。
它是第⼀个从收集镜/空滤⽚装置中被分离出来的。
应⽤488nm 的⼆向⾊性长通滤⽚(488DL)在45度⾓时，使前向散射光偏转⾄SS检测器，同时⼜使波长较长的荧光通透过去。
流式细胞术(FCM)的工作原理及其在免疫学上的应用
流式细胞术（FCM）的工作原理及其在免疫学上的应用摘要：流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种可对单细胞进行快速定性、定量分析的新技术。
它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术，具有极高的检测速度与统计精确性，而且从单一细胞可以同时测得多个参数。
随着其分析技术和方法的日臻完善，流式细胞术在临床免疫及科学研究上发挥了非常重要的作用。
本文对流式细胞术的工作原理进行了概括介绍，并对其在免疫学等方面的应用进行了综述，展示了FCM 在免疫学上应用的广阔前景。
关键词：流式细胞术；流式细胞仪；工作原理；免疫学；应用；应用前景流式细胞术(FCM)是70年代发展起来的一种快速对单细胞或微粒定量分析和分选的新技术。
其检测速度之快，统计学精度之高，是其他的方法无可比拟的，可同时从一个细胞中测得多种参数(如DNA、R N A、蛋白质、细胞体积等)进行多参数分析。
流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的结晶，在血液学、肿瘤学等学科尤其是在免疫学方面得到广泛应用[1]。
近年来，随着流式细胞免疫学技术的迅速发展，流式细胞术与单克隆抗体技术结合，使细胞表面和细胞内抗原，癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得了很大进展。
流式免疫技术克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足，形成了流式免疫学独特的科学分支，成为研究细胞免疫学的先进技术之一。
随着科学技术的发展，多种新的荧光探针的不断出现，使FCM技术的应用范围不断扩大，特别是各种各样的荧光探针标记的单克隆抗体和其他蛋白质的出现，为FCM 研究各种组织细胞膜和细胞内抗原、肿瘤性蛋白等开辟了新途径[2]。
1 .流式细胞术与流式细胞仪1.1流式细胞技术：流式细胞技术是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微球，测量其产生的散射光和发射荧光的强度；经染色的细胞或微球在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞或微球经过焦点时，发出一束散射光/或荧光；它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器光电倍增管或一个固态装置），光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析；并可能将感兴趣的细胞进行分选[3]。
流式细胞分析在临床血液学中的应用
流式细胞分析在临床血液学中的应用
1.白血病诊断和监测：
白血病是由于骨髓内的恶性细胞大量增殖导致的一种血液系统疾病。
流式细胞术可以根据细胞大小、颜色和表面标记物的表达水平快速分析并鉴别异常细胞。
这对于白血病的早期诊断、分类和监测来说非常重要。
2.免疫功能评估：
流式细胞术可以评估患者的免疫功能。
通过将标记有特定抗体的细胞与患者的血液混合，可以测量细胞表面抗原的表达水平。
这有助于确定患者是否有免疫缺陷，以及免疫功能是否正在正常运行。
3.血液病的异常细胞鉴定：
流式细胞术可以鉴别和计数血液中的异常细胞。
例如，对于淋巴瘤等恶性疾病，流式细胞术可以检测和分类恶性细胞，以便进行早期诊断和个体化治疗。
4.红细胞和血小板计数：
流式细胞术可以用于快速准确地计数红细胞和血小板。
在患者需要进行输血或者有出血倾向的情况下，流式细胞术可以提供非常重要的信息。
5.免疫治疗监测：
流式细胞术可以用于监测免疫治疗的效果。
例如，在进行造血干细胞移植后，流式细胞术可以帮助监测移植后的免疫细胞比例和功能。
这对于治疗干细胞移植相关并发症和个体化治疗来说非常重要。
总之，流式细胞分析是一种在临床血液学中非常有用的技术，可以用于白血病诊断和监测、免疫功能评估、血液病的异常细胞鉴定、红细胞和血小板计数以及免疫治疗监测。
随着技术的发展，流式细胞分析的应用将进一步扩大，为临床血液学的诊断和治疗提供更多的帮助。
流式细胞仪的临床应用
流式细胞仪的原理及其临床应用流式细胞技术(FCM)是70 年代发展起来得一种快速对单细胞定量分析的新技术, 它借簦了荧光显微镜技术, 同时利用与荧光染料, 激光技术, 单抗技术以及计算机技术的发展, 将荧光显微镜的激发光源改为激光, 使之具有更好的单色性与激发效率, 因而大大提高了检测灵敏度, 同时将固定的标本台改为流动的单细胞悬液, 用计算机进行数据处理, 因而大大提高了检测速度与统计精确性, 而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数, 为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段. 目前, 该技术已经广泛用于基础研究与临床应用, 在免疫学, 遗传学, 血液学, 肿瘤学等领域内发挥前重要的作用. 本文着重介绍流式细胞仪基本原理及其在临床上的应用.一. 基本原理流式细胞仪的主要结构可以大致分为这样几个组成部分: 激光系统, 流式系统, 信号处理及放大, 计算机系统. 图一, 图二概括了流式细胞仪的基本原理, 当待测标本被制务成单细胞悬液, 经染色后进入流动室, 流动室内充满流动的鞘液, 鞘液压力与样品流压力是不同的, 当二者的压力差异达到一定程度时, 鞘液裹挟着的样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区. 如果我们将细胞中感兴趣的部分特异性地标上荧光染料, 那么这些染料将在细胞通过激光检测区时受激发出特定波长的荧光, 通过一些波长选择通逶性的滤色片, 我们可以将不同波长的散射光, 荧光信号区分开来, 并送到不同的光电配增管中, 经过一系列信号转换, 放大, 数字化处理, 我们就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率. 选择不同的单克隆抗体及荧光染料, 我们可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同的特征, 如果对具有某种特征的细胞有兴趣, 我们还可以利用流式的分选功能将其分选出来, 以便于进一步培养, 研究二. 流式细胞仪在免疫学中的应用1. 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞是正常机体免疫系统功能最重要的一大细胞群, 在免疫应答过程中, 未梢血淋巴细胞发育成为功能不同的亚群. 各亚群的数量和功能了生异常时, 就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化.FCM可以同时检测一种或几种淋巴细胞细胞表面抗原, 将不同的淋巴细胞亚群数量的测定来监控病人的免疫状态, 指导治疗.2. 感染及其治疗效果观察由于T 淋巴细胞在人体免疫系统中承担着重要的功能, 因此, 当感染发生时,T 淋巴细胞各亚群的变化往往能很敏感地反映感染的状态与程度. 例如, 细胞膜外CD4分子有HIV 识别部位, 因此CD4细胞是HIV 病毒受体,AIDS 病人CD4+T细胞明显减少, 该指标是诊断AIDS的重要标志. 当病毒感染发生时( 如乙型肝炎,EB 病毒和巨细胞包涵体病毒),CD8+T 细胞增多, 对CD8细胞的测定有助于对感染的诊断, 治疗效果的动态观察.利用流式细胞仪可对器官或骨髓移植后病人进行监控. 当病人CD3+,CD25持+续增加提示已经开始发生排异,CD4/CD8持续下降表明有感染发生, 当其比值小于0.2 时必须停用免疫抑制剂.由于流式细胞仪将静态的, 显微镜下肉眼观察改为动态的, 计算机信号处理, 因此, 在流式细胞仪上T 细胞亚群统计方式已从传统的荧光显微镜下计数200个细胞成为几秒钟内计数上万个, 因此结果更真实, 更具有统计意义.3. 其他免疫功能性疾病分析流式细胞仪便捷, 准确的特点可以用来对自身免疫性疾病进行检测与疗效观察. SLE病人的淋巴细胞变化可以反映该病的活动情况和器官侵犯程度. 活动或非活动性SLE伴有多系统疾病但无肾脏损害的病人可出现CD4/CD8比值升高, 伴有严重肾脏损害的SLE病人可出现低CD4+,高CD8+的现象.有证据表明外周血HLAB27的表达及其表达程度与强直性脊髓炎的发生有很大程度的相关性, 利用流式细胞仪可以进行HLA-B27./HLA-B7 双标记来检测HLA-B27 阳性细胞, 同时排除交叉反应. 另外,CD23 表达的增加与变态反应性疾病, 自身免疫性疾病, 肾病综合症有关, 而且阳性率与病情严重程度呈正相关, 治疗有效后CD23+细胞减少.利用流式细胞仪检测PNH血细胞的细胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂(GPI) 锚连接的蛋白如DAF(CD55.)与MIRI(CD59..) 来确诊阵发性睡眠性血红蛋白尿传统的血清溶血试验具有更高的特异性与灵敏度.一. 流式细胞仪在血小板功能评价方面的应用血小板膜糖蛋白(GP)是参与止血, 血栓形成的重要分子基础, 这些膜糖蛋白是一类重要得黏附分子. 用搞GP.. 的单克隆抗体对血小板进行免疫荧光标记, 用FCM 分析单个血小板或血小板亚群GP是血小板膜糖蛋白检测分析方法的重大发展,方法简便, 快速, 标本用量少, 灵敏度高, 结果准确.与血小板有关的抗原的临床意义有:1. 诊断遗传性血小板功能缺陷疾病巨血小板综合症(BSS)患者血小板CD42 A\CD42B复合物先天缺陷,FCM中表现CD42A与CD42B不仅严重缺乏, 而且其平均荧光强度显著低于阴性对照,CD61代偿性增加.血小板无力症(GT) 患者FCM表现血小板GPIIB,IIIA(CD41,CD61) 明显缺乏,CD42A 和CD42B基本正常或稍高, 并可出现异常血小板亚群.3. 血栓性疾病和血栓前状态由于活化血小板是血栓的主要成分之一, 也是引起血栓形成的主要原因, 所以血小板活化程度增高与疾病发生发展有关.CD62P.. 和CD63是活化血小板最特异和灵敏的分子标志物, 正常人血小板只有低水平活化, 外周血CD62P只有3-5%.有文献报导糖尿病伴有微血管病变, 冠心病, 高血压病. 高血脂病, 脑血栓形成, 脑动脉硬化患者活化血小板百分率和绝对数显著高于正常人, 而糖尿病无微血管病变, 周围血管病以及深静脉血栓形成患者活化血小板水平与正常人无显著差异.PTCA后24 小时发展成急性血管闭塞或高度再狭窄的患者CD62P..和CD63增多,FCM可用于测PTCA后急性缺血再发作的危险性.四, 流式细胞仪在白血病中的应用血液病多种为肿瘤性免疫性和遗传性疾病, 但恶性血液病约占一半以上.FCM在血液病的发病机制, 诊断, 分类, 治疗和预后判断方面都有广阔的应用前景.1. 白血病的分类研究2. 微小残病变检出(MRD)M R D是白血病复发的主要根源,..FCM 其高特异性与敏感性可以在患者缓解期检避免复发.测是否有残存病变细胞, 早期探测MRD以,五FCM在肿瘤学上的应用1. DNA含量测定及细胞周期分析FMC在肿瘤学上的应用主要是利用DNA含量测定进行包括癌前病变及早期癌变的检出, 化疗指导以及预后评估等工作.大量工作表明, 癌前病变的癌变率与病变的增生程度一致, 而增生程度与DNA含量的异常改变又呈平行关系.FCM通过精确定量DNA含量, 能对癌前病变的性质和了展趋势作出判断, 有助于癌变的早期诊断.DNA非整倍体的出现可能是恶变细胞的重要标志, 目前病理学尚无法从癌前病变中发现癌变和即将癌变的细胞, 而FCM检测中DNA非整倍体细胞的出现可作为一个有价值的参数.DNA倍体分析有助于临界性肿瘤的诊断, 如卵巢的交界性肿瘤, 异倍体的出现与病变的恶性发展有关.细胞异常增殖和分化障碍是肿瘤细胞的特性,DNA含量不仅能非常敏感地反映细胞代谢的异常, 而且能通过DNA倍体分析, 细胞周期各时相的细胞比例分析并结合细胞抗原的表达多参数分析, 全面了解细胞的生物学行为, 从而帮助肿瘤的诊断, 选择治疗方案和预后判断.DNA异倍体, 高S_PHASE细胞比值和高增殖细胞核抗原(PCNA)表达与细胞增殖能力, 恶性程度和不良预后呈正相关.2. 为治疗方案和药理学研究提供依据不同类型的肿瘤对化疗药物的敏感程度是不同的. 可以利用FCM进行细胞期分析, 适当选用周期特异性药物或非周期特异性药物.MDR是由多药耐药基因编的P糖蛋白(PGP)是亲脂化合物, 包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性排出泵. 从人淋巴细胞排出荧光染料与细胞内P-GP的含量直接相关. 当淋巴细胞出现M D R阳性细胞时, 病人对化疗药物开始出现耐药性, 需要考虑其他治疗方式.六, 活细胞内活性酶的检测法( 如FLUOROMETR及ICCOLORIMDTRIC_ASSAY都S是), 测定总体细胞的总酶活性而非测定单一细胞的酶活性. 若要测定单一细胞的酶活性, 通常都是涉及固定后的死细胞. 近来COULTE公R司推出最新的技术及试剂CELLPROBE_REAGE由N于T,每一个特定的酶都有其专一的受质, 而受质本身是由特别的化学品与荧光染料FLOURENSCE或IN RHODAMINEN共O价结合的, 能迅速进入活细胞, 当其遇到特异性酶时, 会被酶破坏其共价结构而释放其荧光染料, 从而能够被FCM检测到, 因此, 活细胞酶探针能够用来测量单一活体细胞内酶的活性.七. 凋亡细胞检测凋亡最初是作为形态学概念被提出来的. 细胞有两种不同的死亡方式. 即坏死(MECROSIS和) 凋亡(APOPTOISI). 凋亡典型的形态特征是核染色质固缩并分离, 细胞质浓缩, 细胞膜和核膜皱曲, 核断裂形成片断, 最后形成数量不等的凋亡小体. 利用FCM可以进行DNA断裂点标记检测.DNA片断可以从细胞内漏出, 导致DNA含量减少, 利用F C M进行DNA含量分析, 通过二倍体细胞G0/G1期峰前的亚二倍体峰来确定.在凋亡早期, 一些与膜通透性改变及凋亡有关的蛋白在细胞膜表面有特定表达, 例如FAS基因蛋白(CD95), 线粒体膜蛋白(AP027), 磷脂酰丝氨酸(ANNEXIN_V),FCM结合单克隆抗体可以检测表达这些蛋白的细胞, 从而确定细胞的凋亡情况.自70 年代流式细胞仪成型以来, 历经20 多年的发展, 流式细胞仪应用意义越来越得以体现, 尤其是1982 年以后, 随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展, 给流式细胞仪的应用发展提供了强大的推动力. 在我国, 不仅许多科研单位早在80 年代已经开始使用流式细胞仪作为其科研工具, 进入90 年代后, 以库尔特原理及其相关血细胞分析产品闻名的美国库尔特公司以其在流式领域研究, 应用近二十年的积累, 在其五代流式细胞仪的基础上推出了以单激光同时激发四色荧光的新一代临床型流式细胞仪, 并为其配套了临床标本制备仪, 使临床标本制备标准化, 简单化, 开创了流式应用的新领域. 从而, 不少大中型医院也逐步引进流式细胞仪作为临床诊断的辅助工具, 随着单抗技术, 计算机技术及其它相关技术的不断发展, 流式细胞仪将会在应用领域得到不断的开拓, 成为科研与临床不可或缺的重要手段.。
流式技术在血液科的应用
流式技术在血液科的应用
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）在血液科的应用主要体现在对血液
疾病的诊断、治疗和预后评估上。
1. 诊断：流式细胞术可以对外周血细胞或骨髓细胞进行抗原表达的检测分析，有助于对各种血液病进行诊断、分型和分类。
例如，对于白血病，可以通过流式细胞术进行免疫分型，有助于确定治疗方案和预后评估。
对于淋巴瘤，流式细胞术也可以用于诊断和分类。
2. 微小残留病监测：对于一些血液肿瘤，尽管在治疗后临床症状可能消失，但可能仍存在微小残留病灶，流式细胞术可以用于监测这些微小残留病灶，以评估治疗效果和预测复发风险。
3. 预后评估：流式细胞术检测的抗原表达等指标可以用于评估疾病预后。
例如，一些研究表明，急性白血病患者中CD34+细胞的比例与疾病预后相关。
4. 免疫治疗靶点寻找：流式细胞术可以用于寻找免疫治疗的靶点，例如寻找肿瘤特异性抗原等。
以上信息仅供参考，如有疑问或想了解更多相关信息，建议咨询专业医师或查阅医学专业书籍。
流式细胞术筛查血小板抗体方法的建立及应用
流式细胞术筛查血小板抗体方法的建立及应用作者：韩博文来源：《中西医结合心血管病电子杂志》2017年第29期【摘要】目的建立一种用流式细胞术筛查血小板抗体的方法，并将其应用于临床治疗中。
方法将78例需进行血小板抗体检测的患者进行AB两组试验，分别用常规处理法和流式细胞术来进行检测，观察两组的检测结果。
结果 A组的检出率为25.65%，而B组的检出率为35.90%，相比而言，B组的检出率明显高于A组，而且检测的时间也要短于A组，但是两者的阳性率无明显差异。
经检测，B组中还发现有10例含抗HLA抗体，有1例含抗HPA-5b抗体，有9例为自身抗体。
结论对于筛查血小板的抗体，流式细胞术的建立以及应用为临床治疗提供了很大的便利，该方法不仅检测速度快，操作简单，还实现了标准化，非常适用于临床检测。
【关键词】流式细胞术；血小板抗体；方法建立；临床应用【中图分类号】R446 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2017.29..01通过对常规处理法和流式细胞术的比较来具体探讨流式细胞术在临床检测中的应用与效果，并作如下分析。
1 资料与方法1.1 一般资料选择2016年本市医院的共100例血小板患者的资料，对不同年龄，不同症状的患者进行检查，针对血小板来进行针对性检查。
患者均无其他相关疾病，并且满足了患者检测的相关标准，保证了医院数据处理中的准确性。
且并未注射激素或进行免疫性抑制等治疗。
将患者进行AB两组不同的检测试验。
1.2 方法所有患者均在本省同一家医院内进行治疗，A组采用常规处理法，即经典酶联免疫吸附试验（ELISA），B组采用流式细胞术（FCM）。
（1）制备样本：采取的静脉血应该在15毫升以上，然后放入抗凝试管中，防止血液凝固。
15 ml血液中13 ml用于血小板自身抗体检测试验盒检测，即ELISA，用离心法分离血小板，之后进行冷却。
剩余的2 ml用于流式细胞术（FCM）检测。
（2）经典酶联免疫吸附试验（ELISA）技术检测：按照使用说明书来进行检测。
流式细胞仪工作原理与应用范围
流式细胞仪工作原理与应用范围2008-11-01 10:30流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。
流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
流式细胞术最新进展及临床应用
流式细胞术最新进展及临床应用流式细胞术( F l o w cy t o m e t r y, F C M), 临床上也被称为流式细胞分析,是利用流式细胞仪同时对单个细胞的多个参数进行定性/ 定量( 相对/ 绝对) 分析的生物医学分析技术,检测速度快、通量高、灵敏度高、采集数据量大、节约样本及成本,在临床上已经广泛应用于血液学、免疫学、肿瘤学、精子学等检验领域,是未来临床检验不可替代的检测方法之一。
传统流式细胞术,也被称为荧光流式细胞术,是基于荧光标记及荧光发射光谱检测的一门综合性技术,定量方式多为定性分析,检测参数类型单一、数目有限,数据分析复杂且缺乏标准化分析流程,不同检测中心间数据重现性差,这些都限制了它在临床检验中进一步的推广及应用。
近年来,为克服以上问题,流式细胞术不断突破与创新,从定性检测发展为定量检测;从单参数分析、双参数分析发展成为多参数分析;从检测细胞表面抗原到胞内抗原及分泌到胞外的抗原;从检测蛋白表达水平发展为检测蛋白定位、蛋白功能及蛋白翻译后修饰等;从一维定量检测发展为二维定量定位分析,从体外检测发展为体内检测等;这些突破使得流式细胞术可以实现从单细胞水平去认识细胞在生理或病理状态下的免疫表型、分子表型甚至各种复杂的信号通路变化等,因此将更为广泛应用于临床检测。
1定量流式细胞术定量流式细胞术( Q u a n tit a ti ve fl o w cy t o m e t r y, QFCM),即通过流式细胞仪定量检测细胞或微球上荧光素的中值荧光强度 ( M e d i a n fl u o r e s ce n t i n t e n s it y, M F I ) 或每个细胞结合的抗体单位( A n ti b o d i e s b o und t o p e r ce ll,A BC) 来对生物分子进行相对或绝对定量的流式细胞技术。
定量流式细胞术已被证明是一种功能强大的临床检验技术,但由于M F I缺乏标准化度量方法,容易引起不同检测中心检测结果重现性差,导致诊断和治疗决策的不确定性及不可靠性, 限制了其在临床的推广应用, 因此,标准化M F I测量为流式细胞术实现精确定量分析,在临床广泛应用的必经之路。
流式细胞术的工作原理及其临床应用
流式细胞术的工作原理及其临床应用一、本文概述流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测和分析单个细胞的技术，广泛应用于生物学、医学和生物技术等众多领域。
本文将对流式细胞术的工作原理进行详细介绍，并探讨其在临床诊断和治疗中的广泛应用。
我们将概述流式细胞术的基本原理和技术特点，包括细胞染色、荧光信号检测和数据分析等方面。
然后，我们将深入探讨流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学等领域中的临床应用，以及其在疾病诊断、预后评估、疗效监测等方面的重要作用。
我们将对流式细胞术的未来发展趋势进行展望，以期为读者提供全面而深入的了解。
二、流式细胞术的工作原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速定量分析和分选细胞的技术。
其工作原理主要基于流式细胞仪的精确设计和操作。
待检测的细胞经过预处理，如荧光标记、固定和破膜等，使其带有可检测的荧光染料或抗体。
这些细胞随后被导入到流式细胞仪中，通过喷嘴形成单细胞悬液，并以一定的流速通过检测区域。
在检测区域，细胞经过激光束的照射，激发出荧光信号。
这些信号被光电倍增管等光电转换器接收，并转化为电信号。
电信号经过放大、数字化处理后，由计算机系统进行记录和分析。
流式细胞仪可以同时检测多个参数，如细胞大小、内部结构、DNA 含量、蛋白质表达等。
这些参数的分析主要基于荧光信号的强度和波长，以及细胞的电学特性，如电阻抗。
流式细胞术还可以结合分选技术，将特定类型的细胞从混合细胞群体中分离出来。
这主要通过在流式细胞仪的出口处设置电磁场或静电场，对带有特定荧光信号的细胞进行偏转，从而实现细胞的分选。
流式细胞术的工作原理是将单个细胞在液流中快速通过激光束，通过检测和分析荧光信号，实现细胞的定量和定性分析，以及细胞的分选。
这种技术具有高灵敏度、高分辨率和高通量的特点，广泛应用于生物医学研究的各个领域。
三、流式细胞术的临床应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）作为一种高度灵敏且多功能的细胞分析技术，在临床医学领域的应用日益广泛。
医学免疫学实验：流式细胞术(Flow Cytometry)的原理及应用
光谱重叠（Spectral overlap）
补偿模型图
FL2
补偿调节前后对比
FL1
数据收集和分析
1 画图（直方图，散点图） 2 寻找目标细胞 3 调整仪器设置到合适的状态 4 我们可以得到怎样的结果？
它们意味着什么？
数据分析
• 设门 • 设定阴性与阳性群体的界限 • 确定阳性与阴性细胞群体 • 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，
流式细胞仪的临床应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
Part IV
流式细胞术实验操作 流程及数据分析
流式细胞术操作流程
流式细胞术
✓ 调整仪器设置 ✓ 收集数据 ✓ 分析结果
课堂目标
• 了解流式细胞仪的构造、原理及应用，掌 握“门”，“补偿”两个基本概念。
• 学会简单分析流式数据：小鼠脾脏分离的 单个核细胞中CD3+、CD4+ 、CD8+细胞 的比例。
Content
✓流式细胞仪的简介 ✓流式细胞仪的组成及原理 ✓流式细胞术的应用 ✓流式细胞术实验操作流程
不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速率进行测量。
可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织，悬浮或
贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。
样本类型
可检测颗粒大小
0.2μm
50μm
流式细胞仪能检测哪些信息?
➢ 相对大小: Forward Scatter (FSC)
• 2.染色：小心用枪去除上清，再加入50ul预混抗体的PBS（由助 教准备），将细胞吹打混匀，避光， 4℃或冰上，染色1520min
流式细胞仪及其临床应用
流式细胞术及其临床应用ABSTRACTKey words: Flowcytometry; Immunophenotyping; Leukemia; Activated platelets; Tumor; Apoptosis.流式细胞术(flowcytometry FCM)是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析和分选的一门技术。
在分析或分选过程中，包绕在流动液体中处理过的单个细胞或微粒通过聚焦的光源，产生电信号，这些信号代表光散射、荧光等参数，以此测定出细胞或微粒的物理和化学性质，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，以对其进一步的培养或分析。
包绕细胞的液流称为鞘液。
所用仪器称为流式细胞仪（flowcytometer FCM）。
流式细胞术综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、免疫学、激光技术和计算机科学等多门学科和技术，具有检测速度快、精确、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点。
一、流式细胞仪(flowcytometer FCM)1．流式细胞仪的基本结构流式细胞仪的结构一般可分四部分，见图1。
（1）流动系统流动系统是流式细胞仪的心脏，因为细胞悬液在被检测之前必须首先形成一个很细的稳流，细胞在其内部排成单列通过测量区。
细胞悬液和鞘液分别（是分别还是同时）进入流动室，鞘液的作用是使样品悬液中的粒子组成单一纵列方式通过测量区，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。
（2）激光系统多采用氩离子激光器。
使发射光在可见光谱范围内488nm激发。
目前市场上大多数荧光色素适用于此波长。
激光的单色性好，功率高，稳定。
（3）光学和电子系统激光束射至经流体力学聚焦的个别细胞和粒子后，光散射在各个方向(360?)发射。
有两个光散射参数需收集，前向角散射(FSC)主要用于检测细胞体积的大小。
另一为侧向散射(SSC)用于检测细胞膜，胞质，核膜等细胞内部结构及胞质内颗粒。
荧光信号是由对细胞进行染色的特异性荧光染料受到激光激发后发射的。
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流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测血小板功能及其临床应用血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。
然而，在血小板相关疾病的诊断中，检测血小板功能的方法常常是有争议的。
这通常是由于方法本身的原因造成的［1］，譬如，静脉阻滞、抗凝剂选择、离心，甚至标本处理不当等因素，都可导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。
这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。
关键词：血小板临床应用流式细胞术血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。
然而，在血小板相关疾病的诊断中，检测血小板功能的方法常常是有争议的。
这通常是由于方法本身的原因造成的［1］，譬如，静脉阻滞、抗凝剂选择、离心，甚至标本处理不当等因素，都可导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。
这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。
由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，近年来，文献报道利用流式细胞术，特别是全血法流式细胞术，检测血小板膜糖蛋白的表达［2］。
该技术能灵敏、特异地检测血液中活化血小板，并评价其功能。
现就全血法流式细胞术检测血小板功能的方法及临床应用现状和潜力进行综述。
一、全血法流式细胞术1.方法学：流式细胞仪能快速测定大量个体细胞的特性。
样品中欲分析的细胞预先进行荧光标记，然后由压缩氮经硅管送达标本室，再以5 000～10 000个细胞/秒的速率逐个射入光敏感区。
在适当波长的激发光作用下，被特殊染色的细胞发射出一定量的荧光脉冲讯号。
探测器收集每个细胞的荧光讯号和光散射，然后传入计算机进行分析。
传统的流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的表达，常用的样本是经洗涤的血小板或富含血小板的血浆。
由于血小板极易活化激惹，样本经离心、洗涤等步骤，容易人为地导致体外血小板激活，影响临床诊断价值。
为此，Shatti等［2］引入了全血法流式细胞术。
该技术能使用全血样本测定循环中血小板的活化状态以及血小板对激活剂的功能应答。
全血流式细胞术样本制备步骤为：抽血抗凝→稀释→生物素化的检测用单克隆抗体(单抗)→激动剂或缓冲液→固定(1%多聚甲醛)→FITC标记的鉴别用单抗→PE-卵白素→稀释。
稀释样本是为了防止血小板聚集，否则单个血小板上的抗原量就测不出来了，因为流式细胞仪测定的是单个粒子的荧光，而不管这单个粒子是一个血小板还是几个血小板的聚集体。
当用凝血酶作外源激动剂时，为防止血小板聚集并形成纤维蛋白凝块，可在全血标本中加入四肽化合物Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)［3］。
固定这一步若不干扰单抗的结合，生物素化的检测用单抗也可以在固定后加入。
血小板鉴别用单抗可在针对血小板特异性膜糖蛋白GPⅠb，GPⅡb，GP Ⅲa的单抗中任选一种。
标记这单抗的荧光试剂可在FITC、PE、PE-CY53种荧光染料中任选。
样本随后用流式细胞仪检测。
通过荧光极性和特异性光散射鉴别出血小板后，检测5 000～10 000个血小板表面的特异性荧光讯号。
检测结果可用两种方法表示。
一种是平均颗粒荧光强度，另一种是特异性荧光抗体结合阳性血小板的百分率。
阳性血小板百分率法与荧光信号的放大倍数无关，且可以检测受损伤部位血小板亚群的变化。
如果检测的是血小板表面某抗原的总量，则荧光强度法更为适合。
譬如，在活化状态下，血小板表面GPIb-IX-V复合物含量比静息时低，但降低的幅度小，通常还不足以报告阴性结果［4］，这时用荧光强度法就比阳性血小板百分率法更合适。
目前传统的流式细胞术还不能定量分析结合位点的绝对数目，但Shatti等［2］利用125I 和生物素双标记的单抗进行研究，以PE-卵白素作为荧光结合试剂，发现碘标测定的结合位点数与荧光强度间有线性关系。
因此，对于一个特定的单抗，一旦弄清这一线性关系，并知道荧光单抗上荧光素与抗体的摩尔比，就能利用流式细胞仪定量分析该抗体结合位点的绝对数目。
目前有一些商品试剂盒能定量测定结合到单个细胞上的抗体数目，但乏见用于血小板的报道。
2.优缺点：与常规血小板功能测定法比，全血法流式细胞术有许多优点。
首先，标本处理的简化能避免血小板体外医源性激活，并防止血小板亚群丢失；循环中的红细胞、白细胞对血小板的活化有影响，因此本法能在最接近受检者体内环境的条件下测定血小板功能。
同时，由于使用了血小板鉴别用单抗，检测的仅是血小板，而不会受其它种类细胞或碎片的干扰，保证了检测的特异性。
其次，在血栓性疾病中，通常只有小部分的血小板被活化；凝血酶体外活化血小板，也常表现为亚群激活；活化血小板表达CD62等膜糖蛋白也有明显的异质性［5］。
本法能灵敏地检测出少到1%的活化血小板亚群［6］，尤其是能分析单个或亚群血小板膜上活化标志物的变化，使检测结果更接近真实。
若同时使用FITC、PE、PE-CY5 3种荧光染料，本法通过三色标志一次能同时检测两个抗原标志物的变化。
此外，做一次检测仅需2 μl血液，这一点，尤其适合于新生儿和血小板减少性疾病患者。
本法不使用同位素，没有放射性污染。
全血法流式细胞术也存在不足之处。
譬如，流式细胞仪价格高昂，检测费用高，仪器操作复杂。
为了避免体外活化，血样需在45分钟内处理，不能久置。
另外，流式细胞仪仅检测循环中的血小板功能，而β-TG、PF4和TXA2的检测还能反映血管壁上血小板的活化和新近被清除的血小板。
虽然存在着这些不足，但本法仍是血小板功能检测的突破性进展。
二、全血中活化血小板的检测1.血小板特异性膜糖蛋白：本法检测血小板功能，首先要对全血中的血小板进行特异性荧光标记，将血小板与血样中其他血细胞区分开来。
针对血小板表面特异性膜糖蛋白制备的单抗，使血小板特异性标记成为可能。
血小板膜糖蛋白已被深入研究［7］，表1显示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。
在这些膜糖蛋白中，仅在血小板膜表面表达主要有GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa等有限的几种［8］。
根据这些特异性糖蛋白制备的荧光单抗，能在全血中特异性地识别血小板，仅给血小板做上荧光标记。
表1血小板膜上主要的糖蛋白及其功能膜糖蛋白基因家族配基功能GPⅠa/Ⅱa 整合素(B1) 胶原粘附GPⅠc/Ⅱa 整合素(B1) Fn 粘附GPⅠc/Ⅱa 整合素(B1) Laminin 粘附GPⅡb/Ⅲa 整合素(B3) Fb,vWF,Vn,Fn 聚集Vn受体整合素(B3) Vn,?vWF,?Fn 粘附GPⅠb/ⅨLRG vWF，凝血酶粘附GPV LRG ? 凝血酶底物GPIV Thrombospodin 粘附GP53 血小板-粒细胞GMP140 选择素相互作用注：vWF血管性假血友病因子；Fb纤维蛋白原；Fn纤维粘连蛋白；Vn体外粘连蛋；LRG富含亮氨酸家族 2.活化血小板的标志物：活化血小板与静息血小板相比，其质膜糖蛋白常发生显著的变化，这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物。
全血法流式细胞术也是一种免疫学方法，活化血小板表面能通过免疫方法检测的标志物可分为三类［9］：第一类是血小板颗粒膜上的糖蛋白。
血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，颗粒膜蛋白，如CD62、CD63，在质膜上表达，成为活化血小板的分子标志。
第二类是血小板质膜表面变化的糖蛋白表位。
如GPⅡb/Ⅲa(CD41/61)的PAC1表位［10］，它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来。
因此，使用这个表位的荧光单抗，我们能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。
另外，GPIV (CD36)虽然在静息血小板上也表达，但活化血小板上表达量更高［9］；GPIb-IX-V复合物(CD42)则相反，与静息血小板相比，活化血小板上表达量显著降低［7］。
它们都是活化血小板的分子标志。
第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原，包括纤维蛋白原，Xa因子和thrombospondin等。
这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。
除检测免疫性的分子标志物外，流式细胞术还能检测一些反映活化血小板功能的非免疫性指标。
如用Ca2+浓度敏感的荧光染料检测胞内Ca2+流［10］，用能进入血小板致密颗粒的荧光染料阿的平来检测活化血小板的释放功能［11］等。
3.单抗的选择：与血小板有关的CD单抗有CD9，CD31，CD36，CD41a-b，CD42a-d，CD61，CD62，CD63 ，CD107a-b等。
活化血小板的检测需选择针对活化血小板标志物的CD 单抗。
表2列举了活化血小板检测的一些代表性单抗。
表2活化血小板CD单抗简介CD单抗代表性单抗识别的膜糖蛋白CD36 5F1，CIMeg1，ESIVC7 GPIVCD41 PAC1，7E3，PBM6.4 GPⅡb/Ⅲa和GPⅡbCD42a FMC25，BL-H6，GR-P GPⅠCD42b PHN89，AN51，GN287 GPⅠCD61 Y215，CLB-thromb/1 GPⅢaCD62 CLB-thromb/6,RUU-SP1.18.1 P-selectin或GMP140CD63 RUU-SP2.28，CLB-gran/12 GP53三、诊断学意义及临床应用利用全血法流式细胞术检测上述血小板标志物，在许多血小板相关疾病的诊断上有重要的临床应用价值。
1.血栓性疾病：动脉粥样硬化前期血小板沉积，导致心肌梗塞和中风。
抗血小板药能降低心肌缺血的发生率，证明心肌缺血与血小板活化有关。
全血法流式细胞术检测表明心绞痛和心肌梗塞患者循环中有活化的血小板，血小板活力也增强。
冠状窦血液的检测表明，冠状血管成形术会导致血小板活化。
如果血流恢复后有高水平的活化血小板，血管可能因为内皮细胞严重损伤或血小板栓塞而发生再狭窄［12］。
因此，活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性。
另外，非风湿性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化［13］，胰岛素依赖性糖尿病，子痫前期，外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和(或)循环中存在活化血小板，而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)、TXA2的体外激活能力降低。
2.血小板缺陷性疾病：全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺陷性疾病，如巨大血小板综合征，血小板无力症等。
前者是由于GPIb-IX复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大，功能异常的出血性疾病［14］。
巨大血小板从全血中分离很困难。
本法能特异性地识别血小板，省去了分离巨大血小板的步骤，使检测更简便、精确。
后者由于GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷，导致血小板聚集功能障碍［15］。
用全血法流式细胞术分析这些分子标志物有助于血小板缺陷性疾病，尤其是不典型病例的诊断。
3.贮存池疾病：原发性贮存池疾病（δ-SPD）常规用血小板聚集法检测，但特异性和灵敏度均不理想。