2.3发酵罐及灭菌方法

第一节 物理消毒灭菌法
热力灭菌法 辐射杀菌法 滤过除菌法 超声波杀菌法 干燥与低温抑菌法

一. 热力灭菌法
干热灭菌法— 焚烧：废弃物、尸体 灼烧：接种环、试管口 干烤：玻璃器皿 红外线：医疗器械 湿热灭菌法（moist heat sterilization)— 巴氏消 毒法：61.6-62.8 ℃30min或71.7℃15-30s,主要用于 牛乳消毒。 煮沸法；流动蒸汽消毒法 间歇蒸汽消毒法； 高压蒸汽灭菌法


pH值的影响
pH值对微生物的耐热性影响很 大， pH 为 6.0~8.0 时微生物最 不易死亡， pH <6.0时氢离子 易渗入微生物的细胞内。

培养基成分
培养基的成分中，油脂、糖类、蛋白质都 是传热的不良介质，会增加微生物的耐热 性，使灭菌困难。 浓度较高的培养基相对需要较高温度和较 长时间灭菌。 高浓度的盐类，色素则削弱其耐热性，故 较易灭菌。

两级分离、冷却、加热的空气 除菌流程
１——粗过滤器 ４——冷却器
２——压缩机 ５——丝网分离器
３——贮罐 ６——过滤器
高效前置过滤除菌流程
１——高效前置过滤器 ２——压缩机 ３——贮罐 ４——冷却器 ５——丝网分离器 ６——加热器 ７——过滤器
空气净化的流程


吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤 进入空气压缩机（120-150度） 冷却（20-25度），除去油、水，再加热至3035度。 最后通过总过滤器和分过滤器除菌，获得洁净 度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。
发酵罐基本类型
(1）搅拌釜反应器 （stirred tank reactor） (2）气泡柱式反应器 （bubble column) (3) 气升式生物反应器 （airlift reactor) 内管型；外管型
发酵罐工艺操作条件
1．温度：25～40℃。 2．压力：0～1 kg／cm3(表压)。 3．灭菌条件；温度100～140℃，压力0～3 kg／cm3 (表压). 4．pH：2～11。 5．需氧量：0．05～0.3 kmo1／m3· h。 6．通气量：0.3～2 VVM。 7．功率消耗：0.5～4kW／m3。 8. 发酵热量：5 000～20 000 kcal／m3．h。

第三节 发酵设备及消毒灭菌
典型发酵设备

种子制备设备、主发酵设备、辅助 设备(无菌空气和培养基的制备)，发 酵液预处理设备，粗产品的提取设 备、产品精制与干燥设备、流出物 回收、利用和处理设备等。
一

发酵设备概述
发酵主要设备为发酵罐和种子罐，它们各自 都附有原料 ( 培养基 ) 调制、蒸煮、灭菌和冷 却设备，通气调节和除菌设备，以及搅拌器 等。
3、管道及阀门

管道 ：与发酵罐连接的管道有水管、料管、 空气管和蒸汽管 ; 发酵罐内的冷却蛇管与发 酵罐内直接相连的料管等，最好采用不锈钢 管。管径选取的流速是：上水管 1 ～ 2m ／ s ； 料管 0.5 ～ 1.0m ／ s ；空气管 10 ～ 15m ／ s ；蒸 汽15～20m／s。
阀门：阀门是发酵罐的重要组成，它被用于调
消毒剂的种类：酚类、醇类、重金
属盐类、氧化剂、表面活性剂、烷 化剂。
消毒剂的应用：病人排泄物与分泌
物、皮肤、粘膜、饮水、厕所、空 气、手。
第三节 影响消毒灭菌效果的因素




消毒剂的性质、浓度与作用时间 微生物的种类与数量 温度 酸碱度 有机物



培养基中的颗粒物质
培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之， 灭菌容易。一般说来，含有颗粒对培养基 灭菌影响不大，但在培养基混有较大颗粒， 特别是存在凝结成团的胶体时，会影响灭 菌效果，必须过滤除去。
5）高温对培养基成分的有害影 响及其防止
消除高温有害影响的措施
（1）采用特殊加热灭菌法 （2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与 其他成分分别灭菌后再合并； （3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌， 然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀； （4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合 培养基）可进行低压灭菌（在112℃即0.57kg／cm2或8 磅／英寸2下灭菌15分钟）或间歇灭菌； （5）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行 培养基的灭菌


维持设备
维持设备使加热后的培养基保温—定的时 间，从而达到灭菌的目的。 维持设备有两种：罐式和管式。罐式的是 一个带有上下开口用于进出料的立式密封 容器；管式的是用无缝钢管焊成，管内流 速可取0.3～0.6m／s。
冷却设备 ①喷淋冷却器 ②套管冷却器 ③板式换热器 ④螺旋板换热器
4）影响培养基灭菌的因素



加热设备：在配料罐里培养基被加热到70℃， 然后，用泵送到加热设备，在20秒的时间内继 续加热到130～140℃。常用的加热设备有塔式 和喷射式两种。 ℃ 塔式加热设备又称连消塔，塔的有效高度2～ 3m，料液在塔中的流速是0.1m／s，因此料液 在塔内的滞留时间为2～30s。 喷射式加热器有一喷嘴，蒸汽由喷嘴喷出，料 液从侧面进入加热器而被蒸汽加热。
空气压缩机：目前常用的是往复式空压机 过滤器：空气过滤器的类型很多，有棉花 活性炭过滤器、管式过滤器和接送式过滤 器等。 过滤介质：空气除菌用的过滤介质有：棉 花、活性炭玻璃纤维，超细玻璃纤维纸， 石棉滤板、烧结材料、聚乙烯醇(PVA)等多 孔合成树脂、素烧陶瓷筒和聚碳酸酯等。
培养基





2）实罐灭菌
将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭 菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温度， 然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。 操作要点： 三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入 罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定 的时间。这就是所谓的“三路进气”。

3）连消
研究中心智能化、全能性。
(二)发酵辅助设备

发酵辅助设备主要包括：无菌空气 系统，培养基配制和灭菌系统、发 酵车间的管道及阀门等。
1、无菌空气系统



好气性发酵过程中需要大量的无菌空气，空气要 作到 绝对无菌在目前是不可能的，也是不经济的。 发酵对无菌空气的要求是 ：无菌，无灰尘，无杂 质，无水，无油，正压等几项指标； 发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵 过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。 在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许 有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为 N=10-3
节控制气体和液体的流量。 阀门的选取应考虑： ①用于什么目的； ②阀门的材料是否耐温、耐压等； ③连接方式； ④经济成本； ⑤操作方式。
第二部分：消毒与灭菌





消毒(disinfection)：杀死物体上病原微生物的方 法，并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生 物。用以消毒的药品称为消毒剂(disinfectant)。 灭菌(sterilization)：杀灭物体上所有微生物的方 法。灭菌比消毒要求高，包括杀灭细菌芽胞在内 的全部病原微生物和非病原微生物。 抑菌(bacteriostasis)：抑制体内或体外细菌的生长 繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素。 防腐(antisepsis)：防止或抑制体外细菌生长繁殖 的方法。细菌一般不死亡。 无菌(asepsis)：不存在活菌。
培养基（culture medium)是人工配制的适 合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物 的营养基质。 碳源 氮源 无机盐及微量元素 前体、促进剂与抑制剂
培养基的类型

孢子培养基：供菌种繁殖孢子，常用固体 培养基
种子培养基：提供大量优质的菌体，其配 方上应适合于菌体生长于繁殖 发酵培养基：使微生物积累代谢产物，既 要有利于生长繁殖，防止菌体过早衰老， 又要有利于产物的大量合成。
发酵罐系统
一个优良的发酵罐装置和组成 （1）应具有严密的结构 （2）良好的液体混合特性 （3）好的传质、传热速率 （4）具有配套而又可靠的检测、控制仪表
发酵罐的特点
（1）发酵罐对纯种培养的要求高。因此，发酵 罐的严密性，运行的高度可靠性是发酵工业 的显著特点。 （2）发酵罐更加趋向大型化和自动化发展。 自动化方面，如 pH 电极、溶解氧电极、溶解 二氧化碳电极等的在线检测在国外巳相当成 熟。国内目前尚处于起步阶段，发酵检测参 数还只限于温度、压力、空气流量等一些最 常规的参数。
种子罐：以确保发酵罐培养所必需的菌体量 为目的。 发酵罐：承担产物的生产任务。它必须能够 提供微生物生命活动和代谢所要求的条件， 并便于操作和控制，保证工艺条件的实现， 从而获得高产。


(一)发酵罐
发酵罐的定义：是为一个特定生物化学过 程的操作提供良好而满意的环境的容器。 对于某些工艺来说，发酵罐是个密闭容器， 同时附带精密控制系统；而对于另一些简 单的工艺来说，发酵罐只是个开口容器， 有时甚至简单到只要有一个开口的坑。

二. 辐射杀菌法



紫外线 波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。 其主要作用于DNA，使一条DNA链上相 邻的两个胸腺嘧 啶共价结合形成二聚体， 导致细菌变异和死亡。 电离辐射 高速电子、X射线、γ射线 微波 波长1mm~1m
三. 滤过除菌法
赛氏滤器
玻璃滤器
薄膜滤器
四. 超声波杀菌法

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2、培养基的灭菌

1）空罐灭菌 空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、 还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基 （或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为 空罐灭菌。 为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空 罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这 样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。
是一种机械的作用因素，每秒超过2 万次振动的声波即为超声波。常用 的超声波发生器能产生20-100千赫的 声波，可使细菌细胞壁裂解而死亡。
五. 干燥低温抑菌法
干燥法 低温法：低温可使细菌的新陈代谢 减慢，常用作保存细菌菌种。冷冻 真空干燥法是目前保存菌种的最好 方法。

第二节 化学消毒灭菌法
发酵设备及检测控制系统 B|Braun公司
•发酵罐：Biostat系列 •参数检测 •多级控制：
Biostat B2
Biostat ED10
Pilot Biostat UD50
国内、外发酵设备公司
德国贝朗 占中国80%以上的市场 瑞士比欧 美国NBS 韩国 日本 华东理工大学 江苏理工大学
发酵罐按容积分类
一般认为500L以下的是实验室发酵罐；
500-5000L是中试发酵罐；
5000L以上是生产规模的发酵罐。
现代发酵工程规模
低值工业品大型化
以规模来取胜 （几十数百吨）。如味精、氨基酸、 有机酸、抗生素、饲料、食品工业用 产品等；
高价值转基因产品小型化（几十数
百升）。基因工程大肠杆菌、酵母菌 高密度培养；动物细胞植物细胞培养；
发酵生产中制备无菌空气的大 致过程
高空取气管

高空取气管是远离地面几十米 的管子。一般而言，地面附近 空气中所含的 微生物和灰尘等 均比高空空气中含的多，据资 料介绍，每升高10米，空气中 杂菌可降低一个数量级，因此 从高空取气要比从低空取气有 利得多。
油水分离器
其内部同时采用直接拦截， 惯性碰撞，布朗扩散及凝 聚等机理，能有效地去除 空气中的水、油雾、尘埃， 内部不锈钢丝网可清洗， 使用寿命长。