反相色谱柱的选择
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• 所有原料的质量控制 • 填料生产过程控制 • 物理化学性质检验
– Characterization of Packing
• 高质量，有色谱意义测试实验
— 确保批次间重现性
小结
• 反相色谱填料的选择性与批次间重现性 与硅胶的质量及键合相的生产过程密切 相关 • 填料批次间重现性对方法长期之重复性 至关重要
2.3
µBondapak™ C18
选择性变化
Waters Spherisorb® ODS2
1.8
YMC J'sphere™ ODS–L80 Nucleosil® C18 YMC J'sphere™ ODS–M80 Hypersil® ODS YMC J'sphere™ ODS–H80 Nova-Pak® C18
Waters 21,379
由于拖尾引起的灵敏度差异
Symmetry C18
AU
他莫昔芬 0.25 g/mL
信噪比
Conventional C18
AU
11.0 6.5
5.00
10.00
Minutes
峰形对分辨率的影响
Rs = (tr Peak 2 – trPeak 1)/ 0.5 (w4.4% Peak 1 + w4.4% Peak2) Rs = (11.5-10.6)/ 0.5 (2.0 + 0.5) Rs = 0.72
注意：基线分离的分辨率 = 1.5
0
5
10 Minutes
15
20
25
何种原因导致不好的峰形？
以碱性物质为例
硅胶颗粒中金属离子的浓度
硅醇（羟）基与碱性物质之相互作用
金属离子浓度对色谱峰形的影响
Symmetry® C18 Al conc.< 10 ppm
TF USP = 1.9
Nova-Pak® C18 Amitriptyline Al conc.= ~375 ppm TF USP = 6.4
疏水性增加
1 1.5 2 2.5
-0.2 3 3.5
(ln [k] acenaphthene)
小结：
• 填料的疏水性以及残留硅羟基活性是决 定色谱柱选择性的重要因素，因此，在 选择色谱柱时应充分了解填料的性质。 • 色谱柱选择性比较表对合适色谱柱的选 择具有指导意义。
对HPLC色谱柱的要求
• 合适的选择性 良好的色谱峰形
• 高性能与宽适用范围
对HPLC色谱柱的要求
合适的选择性
– 满足不同的分离要求
• 良好的色谱峰形 • 重现性 • 宽应用范围
C18 填料的合成
传统硅胶颗粒基质
合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
Polyethoxysilane (PEOS)
Tetraethoxysilane (TEOS)
色谱峰对称性的衡量方法
•USP 拖尾因子（Tailing Factor）: (a+ b) T＝ 2a •不对称因子
a
b
峰高之5 %处
由于拖尾引起的积分误差
T = 1.58 T = 1.00 峰面积回收率 99.9 % 99.8 % 99.6 % 峰面积回收率 97.8 % 95.3 % 92.3 %
与带电硅羟基的离子交换作用
O-Si O-Si OO-Si O-Si + O- (CH ) HN 32 O-Si OO-Si O-Si O-Si OO--Si O-Si
流动相 pH < 3
+ HN (CH3 )
2
Si - OH
流动相 pH > 3
Si – O-
碱
碱
如何克服硅羟基作用？
• 七十与八十年代：
为什么这些硅胶反相C18填料如此不同？
• 色谱测试结果显示：
– 疏水性不同 – 残留硅羟基活性不同
• 为什么？
– 不同 C18配体键合水平（状况）
• 配体密度
– 不同硅胶颗粒基质
• 密度，表面积，孔径
• 纯度
2.8
色谱柱选择性比较表
Waters Spherisorb® ODS1 Resolve® C18
– 容忍碱性物质拖尾现象存在，使用流动相 改性剂改善色谱峰形
• 九十年代以后：
– 改进反相色谱填料颗粒技术，降低不尽人 意的硅羟基相互作用，内嵌极性基团技术
小结：
• 色谱峰形的好坏是准确定量的决定 因素 • 新型内嵌极性基团技术、杂化颗粒 技术能够有效地改善色谱峰峰形。 • 高纯度硅胶填料的色谱柱具有优异 的色谱峰形。
对HPLC色谱柱的要求
• 合适的选择性 • 良好的色谱峰形 重现性
– 色谱柱间重现性 – 批次间重现性
• 宽应用范围
为什么重现性如此重要？
• • • • 重现性是液相色谱分析的基本要求 缺乏重现性是用户最担心的问题 加快方法验证(Validation)的速度 更容易传递方法
– instrument-to-instrument, and lab-to-lab
5
15
25 Minutes
35
45
何种原因导致不好的峰形？
以碱性物质为例
硅胶颗粒中金属离子的浓度
硅醇（羟）基与碱性物质之相互作用
混合模式保留机理：
与键合相碳链的疏水相互作用
O-Si O-Si OH O-Si O-Si OH O-Si OH O-Si O-Si O-Si OH O-Si O-Si
• 确保长期符合认证及系统适应性等要求
— 更容易符合法规要求
柱间重现性与批次间重现性的区别
• 同一批次合成的填料—色谱柱之间的重现性 – 柱床填充质量控制
• 塔板数 • 色谱峰对称性 • 反压
– 无选择性差异 • 不同批次合成的填料—色谱柱批次间重现性 – 颗粒的物理性质 – 表面之化学性质
Waters — 严格的质量控制
对HPLC色谱柱的要求
• 合适的选择性 • 良好的色谱峰形 • 宽应用范围
–分析速度 –温度范围 –pH 范围
(ln [a] amitriptyline/acenaphthene)
1.3
0.8
硅羟基活性 降低
Hypersil® BDS C18
YMC-Pack™ ODS–AQ™
Kromasil® C18
YMC-Pack™ Pro C18™
Inertsil® ODS-3
0.3
Inertsil® ODS-2 Symmetry® C18
反相色谱柱的选择 Waters Asia Ltd.
内容简介
• 合适的选择性 • 色谱峰之对称性 • 重现性
– 柱间与批次间之重现性（Column-to-Column vs. Batch-to-Batch） – Waters色谱柱质量控制（Certificate of Analysis） – Waters 方法认证包（Method Validation Kit
键合相硅胶基质填料
键合相(配体)：C18
端基封口基团
合成步骤：
残留硅羟基
1. 合成硅胶基质
2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
硅胶基质
端基封口(Endcapping)
• 在第一步主要的配体(C18)键合后，第二 步键合过程。目的是“覆盖”未反应的 硅羟基 • 使用小硅烷 (TMCS) • 降低硅羟基活性 (有利于碱性物质获得好 的峰形) • 在pH<2时，封口之短源自文库烷基水解迅速
– 定量精度、灵敏度与分辨率 – 两项改善色谱峰形的新技术
• 重现性 • 宽应用范围
对称峰形的益处
• 更准确与精确的定量结果
– 纯度分析 – 稳定性分析
• 更高的灵敏度
– 更好的检出限与定量限（LOD and LOQ） – 对低浓度杂质有更强的检测能力
• 更强的分辨能力 -更好的分辨率
– 更有利于相邻色谱峰的分离
– Characterization of Packing
• 高质量，有色谱意义测试实验
— 确保批次间重现性
小结
• 反相色谱填料的选择性与批次间重现性 与硅胶的质量及键合相的生产过程密切 相关 • 填料批次间重现性对方法长期之重复性 至关重要
2.3
µBondapak™ C18
选择性变化
Waters Spherisorb® ODS2
1.8
YMC J'sphere™ ODS–L80 Nucleosil® C18 YMC J'sphere™ ODS–M80 Hypersil® ODS YMC J'sphere™ ODS–H80 Nova-Pak® C18
Waters 21,379
由于拖尾引起的灵敏度差异
Symmetry C18
AU
他莫昔芬 0.25 g/mL
信噪比
Conventional C18
AU
11.0 6.5
5.00
10.00
Minutes
峰形对分辨率的影响
Rs = (tr Peak 2 – trPeak 1)/ 0.5 (w4.4% Peak 1 + w4.4% Peak2) Rs = (11.5-10.6)/ 0.5 (2.0 + 0.5) Rs = 0.72
注意：基线分离的分辨率 = 1.5
0
5
10 Minutes
15
20
25
何种原因导致不好的峰形？
以碱性物质为例
硅胶颗粒中金属离子的浓度
硅醇（羟）基与碱性物质之相互作用
金属离子浓度对色谱峰形的影响
Symmetry® C18 Al conc.< 10 ppm
TF USP = 1.9
Nova-Pak® C18 Amitriptyline Al conc.= ~375 ppm TF USP = 6.4
疏水性增加
1 1.5 2 2.5
-0.2 3 3.5
(ln [k] acenaphthene)
小结：
• 填料的疏水性以及残留硅羟基活性是决 定色谱柱选择性的重要因素，因此，在 选择色谱柱时应充分了解填料的性质。 • 色谱柱选择性比较表对合适色谱柱的选 择具有指导意义。
对HPLC色谱柱的要求
• 合适的选择性 良好的色谱峰形
• 高性能与宽适用范围
对HPLC色谱柱的要求
合适的选择性
– 满足不同的分离要求
• 良好的色谱峰形 • 重现性 • 宽应用范围
C18 填料的合成
传统硅胶颗粒基质
合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
Polyethoxysilane (PEOS)
Tetraethoxysilane (TEOS)
色谱峰对称性的衡量方法
•USP 拖尾因子（Tailing Factor）: (a+ b) T＝ 2a •不对称因子
a
b
峰高之5 %处
由于拖尾引起的积分误差
T = 1.58 T = 1.00 峰面积回收率 99.9 % 99.8 % 99.6 % 峰面积回收率 97.8 % 95.3 % 92.3 %
与带电硅羟基的离子交换作用
O-Si O-Si OO-Si O-Si + O- (CH ) HN 32 O-Si OO-Si O-Si O-Si OO--Si O-Si
流动相 pH < 3
+ HN (CH3 )
2
Si - OH
流动相 pH > 3
Si – O-
碱
碱
如何克服硅羟基作用？
• 七十与八十年代：
为什么这些硅胶反相C18填料如此不同？
• 色谱测试结果显示：
– 疏水性不同 – 残留硅羟基活性不同
• 为什么？
– 不同 C18配体键合水平（状况）
• 配体密度
– 不同硅胶颗粒基质
• 密度，表面积，孔径
• 纯度
2.8
色谱柱选择性比较表
Waters Spherisorb® ODS1 Resolve® C18
– 容忍碱性物质拖尾现象存在，使用流动相 改性剂改善色谱峰形
• 九十年代以后：
– 改进反相色谱填料颗粒技术，降低不尽人 意的硅羟基相互作用，内嵌极性基团技术
小结：
• 色谱峰形的好坏是准确定量的决定 因素 • 新型内嵌极性基团技术、杂化颗粒 技术能够有效地改善色谱峰峰形。 • 高纯度硅胶填料的色谱柱具有优异 的色谱峰形。
对HPLC色谱柱的要求
• 合适的选择性 • 良好的色谱峰形 重现性
– 色谱柱间重现性 – 批次间重现性
• 宽应用范围
为什么重现性如此重要？
• • • • 重现性是液相色谱分析的基本要求 缺乏重现性是用户最担心的问题 加快方法验证(Validation)的速度 更容易传递方法
– instrument-to-instrument, and lab-to-lab
5
15
25 Minutes
35
45
何种原因导致不好的峰形？
以碱性物质为例
硅胶颗粒中金属离子的浓度
硅醇（羟）基与碱性物质之相互作用
混合模式保留机理：
与键合相碳链的疏水相互作用
O-Si O-Si OH O-Si O-Si OH O-Si OH O-Si O-Si O-Si OH O-Si O-Si
• 确保长期符合认证及系统适应性等要求
— 更容易符合法规要求
柱间重现性与批次间重现性的区别
• 同一批次合成的填料—色谱柱之间的重现性 – 柱床填充质量控制
• 塔板数 • 色谱峰对称性 • 反压
– 无选择性差异 • 不同批次合成的填料—色谱柱批次间重现性 – 颗粒的物理性质 – 表面之化学性质
Waters — 严格的质量控制
对HPLC色谱柱的要求
• 合适的选择性 • 良好的色谱峰形 • 宽应用范围
–分析速度 –温度范围 –pH 范围
(ln [a] amitriptyline/acenaphthene)
1.3
0.8
硅羟基活性 降低
Hypersil® BDS C18
YMC-Pack™ ODS–AQ™
Kromasil® C18
YMC-Pack™ Pro C18™
Inertsil® ODS-3
0.3
Inertsil® ODS-2 Symmetry® C18
反相色谱柱的选择 Waters Asia Ltd.
内容简介
• 合适的选择性 • 色谱峰之对称性 • 重现性
– 柱间与批次间之重现性（Column-to-Column vs. Batch-to-Batch） – Waters色谱柱质量控制（Certificate of Analysis） – Waters 方法认证包（Method Validation Kit
键合相硅胶基质填料
键合相(配体)：C18
端基封口基团
合成步骤：
残留硅羟基
1. 合成硅胶基质
2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
硅胶基质
端基封口(Endcapping)
• 在第一步主要的配体(C18)键合后，第二 步键合过程。目的是“覆盖”未反应的 硅羟基 • 使用小硅烷 (TMCS) • 降低硅羟基活性 (有利于碱性物质获得好 的峰形) • 在pH<2时，封口之短源自文库烷基水解迅速
– 定量精度、灵敏度与分辨率 – 两项改善色谱峰形的新技术
• 重现性 • 宽应用范围
对称峰形的益处
• 更准确与精确的定量结果
– 纯度分析 – 稳定性分析
• 更高的灵敏度
– 更好的检出限与定量限（LOD and LOQ） – 对低浓度杂质有更强的检测能力
• 更强的分辨能力 -更好的分辨率
– 更有利于相邻色谱峰的分离