血清血浆核酸提取实验常见问题解析

血清血浆核酸提取实验常见问题解析

很多人在做血清DNA提取、血浆DNA提取时会对样本类型概念不清楚，什么是全血，什么是血清，什么是血浆，概念不清楚，在做核酸提取、核酸检测类的实验时，对提取试剂的选择也比较随意，导致实验结果往往不尽如人意。那么全血、血浆、血清有什么区别，如何选择相应的核酸提取试剂呢？

一、什么是外周血，什么是全血，什么是血清，什么是血浆？

新鲜的血液（也叫全血，医学上称为外周血）加入抗凝剂（如柠檬酸钠，EDTA 等，一般医院采血都是用抗凝管采集），静置一段时间，会出现分层的现象。上面淡黄色的半透明液体是血浆，约占55%，下面暗红色不透明的是红细胞，约占45%。中间薄薄的一层白色物质是白细胞和血小板，不到1%。红细胞、白细胞、血小板共同组成了血细胞。

血液不加抗凝剂会很快凝固，在凝血块周围出现的淡黄色的透明液体是血清，血清中不含纤维蛋白原。

简单来说，全血包括血浆和血细胞（红细胞、白细胞、血小板），血浆包括血清和纤维蛋白原。

如果要提取血细胞中的核酸，需要选择血细胞核酸提取试剂或全血核酸提取试剂；如果要从血清或血浆中提取游离核酸或游离肿瘤核酸则要选择血浆或血清核酸提取试剂；如果需要检测外周血中有无病毒或细菌感染，一般也是选择血浆或血清核酸提取试剂。如果要提取DNA，需要选择DNA提取试剂，要提取RNA，则要选择RNA提取试剂。如果目标基因丰度较低，需要较多的血浆或血清进行富集提取，则需要选择专门的血浆DNA、血清DNA富集提取试剂。还有，如果核酸检测的结果要面向临床出具检验报告，选择的提取试剂盒要通过药监局审查，应有药监局备案号，这一点非常重要。在进行核酸提取实验时，切不可选错了试剂盒，否则会影响实验效果和实验进度。目前，国内应用较多的血液系列核酸提取试剂主要有Qiagen、Biog等，其血液系列核酸提取试剂均比较全面，包括血液DNA提取、血清DNA提取、血浆DNA提取、血液RNA提取、血浆RNA提取、血清RNA提取、

小量提取试剂、中量富集提取试剂等，研究者可根据实验需要进行选择。

二、血清血浆DNA提取需要多少样本量？得率多少正常？

图1 Qiagen关于cfDNA得率的数据图

图2 Biog血浆DNA提取试剂盒做血浆样本DNA提取，Q-bit测浓度无读数，PCR检测结果靶基因（CT 25左右）以及内参（CT 21左右）扩增曲线

血清、血浆样本中游离核酸含量较低，根据Qiagen公司数据，1ml血浆DNA

提取得率只有7.35ng左右（图1）。这么低的核酸浓度，如果直接用紫外法检测，得出的数值并不准确，而且多次测量的结果会变异很大。有些研究者血浆核酸提取后习惯于先用紫外检测浓度，发现紫外检测不出来或浓度很低时便认为核酸提取失败，放弃后面进一步的实验，其实并不可取。我们可以把紫外读数作为参考，但是不能作为判断得率的唯一标准，最好还是要做个PCR或荧光定量。根据Qiagen公司的实验，血清血浆的量与提取的核酸量成正比。因而，如果要提高核酸提取得率，可通过增加血清或血浆的量来实现。一般地，做血浆或血清核酸提取，样本量最好在1ml以上。如果1ml或更大量样本得不到满意的检测结果，则应及时考虑更换提取试剂盒。目前国内常用的Qiagen、Biog血浆核酸提取试剂盒核酸提取的得率都很不错，基本上能够满足绝大多数实验的要求。

三、不同检测目标的实验选择什么类型的样本？

从核酸检测的角度讲，人的基因组更多的存在于白细胞中，而只有少量游离核酸存在于血清、血浆中，如果白细胞大量凋亡，血清血浆中的游离核酸量会有所增加。如果机体患有恶性肿瘤，肿瘤组织坏死，坏死的肿瘤细胞释放出核酸片段或肿瘤细胞发生血液转移，血浆血清中的核酸量也会增加。因而，如果是检测机体固有的目标基因，如筛查地中海贫血症，筛查色盲基因等，应该以全血作为实验样本，因为血清和血浆中所含有的人的核酸数量远远少于全血，检测灵敏度会降低很多。如果要检测肿瘤相关基因，则要选择血浆或血清样本，进行血浆核酸提取或血清核酸提取。如果以病原体核酸为检验目标，如检测乙肝感染情况，检测感冒病毒，检测有无败血症等，则以血清或血浆为实验样本，这会天然地剔除血细胞这种杂质，明显降低核酸提取过程中的难度，有利于提高核酸纯度，增加检测反应灵敏性和稳定性。血清和血浆相比，一方面血清中含有更少的纤维蛋白原，另一方面血清中的DNA是循环DNA，主要来源于病变组织，所以使用血清作为实验样本，可以更进一步提高样本纯净度，减少蛋白杂质，提高游离核酸的浓度，获得更为灵敏的检测结果。