发酵工艺综合实习指导书

目录

综合实验一土壤中稀有放线菌的分离和纯化

及抗生菌的体外抗菌鉴定

综合实验二玉米淀粉液化、糖化及酒精发酵综合实验三甜酒的酿造

综合实验一

土壤中稀有放线菌的分离和纯化

及抗生菌的体外抗菌鉴定

一土壤中稀有放线菌的分离和纯化

1 实验目的

了解采集土样的要求和方法，掌握由土壤中分离稀有放线菌的差不多原理和操作技术，学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。

2 实验原理

筛选放线菌是新抗研究的重要课题之一。迄今为止，已发觉的抗生素有80%皆来自于放线菌。放线菌要紧存在于土壤中，并在土壤中占有相当大的比例。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。通常，随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。

土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采纳加热处理土样、选用专门培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。

由土壤中分离放线菌的方法专门多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验要紧采纳稀释法，并通过选用专门培养基的方法，来获得少量稀有放线菌。

3 仪器和材料

（1）培养基：葡萄糖天门冬素琼脂，精氨酸琼脂，高氏1号琼脂，以上每种培养基皆用500ml三角瓶分装250ml。

（2）灭菌物品：牛皮纸袋，培养皿，1ml、5ml吸管，250ml 三角瓶分装90ml无菌水（含30粒玻璃珠），18×180mm试管分装9ml无菌水，牙签，玻璃刮铲，18×180mm试管中分装10 ml 1‰

K2Cr2O7母液。

（3）其它：采土铲，细目筛，药勺，称量纸，试管架，小天平，记号笔。

4 试验步骤

（1）采土：选择适宜采样地点。用采土铲去除表土，取5～10cm深处的土壤约150g左右，装入无菌牛皮纸袋中，并注明采样日期、地点、土壤类型、植被和采样人姓名等。

（2）土样预处理：新奇土样应适当风干，并喷施小剂量杀虫剂以防培养过程中虫卵发育的阻碍。

（3）制备平板：每组取10套无菌培养皿，将冷却至50℃左右的各培养基，分不倒入平皿，每皿约15～20ml。每种培养基中需加入20ppm的K2Cr2O7溶液。在皿盖上注明培养基种类及组号。

（4）制备土壤稀释液：每组称取10g土样，放入90ml无菌水中，得到土壤原液。手摇15～20min后，静置1min。再用无菌吸管取1ml上清液，置于9ml无菌水中，充分混匀，则得到10－2稀释液。依此类推，制备10－3、10－4稀释液（一般地，较肥的土壤使用10－3～10－5稀释液，而瘦土则使用10－2～10－4稀释液）。

（5）铺平板：用1ml无菌吸管分不取0.1ml 10－3～10－5稀释液，置于培养基平板中央。然后，再用无菌的玻璃刮铲均匀涂布，

静置10min。每1稀释度3个重复，每1种培养基10套平板。并注明各稀释度。

（6）培养及观看：将各平板置于28℃恒温箱中倒置培养14天。要求分不在第2天、7天和14天进行观看，并依照菌落大小、气生菌丝有无、气生菌丝和基质菌丝的颜色及可溶性色素有无等培养特征，选择单菌落放线菌进行纯培养，同时在平板背面的相应位置上作好标记。

（7）纯培养：及时将选定的单菌落接入高氏1号琼脂斜面，每个菌株接1支斜面。必要时，中间可加1次划线分离培养，然后再转斜面。

5 结果与讨论

将实验结果填入下表。

考虑题

1、在分离土壤放线菌时什么缘故要选用多种培养基？

2、在培养基中添加K2Cr2O7有何作用？

二抗生菌的体外鉴不

1 实验目的

了解抗生素产生菌体外筛选法的原理，学习并掌握抗生菌的鉴不方法。

2 实验原理

由土壤中分出的放线菌需进一步鉴不是否为需要的抗生菌。首先应依照筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其要紧依据是扩散原理，即观看在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。本实验选用了这两种方法。

3 仪器与材料

（1）培养基：500ml三角瓶中分装300ml黄豆饼粉琼脂，18×180mm试管分装4ml黄豆饼粉浸汁，300ml三角瓶分装150ml细菌培养基，150ml三角瓶分装50ml马铃薯培养基。

（2）试验菌：

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

大肠杆菌（Escherichia coli）

金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）

深红酵母（Ruodotorula rubra）

（3）待测菌株：

琼脂培养物：将融化的黄豆饼粉琼脂倒入无菌培养皿，制成平板。用记号笔在平皿背面画一直线，将平皿一分为二，分不注明待测菌株的编号。并按照编号将待测菌株密集划线接入平板。同法接入华美链霉菌（Streptomyces splendens）和金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）作为对比菌，28℃下培养7天

发酵液：将待测菌株和对比菌分不接入黄豆饼粉培养液，作好标记，28℃下振荡培养7天。

（4）灭菌物品：培养皿，打孔器，镊子，圆滤纸片，15×150mm试管分装5ml无菌水，1ml吸管，无菌漏斗。

（5）其它：接种用具，游标卡尺，记号笔，摇床。

4 试验方法

4.1 琼脂块法

（1）分不取枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各1支，加入5ml无菌水

制成菌悬液，备用。

（2）取9套无菌培养皿，向每套培养皿中分不加入1ml试验菌悬液，然后加入约12ml冷却至45℃左右的细菌培养基，迅速在实验台上摇匀，制成指示菌平板。每1种指示菌3个重复，并注明指示菌及测定菌株的位置。

（3）用无菌打孔器将待测菌株和对比菌的黄豆饼粉琼脂培养物切块，每种培养物9块。

（4）用无菌接种针，将待测菌株和对比菌琼脂块分不移入各指示菌平板的相应位置上，菌面朝上，间隔均匀摆放。

（5）静置20min后，放入恒温箱，37℃下培养18～24h。

（6）用游标卡尺测量抑菌圈直径，并观看抑菌圈的透明程度和边缘整齐程度。

4.2 滤纸片法

(1) 向深红酵母菌斜面中加入5ml无菌水，制成菌悬液。

(2) 向已冷却至45℃左右的马铃薯培养基中加入0.5ml深红酵母菌悬液，摇匀后，倒3个指示菌平板，并在平皿背面标明测定菌株的位置，备用。

(3)过滤各测定菌株的发酵液。

(4) 用无菌镊子取无菌的圆滤纸片，蘸取各测定菌株的发酵

滤液，放入指示菌平