第五章 工业微生物产生菌的分离筛选

（一）根据土壤特点
1．土壤有机质含量和通气状况
耕作土、菜园土、近郊土壤，森林土，贫瘠土壤
土样最好的土层是5-25cm、一般每克土中含菌数约 几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几 乎都能分离到。总的来说酵母菌分布土层最浅，约510 cm；霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。厌氧菌 分布较深。
2．土壤的酸碱度和植被状况 3．地理条件：南方、北方 4．季节条件 ：7—10个月


（二）采样方法
用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取 5-25cm处的土样10～25 g，装入事先准准备好的 塑料袋内扎好。给塑料袋编号并记录地点、土壤 土质、植被名称、时间及其他环境条件。 北方土壤干燥．在10-30cm处取样。 一般样品取回后应马上分离，以免微生物死 亡。 样品较多时，可先采用选择性培养基做好试 管斜面，随身带走。

二、控制培养条件
微生物的生理特点
细菌、放线菌的生长繁殖要求偏碱（pH7.0-7.5) 霉菌和酵母菌的生长繁殖要求偏酸（pH4.5-6.0） 温度、通气量等
极端微生物

三、抑制不需要的菌类
1、分离真菌时可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌
2、分离放线菌时在培养基中加入10滴10%的酚或加青霉素、 链霉素等抑制革兰氏阳性菌和阴性菌，或加入丙酸钠 10ug/ml抑制霉菌和细菌生长 3、加入放线菌酮可以有效抑制真菌的生长 4、在富集培养基中加人适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑 制革兰阳性菌的生长，对革兰阴性菌无抑制作用 5、分离厌氧菌时，可加人少量硫乙醇酸钠作为还原剂
（四）试管厌气培养法
（五）玻璃板隔绝空气培养法 （六）生物吸氧法 除以上的方法外，还有肝块肉汤培养， 高层琼脂法，共栖培养法等 实例： 1）保加利亚乳杆菌的分离筛选 2）反硝化细菌的分离
（ 1 ）单个平皿法
按常规在琼脂平板上划线接种。将固体石蜡置于一容器 中加热融化。取方形玻板一块 , 中央置纱布或重叠滤纸一小 块 , 上面放焦性没食子酸 0.5g ，加 10 ％氢氧化钠溶液 0.5ml 后迅速将平皿底倒置于其上，周围立即用融化石蜡封闭。 置 37 ℃温箱培养 2-3d ，取出观察。
工业菌种
几乎所有的培养物 真菌类 动植物细胞系 微生物菌种
韩国典型培养物保藏中心(KCTC) 韩国 培养物 俄罗斯微生物保藏中心(VKM) 俄罗斯 工业微生物 俄罗斯科学院微生物理化所(IBFM VKM) 俄罗斯 所有培养物 俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM) 俄罗斯 工业菌种 斯洛伐克酵母保存所(CCY) 斯洛伐克 酵母菌 西班牙普通微生物保藏中心(CECT) 西班牙 普通微生物菌种 英国藻类和原生物动物保藏中心(CCAP) 英国 藻类、原生动物 欧洲动物细胞保藏中心(ECACC) 英国 动物细胞系等 国际真菌学研究所(IMI) 英国 真菌、细菌等 英国国家食品细胞保藏中心(NCFB) 英国 工业细菌 英国国家典型培养物保藏中心(NCTC) 英国 普通微生物 英国国家酵母菌保藏中心(NCYC) 英国 酵母菌 英国国家工业和海洋细菌保藏中心(NCIMB) 英国 工业及海洋细菌 美国北方农业研究所培养物保藏中心(NRRL) 美国 以微生物菌种为主 美国典型培养物保藏中心(ATCC) 美国 几乎所有的培养物
第五节

野生型目的菌株的筛选 和菌株鉴定


一、初筛 1．平板筛选 较粗放的检筛方法 2．摇瓶筛选 效果比较一致，由此筛选到的菌株易于推广,通 过该法可淘汰85-90%不符合要求的微生物 二、复筛 一个菌株通常要重复3-5个瓶，培养后的发酵液 采用精确分析方法测定

三
菌株鉴定
菌落形态，个 体形态，革兰 氏染色，生理 生化，分子鉴 定
（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体 等，从中进行分离筛选。
（3）从一些发酵制品中分离目的菌株。



菌株的分离和筛选一般可分以下几个步骤: 采样 富集 分离 产物鉴别 生化鉴定
第一节

含微生物样品的采集
一、从土壤中采样 1克土壤的含菌量大体有如下的递减规律： 细菌（108）＞放线菌（107）＞霉菌（106） ＞酵母菌（105）＞藻类（104）＞原生动 物（103）
6、在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样 在空气中干燥，再加热到100℃保温1h，可简 少细菌和链霉菌的数量。 7、分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别 将样品在高浓度酒精和高浓度甘蔗溶液中处理 一段时间。杀死非目的微生物后再进行分离。 从土壤中分离芽孢杆菌 对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生 物时，采用富集培养可以提高分离工作效率。
第三节 好氧微生物的分离
较粗放的分离方法 “菌落纯” 如稀释涂布法，划线分离法，组织分离法等 。 组织分离法则通常是从有病或特殊组织中分离 菌株。
较细的分离方法 “菌株纯” 单细胞或单孢子分离方法” 这类方法需采用专门的仪器设备，复杂的如显 微操纵装置，简单的可利用培养皿或凹玻片作 分离小室进行分离、
第四节

厌氧微生物的分离
一、厌氧培养中几种除氧的方法
（一）加还原剂 分离培养基内加人还原剂，如半胱氨酸、D 型维生素C、硫化钠等，操作时以最快的速 度划线分离，然后立即置于事先已抽真空 密闭的容器内（充CO2或N2），适温培养。
（二）焦性没食子酸法 （1,2,3-三羟基苯） （三）平皿厌气培养法
五 单细胞或单孢子分离法 1、小滴分离纯化方法 稀释样品为1500/ml，滴管4000d/ml 2、滤纸片法

六、通过控制营养和培养条件进行分离
1.培养基的营养成分 2.培养基的pH 3.排除不需要的菌类 4．控制培养温度

50-60℃ 20-40℃ 15℃或更低
（1）分离细菌时，在培养基中加入浓度为50U／ml制霉菌素； 可以抑制霉菌和酵母菌的生长。 （2）分离放线菌时，在样品中加入 0.05 ％十二烷基磺酸钠 （SDS）不仅可以抑制细菌的主长；还能激活放线菌孢子的菌 丝。加人氟哌酸（5mg/L）+制霉菌素（50mg/L）+青霉素 （0.5mg/L）也可有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线菌的 生长。 （3）分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉素 和四环素各30U／ml，可以抑制细菌和放线菌生长。 （4）分离根霉和毛霉在培养基中添加0.1%去氧胆酸钠或山梨 醇防止菌丝蔓延，使菌落长得小而紧密。

菌种可从以下几个途径进行收集和筛选：
（1）向菌种保藏机构和个人索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。
国际承认的培养物保藏单位 保藏单位(简称) 所在国家 澳大利亚国家分析试验室(AGAL) 澳大利亚 比利时微生物保藏中心(BCCM) 比利时 保加利亚菌种保藏库(NBIMCC) 保加利亚 中国典型培养物保藏中心(CCTCC) 中国 中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC) 中国 捷克微生物保藏所(CCM) 捷克 法国微生物保藏中心(CNCM) 法国 德国微生物保藏中心(DSM) 德国 匈牙利国家农业和 工业微生物保藏中心(NCAIM) 匈牙利 日本国家生命科学 和人类技术研究所(NIBH) 日本 荷兰真菌保藏所(CBS) 荷兰 韩国细胞系研究联盟(KCLRF) 韩国 韩国微生物保藏中心(KCCM) 韩国 保藏范围 微生物菌种 大部分微生物菌种 微生物菌种 几乎所有的培养物 普通菌种 普通微生物菌种 几乎所有的培养物 普通微生物菌种
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二、根据微生物生理特点取样 1．根据微生物的营养类型



每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也有差异。 若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、 生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满 意的效果。 森林、肉类加工厂、面粉厂、糖厂、柑橘、油田、化工厂 等 不少微生物对碳源的利用是不完全专一的，如以油脂为碳 源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉获得能源而生 长。
第五章 工业微生物产生菌 的分离筛选
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节

含微生物样品的采集 含微生物样品的富集培养 好养微生物的分离 厌氧微生物的分离 野生型菌株的筛选和菌株鉴定 极端环境微生物的分离筛选 生物可降解塑料菌株的分离筛选
菌种是发酵工业的关键
待筛选的菌株能 分泌产生某些能 利用一些有特别营养要 抑制工具菌生长 求的微生物作为工具菌， 的物质 如待筛选菌具有该营养 物的前体转化成营养物 能力，工具菌就能围绕 该菌生长
四

组织分离法
1．对一般有病组织的分离方法 用10%漂白粉或0.1升汞浸泡 2．食用菌孢子分离法 （1）多孢子分离法 （2）单孢子分离法：单孢子稀释
一 稀释涂布法 二 划线分离法 三 利用平皿的生化反 应进行分离 1．透明圈法 2．变色圈法 3．生长圈法 4．抑菌圈法

饱浸含某种指示 剂的固体培养基 的滤纸片变色圈
固体培养基中渗入溶解性 差、可被特定菌利用的营 养成分，造成不透明的培 养基背景。菌落利用此物 质形成透明圈。
指示剂直接掺入或喷洒固 体培养基，菌落周围形成 变色圈。如淀粉的平皿上 喷上稀碘液
三个步骤：1、获得该微生物的纯种培养物；
2、测定一系列必要的鉴定指标；
3、根据权威性的鉴定手册进行菌种鉴定。 四个水平：细胞形态和习性水平；细胞组分水平； 蛋白质水平；基因或DNA水平。
例子：高产类胡萝卜素红酵母的分离 筛选
取样 富集培养（初筛和复筛） 菌株鉴定
取样及筛选
1、水池边红色附着物中红酵母的分离


2.根据微生物的生理特性
高温、低温、耐压、耐高渗等

三、特殊环境下采样 1．局部环境条件的影响
特定微生 物的分离


2．极端环境条件的影响
嗜极菌 嗜压、嗜酸 嗜减
第二节 含微生物样品的富集培养
富集培养（enrichment breeding)：是在目的 微生物含量较少时根据微生物的特点设计一种 一、控制培养基的营养成分 选择培养基，创造有利的生长条件，使目的微 生物在最适的环境下迅速生长繁殖，数量增加， 由原来的自然条件下的劣势菌株变成人工环境 1 根据环境条件选择合适的培养基 下的优势种，以利分离到所需菌株。 2、根据微生物的类型 富集培养主要是根据微生物的碳源、氮源、pH、 3、根据微生物对环境的耐受范围具有可塑性 温度、需氧等生理因素加以控制。 的特点(抗性菌株、污染物分解菌）
2、公共浴室红色附着物中红酵母的分离 3、空气中红酵母的分离 4、果园土壤、汽车修理厂土壤中红酵母的分离 5、醪糟、葡萄汁中红酵母的分离
分离筛选用培养基
1、平板筛选培养基（20% PDA）：马铃薯20%，葡萄糖 2%，琼脂1.8%，自然pH，121℃灭菌30min； 2、富集培养基：马铃薯20%，葡萄糖2%，自然pH， 121℃灭菌30min；


菌株分离（separation）就是将一个混杂着各 种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实 际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方 法对它们进行分离、筛选，进而得到所需的微生 物的过程。 工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一 是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的 野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
3、斜面保存培养基（20% PDA）：马铃薯20%，葡萄糖 2%，琼脂1.8%，自然pH，121℃灭菌30min；
4、液体种子培养基(YEPD)[9]：葡萄糖2%，酵母 膏1%，蛋白胨1%，自然pH，121℃灭菌20min； 5、液体发酵培养基(YEPD)[9]：葡萄糖4%，酵母 膏1%，蛋白胨1%，pH 6.0 ，121℃灭菌20min； 6、鉴定用培养基[10]：5%麦芽汁培养基，12.5% 豆芽汁培养基，尿素液体培养基，无碳培养基， 无氮培养基，尿素液体培养基，Gorodkowa培养基， 马铃薯块培养基。
（ 2 ）试管培养法 取约 100cm3 容积的大试管一支，在管底放焦性没食子 酸 10g 及玻璃珠数个。将已接种的培养管放入大试管中，加 入 20 ％氢氧化钠溶液 1m1 ，立即将管口用橡皮塞塞紧，必 要时四周围封以石蜡， 37℃培养 2-3d 观察。 3 ）干燥器（玻罐）法 计算好容器的体积，根据其体积称取焦性没食子酸（置 于平皿内）和配制氢氧化钠溶液。将氢氧化钠溶液倒人干燥器 底部，把盛有焦性没食子酸的平皿轻轻漂浮于液面上。放好隔 板，将接种好的平板或试管置于隔板上，把干燥器盖盖上密封 （可预先在罐口抹一薄层凡士林）。轻轻摇动干燥器，使焦性 没食子酸和氢氧化钠溶液混合，置 37 ℃温箱培养 2-3d ，取 出观察