第二章 目标产物的分析检测

IPG胶的优点： 机械性能好、重现性好、 易处理、上样量大 等优点，而且避免了电渗作用，可以进行特别稳 定的IEF分离。
二维电泳（2DE)
基本流程： （1）第一向 等电聚焦凝胶电泳 （2）第二向 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 （3）凝胶显色
二维电泳（2DE)的优点
分辨能力可达1万个点（30cm 40cm) 分辨能力可达3000个点（ 20cm 20cm）

二维电泳得到的是构成蛋白质各个亚基的图 谱，而非完整的功能蛋白质图谱。
胶上蛋白检测的灵敏度取决于染色剂
2DE存在的问题





低丰度蛋白的检测； 极酸和极碱性蛋白的分离，目前最多能分离 pH3-11范围内的蛋白质； 高分子量区的蛋白分离困难（分子量大于10万) 膜蛋白或疏水蛋白的分离困难 操作过程难以实现自动化
肽谱技术：是指蛋白质被酶或化学降解后肽段 的分离分析或制备。 1、裂解：酶裂解和化学裂解 2、肽谱分析（指纹术）：SAS-PAGE、HPLC、 CE、MS 蛋白质序列：微量液相脉冲蛋白质/多肽自动顺 序分析仪，灵敏度1pmol，检出极 限为20fmol。

LC-MS/MS对蛋白的全序列进行测定一般需要1-2天时间
蛋白质的定性方法
蛋白质分子量的确定
凝胶筛分（体积排阻色谱）：测定完整蛋白质 的分子量 SDS-PAGE：测定蛋白质亚基的分子量，用量 约1g，误差：5-10% 毛细管电泳：分辨率和准确性高于SDS-PAGE， 用量ng级 质谱：电喷雾质谱（ESI）、基质辅助激光解 析电离质谱（MALDI-TOF），精确度
用于蛋白质、肽分离的色谱技术





反相色谱 离子交换色谱 疏水色谱 体积排阻色谱 亲和色谱 毛细管电泳 毛细管电色谱
毛细管电泳

以电场为驱动力，在毛细管中按溶质淌度或/和 分配系数的不同进行高效、快速分离的技术 。 包括： 毛细管区带电泳 毛细管凝胶电泳 毛细管等电聚焦 毛细管等速电泳 毛细管胶束电动色谱 毛细管电色谱

凝胶电泳技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS — PAGE 等电聚焦 二维凝胶电泳
等电聚焦
不同的氨基酸组成 不同的蛋白质
pI值不同 在偏离蛋白质等电点的介质中， 蛋白质 带负电或者带正电，此时，蛋白质会在电场作 用下分别向正极或负极迁移，当达到其等电点 的位置时，蛋白不带电，迁移停止，这就是等 电点聚焦电泳的基本原理。
等电聚焦电泳的关键取决于凝胶
IPG 试剂— 是拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种 丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧 基或叔氨基团，他们构成了pH 3-10 的缓冲体系。 IPG胶：根据一定的配比，将IPG 试剂以一定的 比例加到混合物中用于凝胶聚合， 从而 形成不同pH值梯度的凝胶条。 APE 公司和BIO-RAD 公司均有IPG胶商品出售
毛细管电色谱
分离的灵敏度

取决于检测器
紫外检测器：pmol级 激光诱导荧光检测器：实现单分子检测 凝聚或核光散射检测器 质谱检测器 核磁检测器
色谱或电泳技术的特点

高效、快速，自动化程度高，定量准确，可直 接与质谱联用进行定性分析

虽然色谱或电泳技术可以克服凝胶电泳的很多 缺陷，但在分离容量上还不及凝胶电泳。

糖检测的困难
为电中性物质，亲水性较强，无发光基团，检 测上存在困难 处理方法：将糖分子进行柱前衍生化反应，使 其带上电荷或发光基团，实现分离 和检测的目的。


寡糖：TLC（薄层色谱）、CE、亲和色谱、离 子交 换色谱、毛细管电泳、红外、MS。
糖蛋白：高效亲和色谱（用外源凝集素作为配 基），对D-葡萄糖和D-甘露糖具有很强 的专一性，也可用双向电泳和聚丙烯酰 胺电泳来检测。

0.01%
等电点
等电聚焦法：既可以测定蛋白质的等电点，又 可以鉴定蛋白质的纯度，是一种 一举两得的方法。 IEF—聚丙烯酰胺等电聚焦电泳 cIFF—全液相毛细管等电聚焦电泳 cIEF—毛细管等电聚焦电泳-电喷雾色谱技术 分辨率极高，能分辨的等电点差异小于 0.04pH单位。

肽谱及蛋白质序列测定
纯度的鉴定方法：
聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS — PAGE 毛细管电泳（CE） 等电聚焦（IEF） HPLC（包括凝胶过滤、各种反向HPLC、 离子色谱、疏水色谱等） 质谱法：电喷雾质谱（ESI），灵敏度Pmol
注意： 仅用一种方法鉴定蛋白质的纯度是不够的，至 少利用两种以上不同分离机理的方法来判断蛋 白质的纯度才比较可靠。

1、酶活力和酶反应速度 酶活力的大小可以 用在一定条件下，它 所催化的某一化学反 应的速度来表示。
பைடு நூலகம்
2、酶的活力单位（U，active unit） 1个酶活力单位，是指在特定条件下（25℃， 其它均采用最适条件），在1分钟内能转化1微摩 尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关 基团的量。 3、酶的比活力（specific activity) 比活力的大小，也就是酶含量的大小，即每 毫克蛋白所具有的酶活力，一般用单位/毫克蛋白 （U/mg蛋白质）来表示。
思考题
1. 需要测定组织纤维酶原激活子的浓度，这是 由一种重组细胞培养得到的治疗型多肽，你 将如何确定生产样品中该肽的浓度，至少写 出两种方法，并说明其原理。 2. 你的公司开发了与某新型治疗型蛋白相结合 的单克隆抗体，该抗体主要用于在生产过程 中亲和层析纯化该蛋白，你将推荐哪种分析 方法确定产品抗体的浓度，为什么？(用酶联 免疫 ,测 其 吸光值)
第二章 目标产品的分析检测及质量控制
蛋白质分析检测技术与质量控制
按照美国食品与药品管理局（FDA）的要求， 对于基因工程产品—蛋白质，除了确定其纯度外， 还要对其物理化学性质进行表征，必须取得以下 数据：
分子量、溶解度、等电点、氨基酸序列、肽谱、二 硫键配对、二级结构、三级结构，与内源性物质的关系，受 体的分布及结合等。 基因工程产品生产过程中不允许有SDS参与。
大连化物所伊利特公司的专用氨基酸分析系统
利用毛细管区带电泳对18种氨基酸的分离
酶
对酶进行分离纯化一般有两方面的目的： 1、为了研究酶的理化特性，需对酶进行鉴定， 必须用纯酶； 2、生化试剂和药物用酶，常常也要求具有较高 的纯度。 检查酶的活力及存在，不能直接用重量或体积 来表示，常用它催化某一特定反应的能力来表 示，即用酶活力来表示。
脂类（Lipids）
脂肪酸（Fatty acids） 洗脱色谱（Elution chromatography） 吸附色谱（Adsorption chromatography） 离子交换色谱 离子排阻色谱 反向色谱 毛细管电泳 超临界流体色谱 检测器：电导检测器和示差检测器

类固醇和抗生素

主要采用反向色谱法进行分离。 维生素 反向、离子排阻等液相色谱法进行分离。
蛋白质的定性、定量检测
蛋白质的定量检测 经典的方法：紫外法 Lowry法 BCA法（二辛可宁酸、二羧基二喹啉） Pierce已有供应 考马斯亮兰G-250 以上几种经典的方法得到的是蛋白质的总量 信息，很难得到目标蛋白的准确含量。 纯度检测 纯度要求：95%、99%，99.9%

目标蛋白的分析方法
其它
蛋白质的二硫键分析： 目前有同位素标记、化学修饰、质谱定位等方 法来确定分子内和分子间的二硫键。 蛋白质翻译后修饰的分析： 蛋白质的磷酸化和糖基化等，主要使用质谱法 确定。质谱法可通过特征离子监测的方法很快 确定磷酸化肽，通过串联质谱确定磷酸化位点。

氨基酸的分析

HPLC：HPLC加柱前或柱后衍生装置 氨基酸自动分析仪： GC：需要柱前衍生化，使之可气化 CE
糖
单糖：HPLC、GLC、MS、IR（红外）、NMR （核磁共振）、酶学检测及基于物理化学 显色反应的检测。 高效离子交换色谱 气-液相色谱：灵敏度高，可分析nmol级的糖类 化合物。 用differential extractive distillation 将单糖衍生 化进而用气相色谱进行分离（FID检测器）。