丙型肝炎病毒基因分型检测方法研究进展_周一萌

［5 ］
的病变程度也不同。 回顾性研究发现：1b 亚型患者肝脏组 织学分级、 病程进展速度以及平均 HCV 病毒载量均明显高 1b 亚型会引起较强的肝坏死炎症和肝纤维化 。 因 于 2 型， HCV 基因分型的检测对控制丙型肝炎的传播 、 此， 提高丙型 肝炎的治疗效果非常重要 。
组高突变区（ HVＲ ） 的变异， 还可以把 HCV 分为许多准种， 病毒在感染者体内一般以多个准种的形式共存 1. 2 HCV 基因型分布 。 80 目前 HCV 主要有 6 种基因型，
［2 ］ 患者 ＲBV 剂量为 800 mg / d 。 不同基因型 HCV 患者肝脏
HCV 毒株编码非结构蛋白 5 （ NS5 ） 区域的核苷酸序列， 进行 系统进化分析， 按照发现的先后顺序将 HCV 分为 1 b、 c 等表示。 该分型法能与先 每个型下面有若干亚型， 以 a、 前的各种分型命名法相对应， 不仅协调了以前的分型命名方 法， 而且可以命名新的型和亚型， 因此得到了大多数学者的 认同。不同基因型的全基因组序列差异达 30% 以上， 氨基 酸序列差异达 25% 源性在 70% 30% 。同一基因型中不同亚型间的同 85% ， 大于 85% 归为同一株。根据 HCV 基因
。
能准确区分出 于测序分析法所扩增的基因组具有高异质性， 亚型， 因此许多其他分型方法都将序列分型作为参考标准 。 该方法所获的序列信息最多， 可以明确被测区域的多态性， 并能发现新的基因型， 但又因为这些区域序列变异大， 导致 PCＲ） 和测序。而且该测 有时不能成功进行逆转录 PCＲ（ ＲT-
基金项目：沈阳市科技计划项目（ F12 － 193 － 9 － 27 ） 作者单位：中国医科大学附属盛京医院感染科， 沈阳 110004 hospital． org 通信作者：张琳， 电子信箱：zhangl@ sj-
2014 年 8 月第 34 卷第 8 期
中国实用内科杂志
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综
述
丙型肝炎病毒基因分型检测方法研究进展
周一萌， 窦晓光， 张
DOI：10． 7504 / nk2014070703 关键词：丙型肝炎病毒；基因型 Keywords：hepatitis C virus；genotype 中图分类号：Ｒ512. 6 + 3
HCV 基因型的临床意义
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1. 1
HCV 基因型的研究现状
HCV 基因分型 1993 年 Simmonds 等［4］ 通过比较不同 6 型，
HCV 基 因 1 型 患 者， 出， 经标准剂量的聚乙二醇干扰素 （ PEGIFN） 联合利巴韦林（ ＲBV ） 治疗 48 周后， 40% PEGIFN 联合 ＲBV 治 疗 24 周 后， 65% 54% 的患者获得 SVＲ。HCV 基因 2 型或 3 型患者， 经标准剂量的 82% 的 患 者 获 得 SVＲ。不同基因型利巴韦林的治疗剂量也不同， 4、 5、 基因 l、 6 型患者的 ＲBV 剂量为 15 mg / （ kg·d） ， 基因 2 型和 3 型的
［6 ］
HCV 基因组有代表性的片段（ 如 E1 、 NS5b、 C 区） ， 再进行核 苷酸序列测定， 直接测序后与 GenBank 中已上传的基因序列 进行序列比对后， 描绘出系统进化树， 根据进化距离及种系 关系确定 HCV 的基因型。 目前为 HCV 基因分型方法中最
［9 ］ 经典、 最准确的方法， 是 HCV 基因分型的“金标准 ” 。 由
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将 PSEMA 方法改进为
SPSEMA（ semiautomatedprimerspecific extension＆mispaire analysis） 试剂， PSE其敏感度比直接测序法提高 20 倍， 用 SMA 分型的 HCV 混合基因型血清中， 直接测序法只能测出 time PCＲ ） 、 样本中的 40% ， 而实时定量 PCＲ （ real限制性片 段长度多态性（ ＲFLP ） 及特异性探针杂交法分别可以测出 38. 5% ， 15. 4% ， 16. 1% ， 这也为 HCV 混合基因型的检测提 供了更精确的方法。 Antonishyn 等
［11 ］
LI将该方法与 INNO-
PAⅡ试剂检测对比， 一致率可达 98. 5% 。 该方法操作简单， 成本较低， 但由于大家采用的引物各不相同， 因此该方法的 结果不利于相互比较， 而且有时会出现较弱的扩增条带， 难 以判断， 因而没有在临床上广泛使用 。 2. 3 ＲFLP PCＲ 扩增具有不同酶切位点的各种 利用 ＲT5 种不同限制性内切酶 HCV 基因型片段， 将 PCＲ 产物用 3
［6 ］
肝炎患者发展为肝硬化， 另外 20% 进展为肝细胞癌。 HCV 基因分型与病程发展和干扰素治疗应答有密切的关系 ， 因 HCV 基因分型的检测对控制丙型肝炎的传播 、 提高丙型 此， 肝炎的治疗效果非常重要 。本文将对 HCV 基因分型检测方 法研究现状做一综述 。
。 欧洲肝病学会诊疗指南指
2
2. 1
HCV 基因型分子学检测方法
直接测序分析法 通过聚合酶链式反应 （ PCＲ ） 扩增
2、 3 型呈全球分布， 多个亚型。1 、 在美国、 欧洲、 日本及中 70% 以上的 HCV 为 1b 型， 国， 主要由血液传播。2a 及 2b 型 占 HCV 感染患者的 10% 30% ， 在北美、 欧洲及日本也很普 遍；2c 型主要发现于意大利北部地区 。3 型主要在印度及南 非地区流行， 欧洲及美国的毒品静脉注射者中也比较常见 。 4 型主要分布于非洲及地中海北部国家如埃及 。 南非发现 基因 5 型， 基因 6 型主要在中国香港及东南亚地区流行
1 型和 2 型在年老的患者中较 我国 HCV 流行的主要基因型， 多， 而 3 型和 6a 型在年轻人中较多。 HCV 基因型地区分布 不是固定不变的， 影响因素有人群的流动 、 静脉吸毒者增加、 血液透析等治疗措施的普及以及使用检测方法的不同 。 比 如由于人口的流动， 西南边境地区 6a 型已取代 2a 型成为第 二流行基因型 1. 3
［12 ］
5 型及 6 型的部分亚型分型， 但不能区分 6c 型和
。而改良后的 LIPAⅡ增加了核心区的信息， 对 HCV
基因 1 型和 6 型的亚型鉴别有较好的特异性 。 该方法与测 序法相比一致率较高， 且在检测混合感染时比测序法更为优 越， 在国内外报道的 HCV 基因分型研究中常用。 稍显不足 的是， 该方法对低载量病毒检测结果不太理想 2. 5 实时定量 PCＲ
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。Oprian 等
［14 ］
研究发现 ＲFLP 方法在 5' UTＲ 区进行
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（ Belgium） 开发， 已通过 CE 认证。其利用反向线性杂交方法 进行 HCV 分型检测， 扩增 5' UTＲ 区。 Zheng 等 检测出 HCV1 应用该试 剂盒对 110 份患者血清进行基因分型， 其中 107 份可分型， 6 共 6 种不同的基因型及 1a、 1b、 2a / c、 2b、 由德国 Ba3a、 4a、 4h 等亚型。 2. 7. 2 Versant HCV Genotype Assay（ LiPA） 2. 0 yer 公司联合 Innogenetics 公司（ Belgium） 推出的新版 HCV 基 因分型试剂， 已通过 CE 认证。 原理同样是线性探针杂交， 但对 1 型和 6 型的检测更准确。 而由于增加了 C 区序列信 息， 该试剂能更好的区分 1a 与 1b 型。 但该试剂对 2 型及 4 型的检测结果不理想， 因为 5' UTＲ 区的异质性没有得到充 分应用 2. 7. 3
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Chinese Journal of Practical Internal Medicine
Aug． 2014 Vol． 34 No． 8
序法操作繁琐、 工序复杂， 只能在有限范围内应用， 难以对较
［10 ］ 因此难以在临床工作上使用 。 Nolte 等 大样本进行分析，
过 LIPA 条带放射自显影就能检测 HCV 基因型， 检测结果与 金标准相比有很好的一致性 。 该方法是目前应用最多的一 种基于核酸杂交的 HCV 基因分型方法。 该方法操作简便， 能够对 1 1型
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。目前 全 世 界 HCV 感 染 者 很 可 能 已 超 过 2. 0
、 2005 年 Lu 等［8］ 以及 Dong 等［3］ 研究显示， 1b 型仍为
。我国人群抗 HCV 阳性率为 3. 2% ， 约有近 4 千万感染 。大部分 HCV 感染转为慢性感染， 其中 20% 慢性丙型
［1 ］
将电泳结果与已知限制性片段数据库进行比较， 进行酶切， C 区、 从而确定基因型。 该方法的扩增区可以选择 5' UTＲ、 NS5B， 选择 5'UTＲ 区域检测主要基因型时， 该方法效果较 Mbol、 EcoＲll 等， 好。常用的酶为 Accl、 利用这些酶可将 6 个 基因型分开。该方法对 HCV 感染者分型的结果与直接测序 法高度一致， 但也有部分血清因酶切位点不同无法测出基因 型
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用基因测序法及 LIPA 试剂分别对 172 份 HCV 感染血清进 行分型， 对比发现两种方法检测敏感度相似， 但两种方法不 能精确区分 HCV 的亚型， 基因测序法更复杂， 却能提供更详 细的信息， 基因组系统也容易更新， 为学者提供最新的 HCV 基因信息。 2. 2 基因型特异性引物扩增法 Antonishyn 等［11］ 称该方法 HCV （ primerspecific extension analysis ） ， 为 PSEA即根据不 1 型、 2 型、 3 型、 4 型及亚型 1a、 1b、 2a / c、 2b 同 HCV 基因型， 在 HCV 非编码区基因组的差异， 设计一系列特异性引物， 扩 增出不同长度的片段， 并以此进行分型。 扩增过程中， 其依 据是 PfuDNA 聚合酶的 3' 5' 外切核酸酶校正活动， 如不匹 将阻止引物延伸。要保证 HCV 各型之间有较大差异， 不 配， 但对 PCＲ 引物的设计要求较高， 且每份样品需同时进行多 次检测才能最终确定型别 。Hu 等