小鼠肾脏发生发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析(一)
两种方法检测胚胎小鼠内皮型一氧化氮合酶结果的相关性分析
白含 量进行 检 测 ， 旨在探 讨两 种 方法 检测 结果 之间 是否 有相关 性 。
两 种 方 法 检 测 胚 胎 小 鼠 内皮 型 一 氧 化 氮 合 酶 结 果 的 相 关 性 分 析
包 翠 芬 刘 霞 王 晓 梅 穆 长 征
（ 辽宁 医学 院科学 实验中心 ， 组织胚胎学教研室 ， 第一 临床学 院，锦州 １ １Ｏ ） ２ Ｏ １
（ 关键词］ 小 鼠； 肾 ； 内皮型一氧化氮合酶 ； 流式细胞仪
材料 和 方法
裂解 液 加 入 电泳 胶 样 品槽 ，１０ 电压 下 电泳 ，待 ０Ｖ 样 品 到达合 适 位置 ，停 止 电泳 ，将 胶板 取 下 ，转膜 液 洗 涤 １－０ ｎ ０３ｍｉ。将 胶 与 ０４ ／ Ｐ ＤＦ膜 （ ． ５ ｍ Ｖ ￣ 用前 置于 甲醇 内浸 透 ５ ｎ左 右 ，再 放 人转 膜 液 中至少 ｍｉ ５ ｎ ｍｉ）置 于 厚 滤 纸 （ 已用 转 膜 液 浸 泡 ） 之 间 ，赶 尽 气 泡 ，常 温 下 半 干 转 印 ，转 印完 成 后 将 Ｐ ＶＤＦ 膜用 ＴＢ Ｔ （ Ｓ１ Ｔｕｅ２ Ｓ ＴＢ －％ ｅｎ ０溶 液 ） 冲 洗 ，５ ％ 脱脂 奶 粉 溶 液 室 温封 闭 １２ 。与 一 抗 （ 抗 小 鼠 —ｈ 兔 ｅ ＮＯＳ抗 体 ，稀 释 度 为 １：４ ０ ４ 孵 育 过 夜 ， ０） ℃ ＴＢ Ｔ洗 脱 ３次 ，每次 至少 ５ ｎ 再 与 二抗 （ 性 Ｓ ｍｉ； 碱 磷 酸酶标 记 的羊 抗兔 ＩＧ 抗体 ，稀 释 度 为 １：２０ ｇ ０） 室 温 孵 育 ｌ ，ＴＢ Ｔ 溶 液 洗 脱 ３次 ，每 次 至 少 ｈ Ｓ ５ ｎ ｍｉ；ＮＢ ／ Ｃ Ｐ显色 ；扫 描 电泳 条 带 输 入 电脑 ， ＴＢＩ
内皮型一氧化氮合酶在胚胎小鼠肾脏发育中的表达
第 １ ７卷第 ２ 期 ２０ ０ ８年 ４月
中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志
ＣＨ ＩＩ Ｅ ＯＵＲＮＡＬ ＥＳ Ｊ ＯＦ 删 Ｈ ｍ Ｍ１ ＡＮＤ Ｙ
Ｖ０ ． ７ Ｎｏ ２ １１ ． ． Ａｐ ． ０ ８ ｒ２ ０
胚胎小 鼠肾脏早期发育 中的意义 。方法
新生组 （ ｏ Ｐ ）小 鼠各 １ ，共 ６组 。分别用免 疫组化及 免疫 印迹 方法 对小鼠肾脏 内 ｅ Ｏ只 ＮＯＳ 达进 行定 性 、定量分析 。结果 表 （）免疫组化结果显示 ：Ｅ ４ １ ｌ 、Ｅｌ 组 ｅ ＯＳ在生 肾区呈 阳性表 达 ；Ｅ ６组 生 肾区表达 减弱 ，肾近 端小管呈 强 阳性 表达 ， ５ Ｎ ｌ 同时远端小管及 肾脏小动脉 内皮也有 阳性表达 ；Ｅ ８组 、Ｐ ｌ ｏ组近端小管呈强 阳性表 达 ，远端 小管呈 阳性表 达 ，髓 质 中的集 合管 ｅ ＯＳ表达弱阳性 ，而致密斑呈阴性表达 。（）免疫 印迹结果显示 ：Ｅｌ 组 肾脏 ｅ ＯＳ含量较少 ，随后逐 渐增多 ，Ｐ Ｎ ２ ４ Ｎ Ｄ０ 组 ｅ Ｓ含量最多 。结论 ＮＯ （） ｅ １ ＮＯＳ在 小 鼠肾脏第 １ｄ开 始呈 阳性表 达 ，以后 含量 逐渐 升 高，出生时 含量 最 高。 （ ） ４ ２ ｅ Ｓ表达部位从生肾 区开始 ，以后其表达逐 渐减弱甚 至消失 ，而 肾近端小 管 、远 端小管 的表达 晚于生 肾区 ，且呈逐 渐增 ＮＯ
ｍａ ｕ ｕ ｅａ ６ ｔｔ ｅｓ ｍｅｔｍｅ ， ｔ ｅｅｗａ ａｎ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｉ ｈ ｉｔｌｔ ｂ ｌ ｎ ａ ｃ ｌｒａ ｌｔ ｂ ｌ ｔＥ１ ；ａ ｈ ａ ｉ ｈ ｒ ｓａｆ ｉｔｅ ｐ ｅ ｓｏ ｎ ｔ ｅｄｓａ ｕ ｕｅａ ｄ ｖ ｓｕ ａ ｎ ｔ ｅｉｌ ｅ１ ＡｔＥ１ ｈｌ ｌ ａｃ ． ８，ｅ ＯＳ ｗａ ｌａ ｌ ｘ ｒ ｓ ｅ ｎ ｐ ｏ ｉ ｌ ｎ ｉｔｌｔ ｂ ｌｓ Ａ ａ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｏ Ｎ ｓ ｃｅ ｒｙ ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｉ ｒ ｘｍａ ，ａ ｄ ｄｓａ ｕ ｕ ｅ ． ｗｅ ｋ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｆ
一氧化氮及一氧化氮合酶在慢性肾脏病中的研究进展
臧 强 张 东亮 刘文 虎 （ 首都 医科 大学 附属 北京友 谊 医院肾 内科
系。文章综述 了近 些年 来对 于一氧化 氮及一氧化 氮合酶在慢性 肾脏病 中的研 究进 一
肾脏 病 的早 期 ， 出现氧 化 应 激 ， 即 同时 随 着 肾脏 疾 病 的
氧化 应激 逐渐扩 大 。 氧化氮（ ｉｉ ｏｉ ， Ｏ 是在一氧化氮合 酶（ ｉ 进展 ， ｎ ｒ ｘ ｅＮ ） ｔｃ ｄ ｎ ． 在 Ｏ ｅ 等 的研究 中， ｂｒ ｇ 测定 ６ ０例 ３ ５期的 Ｃ Ｄ — Ｋ ｔｃ ｘ ｅ ｙｔ ｓ， Ｏ 作用下 ， ｉ ｏｄ ｓ ｈ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ Ｎ Ｓ） 由精氨酸脱氨基而产 ｃ一 生， 易通过弥散出入质膜 ， 直接进入相邻 的细胞 ， 在局部 患者氧化应激的标记物和急性期炎症 因子 （ 反应蛋 白， 白介素 一 ） 并设 置正常人为对 照组 ， ６， 通过 队列 研 发挥作用 ， 属细胞 内信使 ， 在平滑肌松弛、 感觉传人 中发 对其进行分析。同时他还对 比了氧化应激标志物及 挥作用 ， 能促使心血管扩张。Ｎ Ｓ是一种 同工酶 ， Ｏ 目前 究 ， Ｆ 所 已发现的 Ｎ Ｓ Ｏ 共有 ３种 ， 包括神 经元 型一 氧化 氮合 酶 急性炎症因子同 Ｇ Ｒ的关系。其研究发现 ， 有氧化 Ｋ （ｅｒｎｌ ｉｉ ｏｉｅｓｎｈｓ，Ｎ Ｓ 、 ｎｕｏａ ｎｔｃ ｘ ｔａｅ ｎ Ｏ ） 内皮 型 一 氧 化 氮 应激 的标志物和所有炎症 因子在 Ｃ Ｄ患者和健康人 中 ｒ ｄ ｙ 有着明显的不 同， 但是在 与 Ｇ Ｒ的关 系上并无 明显 的 Ｆ 合酶 （ｎｏ ｅａ ｎ ｒ ｘ ｅ ｙｔ ｓ，Ｎ Ｓ 以及在损伤 ｅｄｔ ｌ ｉｉ ｏｉ ｎ ａ ｅ Ｏ ） ｈ ｉ ｔｃ ｄ ｓ ｈ ｅ ｌ ｃｒ ａ ａ ｕ ｒｄ ｅｓ ｏ ｙ ｃａ ｓ ｅ 后诱导表达 的诱导型一氧化氮合酶 （ ｄｃ ｌ ｎ ｒ Ｘ 差异。伴 有冠 状 动 脉疾 病 （ ｏ ｎｒ ｖｓ ｌ ｉ ａ ， ｉ ｕｉ ｅ ｉ ｃＯ— ｎ ｂ ｔ ｉ Ｃ Ｄ 和不服用血 管紧张素 Ｉ受体拮抗剂 的患者 ， Ｖ ） Ｉ ｃ一 ｉｅｓｎｈｓ， Ｏ ） ｄ ｙｔａｅｉ Ｓ 。有 研究 表 明在 Ｃ Ｄ 的动物 模 型 以 Ｎ Ｋ Ｌ一 在伴有 Ｃ Ｄ的患者和服用 Ｖ 及病患体内 Ｎ Ｏ以及 Ｎ Ｓ Ｏ 含量减少 ， 本文就 Ｎ Ｏ及 Ｎ Ｓ 反应蛋白升高明显。Ｉ ６ Ｏ 降脂药物 的患者 中也有 明显的差异。氧化应激 的标记 在 Ｃ Ｄ中 的研 究进 展作 一综 述 。 Ｋ 物的含量在伴有糖尿病 以及高脂血症 的患者 中同服用 １ 慢 性 肾脏病 中 Ｎ Ｏ的缺 乏 降脂药物 的患者也有 明显 的差异 ， 前者表现 明显升高。 内源性 Ｎ Ｏ几乎在 每个器官 系统都起着生 理与病 这些 结果 表 明 ，Ｋ Ｃ Ｄ患者 氧化应 激 的标记 物和 急性 期炎 理作用 ， 这从 Ｎ Ｏ合成调节 的多样性 和复杂性 中， 不难 症因子明显要高于正 常对 照组 ， 但是其含 量却和 Ｇ Ｒ Ｆ 有一个准确 的理解。诸多的因素通过 Ｎ Ｓ代谢 的不同 Ｏ 关系不大。在慢性 肾脏病 的早期 ， 即出现氧化应激 ， 同 环节 ， 影响 Ｎ Ｓ的含量与活性 ， Ｏ 从而实现对 Ｎ Ｏ合成 的 时随着 肾脏疾病 的进展 ， 氧化应 激 逐渐扩 大 。 调节 。合理地使用 Ｎ Ｓ抑制剂或促进剂 ， Ｏ 可能有助于 在 Ｊｉ ｓ ａ ｍｅ 等 的研究 中 ， 观察 了肾小 球 内皮细 胞在 临床防治诸多病理过程。机体的很 多部位都可 以产生 高糖 （２ ５ｍ ｏ Ｌ ， ２ ． ｍ ｌ ） 血管紧张素 Ｉ（Ｏ～ ｏ Ｌ ， ／ Ｉ１ ７ｍ ｌ ） 游 ／ Ｎ ， Ｏ 而其所产生 的部位决定了它的生理学功能 ， Ｃ Ｄ 在 Ｋ 离脂肪酸（０ ｍ ｌＬ 培养下 ｅ Ｏ ８０ ｉ ｏ ） ￣ ／ Ｎ Ｓ和活性氧 自由基 或者 Ｅ Ｒ Ｓ Ｄ患者中， 内皮细胞功能紊乱常常出现在疾病 的关系。他们发现高糖可引起 ｅ Ｏ Ｎ Ｓ的功能异常 同时 通讯作者 ： 刘文虎 ， Ｅ—ｍ ｉ：ｌｗ ２０ ＠ｙｈｏｃ ａ ｉ ｈ ０ ２ ａｏ ．ｎ ｌ ｕ 也可以引起活化的氧 自由基升高 ， 同样的血管紧张素 Ｉ Ｉ
小鼠一氧化氮合成酶(NOS)说明书
小鼠小鼠一氧化氮合成酶一氧化氮合成酶一氧化氮合成酶(NOS)(NOS)(NOS)酶联免疫酶联免疫酶联免疫分析分析分析试剂试剂盒使用说明书盒使用说明书盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围检测范围：： 96T1µmol/L - 32µmol/L使用目的使用目的：：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中一氧化氮合成酶(NOS)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠一氧化氮合成酶(NOS)水平。
用纯化的小鼠一氧化氮合成酶(NOS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入一氧化氮合成酶(NOS)，再与HRP 标记的一氧化氮合成酶(NOS)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。
TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的一氧化氮合成酶(NOS)呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠一氧化氮合成酶(NOS)浓度。
试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml ×1瓶 7 终止液 6ml ×1瓶 2 酶标试剂 6ml ×1瓶 8 标准品（64µmol/L ） 0.5ml ×1瓶3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml ×1瓶4 样品稀释液 6ml ×1瓶 10 说明书 1份5 显色剂A 液 6ml ×1瓶 11 封板膜 2张 6显色剂B 液6ml ×1/瓶12密封袋1个标本标本要求要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP ）活性。
操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
胚胎小鼠肾脏发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析
１ 材 料 和 方 法
品孔 ，Ｏ Ｖ电压下 电泳 ， ｌＯ 待指示剂达到分离 胶时 ， 电压增 至 将
２Ｏ 直 到 指 示 剂 达 到 胶 的 底 部 。将 胶 板 取 下 ， 转 移 缓 冲 液 Ｏ Ｖ， 在
１ １ 实 验 动 物 ．
中洗涤 １ ｍｉ， ０ ｎ 将胶与 ０ ４ ／ ． ５ ｍ硝酸纤维 素膜置于滤纸 与海绵 ｚ 之间 ， 赶尽气泡 ， 常温 下 ， 半干转 印 。至转 印好 的硝 酸纤维 素 膜 ， Ｓ Ｔｒ 盐缓 冲液） ＴＢ （ ｉ ｓ 冲洗 ２ ， 脱脂奶粉溶液室温封闭 遍 ５ ４ ℃过夜 ， 分别与一抗 （ 兔抗 鼠 ｎ Ｓ多克 隆抗体 ） 稀 释度为 ＮＯ （ １ ４ ０ ，℃孵育过夜 ， Ｂ Ｔ（ Ｂ －． Ｔｗ ｅ－０溶液 ） ：０ ）４ Ｔ Ｓ Ｔ ＳＯ ５ ｅｎ２ 洗脱 ３次 ， 与二 抗一 再 ＨＲＰ标 迹 的羊 抗兔 ＩＧ 抗体 （ 释度 为 １ ｇ 稀 ： ２ ０ 室温孵育 １ ， ＴＢ Ｔ溶 液洗 脱 ３次后 与 Ｄ Ｂ试剂 显 ０） ｈ以 Ｓ Ａ 色， 扫描电泳条带 ， Ｂ ｎ ｅｄ ｒ 用 ａｄＬ ａ ｅ 软件分析 电泳条带光密度 。 １ ５ 统计学分 析 ． 应用 Ｓ Ｓ １． 统计软件包进行统计分析 ， 有数据均 以 Ｐ Ｓ １５ 所 均数 ±标准差 （ ±ｓ形式 表示 ， ｚ ） 采用 双 因素方差 分析 和 ｇ检
冷冻 待用 的左 肾组织 ， 加入 ３倍体 积 的细胞裂 解液 ， ℃下剪 Ｏ 碎、 匀浆 ， 将组织匀浆液静止 ３ ｍｉ， ０ ｎ 冷冻 离心机 （Ｏ ０ ｒｍｉ） １ ０ ０／ ｎ 离 心 １ ｍｉ， １ 上清液 ， Ｂ ａｆｒ ０ ｎ取 ５１ 用 ｒｄｏｄ法测定 蛋 白含量后 ， 分装 成每离心管中含 ｌｐ Ｏｔ 白， ｏＣ ｇ蛋 一２ ￣保存备用 。 配置 ８ Ｄ Ｓ Ｓ聚丙烯酰胺分离胶和 ５ 的浓 缩胶 ， ｌｐ 取 Ｏｔ ｇ 肾组 织蛋 白细胞 裂 解 上 清 液 ， 入 １＞ Ｄ 加 ０ １Ｓ Ｓ样 品缓 冲液 ，
神经元型一氧化氮合酶对小鼠心肌缺血后适应保护作用的影响
Ｅ Ｄ Ｐ和 一ｄ Ｐ ／ ｄ ｔ ｍ ａ ｘ降低 ； 与Ｉ Ｐ ｏ ｓ ｔ Ｃ组 比较 ， Ｉ Ｐ ｏ ｓ ｔ Ｃ＋ ７ 一 Ｎ Ｉ 组的 Ｌ Ｖ Ｄ Ｐ和 ＋ｄ Ｐ ／ ｄ ｔ ｍ ａ ｘ降低 ， Ｌ Ｖ Ｅ Ｄ Ｐ和 一ｄ Ｐ ／ ｄ ｔ ｍ ａ ｘ升高。②与 Ｌ ／
Ｒ组 比较 ， Ｉ Ｐ ｏ ｓ ｔ Ｃ组和 Ｉ ／ Ｒ＋ ７ － Ｎ Ｉ 组心肌梗死面积减小 ； 与Ｉ Ｐ ｏ ｓ ｔ Ｃ组 比较 ， Ｉ Ｐ ｏ ｓ ｔ Ｃ＋ ７ ． Ｎ Ｉ 组梗死面积增 大。③ Ｉ Ｐ ｏ ｓ ｔ Ｃ组和 Ｉ ／ Ｒ＋ ７ 一 Ｎ Ｉ 组心肌细胞损伤较轻 ； Ｉ ／ Ｒ组和 Ｉ Ｐ ｏ ｓ ｔ Ｃ＋ ７ － Ｎ Ｉ 组 心肌 细胞损 伤 明显 。 结论
用， ｎ Ｎ Ｏ Ｓ可 能参 与缺 血后 适 应 心肌 保 护 作 用 的调 节 。
缺血后适 应对 缺血再 灌注 心肌有保 护作
关键词 ： 缺血后适应 ； 缺血再灌注 ； 神经元 型一 氧化 氮合 酶 ； 心肌缺血
中图分类号 ： Ｒ ３ ６ ４ ． １ ２ 文献标志码 ： Ａ 文章 编 号 ： １ ０ ０ ７— ６ ６ １ １ （ ２ ０ １ ０பைடு நூலகம்） ０ １— ０ Ｏ Ｏ ４— ０ ４
ｎ Ｎ Ｏ Ｓ 抑 制 剂 ７一 硝基 吲唑（ Ｉ ／ Ｒ＋ ７ ・ Ｎ Ｉ ） 组、 缺血后适应 （ Ｉ Ｐ ｏ ｓ ｔ Ｃ ） 组和缺血后适应 ＋ ７ 一 Ｎ Ｉ （ Ｉ Ｐ ｏ ｓ ｔ Ｃ＋７ 一 Ｎ Ｉ ） 组 。 每组 小 鼠 心 脏 离 体
连接到 Ｌ ａ ｎ ｇ ｅ ｎ ｄ ｏ ｒ ｆ灌注系统进行逆行灌 注 ， 建立缺血再灌注模型 ， 并 测定 血流动力学指标 和心肌梗死 面积 ， Ｈ Ｅ染 色观察心肌 细胞结构 。 结果 ①与 Ｉ ／ Ｒ组 比较 ， Ｉ Ｐ ｏ ｓ ｔ Ｃ组 的 Ｌ Ｖ Ｄ Ｐ和 ＋ ｄ Ｐ ／ ｄ ｔ ｍ ａ ｘ升高 ， Ｌ Ｖ Ｅ Ｄ Ｐ和 一ｄ Ｐ ／ ｄ ｔ ｍ ａ ｘ降低 ； Ｉ ／ Ｒ＋ ７ 一 Ｎ Ｉ 组的 Ｌ Ｖ —
小鼠肾脏发育中iNOS及iNOSmRNA的表达
临 床
研
究
ＣＩ ０Ｅ Ｎ Ｅｌ Ｌ Ｈ Ａ Ｒｌ Ｄ Ａ ＮＦ Ｇ Ｍ ｃ
匿固
小 鼠肾脏 发育 中 ｉ ＮＯＳ及 ｉ ＮＯＳ ｍＲＮＡ 的表达 ①
史慧 穆长 征
（ 宁 医学院组胚 教研 室锦 州 １１Ｑ ） １ ２０
义。
２ 结果 ２ １ ｉ Ｏ ｍＲ ． Ｎ Ｓ ＮＡ在 肾组织 中的分 布
电泳 条 带 吸 光 度 。
ｌｌ
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组别
图 １ 小鼠不 同发 育阶段肾脏 总 ｉＯ Ｎ Ｓ光密度百分数直条 图
（） ３统计 学分析 ： ￣ Ｐ Ｓ ．软件 ， 采ＪＳ Ｓ １ ０ １ 采用单 因素方 差分析和 重复 测量设 计 的方 差分析 进行 统计 学分析 。以 Ｐ ０ ０ 为 差异 有显 著意 ＜ ．５
【 献标 识码 】Ａ 文
【 文章 编 号 】１ ７ － ７ ２２ ０ ） ５ｂ－０ １－０ ６ ４ ０ ４ （ ０ ８０ （） ０ ２ ９
化
ｉ Ｏ 广 泛存 在干 人类 的各种 组织 中包括 成人 和胎 儿的 肾脏 中 。 Ｎ Ｓ
ｉ Ｓ分 布于 正常 肾 叶间动 脉 ， ＮＯ 弓形动脉 ， 肾小球 ， 肾小 管一 些段 落 。
ｃＡ 一 １０ 细胞 图像分 析仪 分析 。 ｌ ｓ ００ 结果 原位杂 交结果 显示 ： Ｏ ｍ Ｎ 产 生于胚 胎 １ｄ 分布在 输尿 管 芽； 胎 １ｄ ｉ ＳＲ Ａ Ｎ ４， 胚 ６ 至成 年ｉ Ｏｍ Ｎ ＮＳＲＡ 主要 分 布在近 曲小 管 ， 而远 曲小管表达较 少。各组 ｉ Ｏ ｍ Ｎ Ｎ Ｓ Ｒ Ａ呈持 续表达 ， 无明显 差异 。Ｗ ｓ ｒ － ｌ 结果 显示 ： Ｏ 的光密度 百分数 ｅｔ ｎ ｂ ｔ ｅ ｏ ｉ Ｓ Ｎ 在 胚胎 １ｄ 最 高， ４组 随肾脏 发育ｉ Ｏ含 量逐 渐减 少 ， 组 差异有 显著性 。结论 ＮＳ 各
检测一氧化氮的荧光探针研究进展
第49卷第7期2021年4月广州化工Guangzhou Chemical IndustryVol.49No.7Apr.2021检测一氧化氮的荧光探针研究进展吴志文，张振涛(内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特010110)摘要：一氧化氮(NO)在许多生理病理过程中起着至关重要的作用，在各种分析NO方法中，基于荧光探针的图像技术由于其高灵敏度，无创性和可视化的独特优势被认为是理想的检测方法。
本文对邻苯二胺、芳香仲胺、二氢毗睫等有机物NO荧光探针和铜(II)、铁(III)的金属络合物的NO荧光探针，在合成设计、灵敏度、选择性及在体内外实时定量检测外源性和内源性NO 的应用，进行了综述介绍。
关键词：一氧化氮；荧光探针；有机物；金属络合物中图分类号：R914.5文献标志码：A文章编号：1001-9677(2021)07-0017-05 Research Progress on Fluorescent Probes for Detection of NOWU Zhi-wen,ZHANG Zhen-tao(Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Hohhot010110,China)Abstract:Nitric oxide(NO)plays a crucial role in many physiopathological processes,and among the various methods for NO analysis,the image technique based on fluorescent probes is considered ideal due to its unique advantages of high sensitivity,noninvasivenessand visualization.The application of NO fluorescent probes for organic NO such as o-phenylenediamine,aromatic secondary amines,and dihydropyridine and NO fluorescent probes for metal complexes of copper(II)and iridium(III)in terms of synthetic design,sensitivity,selectivity,and real-time quantitative detection of exogenous and endogenous NO in vitro and in vivo were reviewed.Key words：NO；fluorescent probes；organic matter；metal complexes一氧化氮(NO)是一种重要的气体分子，是通过三种不同的一氧化氮合酶(内皮型一氧化氮合酶eNOS；神经元一氧化氮合酶nNOS；诱导型一氧化氮合酶iNOS)将L-精氨酸转化为瓜氨酸而产生的⑴。
一氧化氮合酶的结构与功能研究及其临床应用
一氧化氮合酶的结构与功能研究及其临床应用一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是一种广泛存在于生物体内的气体分子，它可以通过一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）的催化作用而产生。
NOS是一种含有赖氨酸二肽基（L-arginine）结构域的酶，可以将L-arginine和氧气通过多步反应转化成NO。
NOS作为一种重要的调节因子，参与了许多不同类型的生理和病理过程。
因此，对于了解NOS的结构与功能研究，以及在临床上的应用具有重要的意义。
一氧化氮合酶的结构与功能研究NOS是一种组成蛋白质复合物的酶，在哺乳动物中包括三种亚型：内源性神经型NOS（nNOS）、内源性内皮型NOS（eNOS）和外源性诱导型NOS（iNOS）。
nNOS主要存在于神经系统中，eNOS主要存在于内皮细胞中，iNOS是由细胞因子诱导而发生表达的酶。
这三种亚型的结构存在差异，但其催化界面和催化机制基本相同。
NOS的结构一般存在于C型柿蒂纳（Cys-Tyr-Ile-Asn-Val-Asp）结构域中，这个结构域由一个赖氨酸加上一个α-氨基酸序列以及红色的半胱氨酸组成。
NOS的活性中心位于这个C型柿蒂纳结构域上，这个活性中心与NADPH和FAD相关。
NADPH提供一些阴离子带负电荷，从而促成了NOS催化反应的进行。
FAD和赖氨酸谷氨酰酶一起工作，促进了L-arginine加氧生成NO的反应。
同时，在NOS的多亚基复合物结构中，NOS也通过亚基之间的物理交互和电子传递来进行调控和发挥其催化作用。
除了开展NOS的分子间相互作用和调控相关的研究外，研究人员也对NOS和NO的在生理和病理过程中的作用展开了广泛的研究。
例如，在神经系统方面，nNOS通过调节进一步与电生理过程和神经显现过程相关的蛋白质的表达而发挥作用。
在心血管系统方面，eNOS的催化产物NO可直接作用于血管内皮细胞，导致正常的血管舒张，扩张血管，提高血流动力学，同时可抑制血管收缩因素，从而起到对心血管疾病的治疗作用。
一氧化氮合酶阳性神经元在小鼠脑内的分布
性 神 经 元 在 小 鼠脑 内 的 分 布 和 形 态 结 果 ： 大 脑 皮 质 、 状 体 、 底 前 脑 、 仁 核 、 丘 脑 和 脑 干 等 处 有 较 多 一氧 在 纹 基 杏 下
化 氮合 酶 阳性 神 经元 的分 布 。结 论 ： 明 ＮＯ 中枢 神 经 系统 的诸 多 功能 有 关 。 表 关键词 脑 ； 经 元 ； 织 化学 ； 鼠 神 组 小
６７０ ３０７ 第三 军 医大 学 组 织 学 与胚 胎 学 教 研 室 ）
（ 川 北 医 学 院 解 剖 学 教 研 室 ， 充 南
摘 要 目的 ： 究一 氧化 氨 合酶 （ －ｓ） 小 鼠脑 内 的分 布 ：方法 ： ＮＡ Ｈ－ 研 ｒｏ 在 ， 用 ＤＰ 黄递 酶 组织 化 学技 术 ， 察 了 ＮＯＳ阳 观
维普资讯
ＣＨＩ ＥＳ Ｊ Ｎ Ｅ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＡＮＡＴＯＭＹ Ｖｄ． ５Ｎｏ １２ ０ ２ ． ０ ２
解剖 学 杂 志
２０ ０ ２年 ２ ５卷 １期
一
氧 化 氮 合 酶 阳 性 神 经 元 在 小 鼠 脑 内 的 分 布
谢 兴国 蔡 文琴 张 吉 强 李 成 仁
ｓｔａｔ ，ｏ ｅ ｒｉ ａ ａｉ，ｍ ｙ ｄ ｌ ｕ ｌｉ ｈ ｐ ｔ ａａ ｕ ｎ ｒｉ ｔｍ ． ｎ ｌｓｏ Ｔｈ ｄ ｉｔｉｕｉ ｎ ｏ ｔ ｔｍ￣ ｆ ｒｂ ａｎｂ ｓ ｌ ａ ｇ ａａ ｎ ｃｅ， ｙ ｏ ｈ ｍ ￣ ａ ｄ ｂ ａｎ ｓｅ Ｃｏ ｃｕ ｉｎ： ｅ ｉ ｓ ｌ ｓ ｅｄｓｒｂ ｔ ｆ ｏ ｃ ｔ ａ ａｔ ｈ ｔＮＯ ａ ｅｉ ｖ ｌｅ ｎ ｍａ ｙ ｂ ａｎ ｆ ｎ ｅｏｋ． ｍ ｙ ｈ ｎ ｏｖ ｉ ｎ ｒｉ ｕ ｃ ｒ ｄ ｉ ， Ｋｅ ｒ ｓ ｂｒｉ ； ｅ ｍ ｎ ｈｓｏ ｈ ｍ ｉ ｒ ｍｏ ｓ ｙ ｗｏ ｄ ａｎ ｎ ｕ ｓ ｉｔｃ ｅ ｓ ｙ； ｕｅ ａ ｔ ］ ｉｄ Ｓ ｉ ｎ
胚胎小鼠肾脏发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析
胚胎小鼠肾脏发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析【摘要】目的：探讨神经型一氧化氮合酶在胚胎小鼠妊娠不同时期肾脏发育中的意义。
方法：选用成年健康昆明小白鼠，按雌雄比例3：1同窝饲养，采用检查阴道栓脱落的方法确定雌鼠受孕时间。
选取胚龄12天(ED12)、14天(ED14)、16天(ED16)、18天(ED18)的胎鼠及出生时(PD0)仔鼠，分5组，每组各6只母鼠，每只母鼠取2只胎鼠或仔鼠，剖腹取肾脏，用免疫印迹技术（Western blot ）及光密度分析系统分别对各组胎鼠或仔鼠肾脏内nNOS进行定量检测。
结果： Western blot及光密度分析显示， ED14组肾脏nNOS含量最少，随后逐渐增多，PD0组肾脏nNOS含量最多。
结论：胚胎小鼠肾脏nNOS在胚胎第14天开始呈阳性表达，以后含量逐渐升高，出生时含量最高，表明nNOS在胚胎小鼠肾脏发育的早期阶段起重要作用。
【关键词】神经型一氧化氮合酶；胚胎小鼠；肾脏一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase， NOS）是一氧化氮（NO）合成的限速酶，是调节NO的重要环节。
NO通过NOS产生，是一种可作为信使分子的自由基气体［1］，可激活可溶性鸟苷酸环化酶，通过生成cGMP而发挥作用。
NOS可分为内皮型（endothelial NOS，eNOS）、神经型（neuronal NOS， nNOS）和诱导型（inducible NOS，iNOS）3类。
NO在肾脏血流动力学和肾脏多种生理功能中的作用决定NOS的活性改变，NO可通过调节肾小球毛细血管压和管球反馈来调节肾血流量，是有效调节肾脏的血液动力学的舒张因子，能对抗缩血管物质，参与调节血管张力。
尽管国内外学者对成年肾脏NOS的表达进行大量的研究，但nNOS在胚胎肾发育过程中动态表达尚未见报道。
本实验通过观察妊娠不同时期胚胎小鼠肾脏nNOS的表达，旨在探讨nNOS在胚胎小鼠肾脏早期发育中的意义。
1 材料和方法1.1 实验动物昆明小白鼠，由辽宁医学院实验动物中心提供。
代谢重编程对巨噬细胞的可塑性和功能的影响
代谢重编程对巨噬细胞的可塑性和功能的影响杨雪; 杨勇【期刊名称】《《药学研究》》【年(卷),期】2019(038)008【总页数】5页(P481-485)【关键词】巨噬细胞; 炎症; 葡萄糖/代谢; 有氧糖酵解【作者】杨雪; 杨勇【作者单位】[1]中国药科大学药物科学研究院江苏南京211100【正文语种】中文【中图分类】R329.25细胞代谢重编程的概念最早起源于癌细胞中的Warburg效应。
在有氧气的条件下，线粒体呼吸作用被抑制，糖酵解途径增加并且乳酸产生增加的代谢方式最早由诺贝尔奖得主Otto Warburg发现，所以被称为“Warburg效应”或“沃伯格新陈代谢”[1]。
糖酵解途径首先将葡萄糖代谢为丙酮酸，丙酮酸在线粒体中进一步代谢为二氧化碳、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)。
还原当量(NADH和FADH2)驱动氧化磷酸化(OXPHOS)以获得更多的ATP合成。
而Warburg效应发现，即使在有氧条件下，癌组织也利用比正常组织十倍以上的葡萄糖来产生乳酸。
细胞内的乳酸分泌增加了NAD+的产生促使葡萄糖连续摄入细胞并且由此产生的糖酵解中间体的积累促进了细胞的生物物质的快速合成。
自从Warburg效应被发现和定义以来，这种效应一直被认为仅在癌细胞中发生。
像Warburg效应这种，细胞脱离了正常的代谢通路，产生异常量的代谢中间体和代谢物甚至产生新的代谢产物，这种细胞过程即为代谢重编程。
然而，最近的研究结果表明，类似Warburg效应的代谢重编程也存在于快速增殖的其他细胞中，包括各种类型的免疫细胞，最明显的是在巨噬细胞和T细胞中，并决定免疫细胞亚群在例如炎症性疾病和癌症等疾病状况中的功能。
巨噬细胞是机体内固有免疫晚期应答的主要效应细胞，同时，在适应性免疫的抗原提呈中也发挥着作用。
巨噬细胞来源于骨髓干细胞，以单核细胞为前体，后在定居组织中发育为成熟巨噬细胞。
成熟巨噬细胞在生物学特征方面具有极大的可塑性，不同微环境可激活其分化为不同功能亚群，成为活化巨噬细胞。
一氧化氮合酶在大鼠肾脏不同部位的表达及意义
小球 和 出入球 动 脉 中。本 实验 的 结果 表 明 ， 近端 肾 在 小管、 升支 粗 段 和皮 质 中、 收集 管 偶有 表 达 。 髓 本 研 究 应 用 ＮＯＳ 、 ＮＯＳ 和 ＮＯＳ 三 种 特 异 性 ｓ 抗 体研 究 了 ＮＯＳ各 亚 型 （ ＮＯＳ ｅ ｂ 、ＮＯＳ ｉ 、ＮＯＳ 在 肾 ）
布作 一 研 究 ， 探 讨 其 参 与 肾 血 管 张 力及 血 压 调 节 并 的机制 。
１ ．资 料与 方 法
致 肾血 管 收 缩 ， 减低 ＧＦ 在 分 离 的人 球 小动 脉 上 的 Ｒ。 研 究 表 明 Ｌ— ＮＭＡ 能 降 低 动 脉 直 径 ， 强 血 管 紧 张 增
素 Ⅱ的 收 缩 作 用 。还 有 报 道 认 为 ＮＯ 能 抑制 肾 素 释 放 。应 用 免 疫 组织 化 学方 法 研究 发 现 ，ＮＯＳ存 在 于 ｂ 球 旁 斑 中 ，然 而 应 用 ＲＴ— Ｃ 方 法 表 明 ＰＲ ｂ ＮＯＳ ｍＲＮＡ 亦 存 在 于大 鼠肾脏 微 管部 分 ， 内髓 收 在
４ ０ Ｆ ＡＳ， 速取 出 肾脏 置 Ｆ ＡＳ中 固定 ４ Ｐ Ｓ ０ ｍｌ Ｐ 快 Ｐ ｈ； Ｂ
集 管有 高 水 平 ｂ ＮＯＳｍＲ ＮＡ 表 达 。其 余在 内髓 收集
管、 内髓 粗 上 升 支 、 肾小 球 和 血 管 均 有 表 达 。但 在 近
肾 小球 旁 细 胞 未发 现 ｂ ＮＯＳｍＲＮＡ。 与之 相 反 ， 位 原 杂交研 究发 现 ｂ ＮＯＳ ｍＲＮＡ 仅 存 在 于 球 旁 斑 细 胞
１ １ 实 验 动 物 雌 性 Ｓ 大 鼠 ７只 ， 洁 级 ， 重 ． Ｄ 清 体 ２ ０ ３ ０ 。购 自中国 医学科 学 院 动物 繁 殖 中 心 。 ２￣ ０ｇ １２ 实验方法 ． 在戊 巴 比 妥 钠 （ ０ ５ ｍｇ・ ｇ 麻 醉 下 ｋ） 开胸 ， 经左 心室插管 至升主动脉 ， 开右 心室 ， 后 剪 快 速 灌 流 １ ０ Ｐ Ｓ（ ． Ｍ ， Ｈ７ ４ ５ ｍｌ Ｂ ０ １ ｐ ． ）后 ， 慢 灌 流 缓
神经型一氧化氮合酶在生后小鼠肾脏发育中的表达
生小 鼠生 肾区 ｎ ＮＯＳ呈强 阳性表达 ，肾小管也有表达 ；成年小 鼠 肾远 端小管 ，特别是 致密斑 ，ｎ ＮＯ Ｓ呈 强 阳性表达 ，集合 新生小 鼠与
成年小 鼠肾脏 ｎ ＮＯＳ表达部位不 同，且表达含量 由新 生时最高到成年 时降至最 低。 ［ 关键词］ 神经型一 氧化 氮合酶 ； 小 鼠； 肾
神 经 型 一 氧化 氮 合 酶在 生 后 小 鼠 肾脏 发 育 中 的表 达
刘 霞 王 晓梅 包 翠芬 穆长征
（ 锦 州医学院组胚教研室 ； 附属第一 医院 ； 科学实验 中心 ，锦州 １ ２ １ Ｏ Ｏ １ ） （ 摘 要］ 目的 观察生后小 鼠肾脏发育不 同 阶段神经 型一 氧化氮 合酶 （ ｎ ＮＯＳ ） 的表 达 ，以及新 生小 鼠与成年小 鼠
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第 １ ６ 卷 第 ２期 ２ ０ ０ ７年 ４月
中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志
ＣＨＩ ＮＥＳ Ｅ Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ
Ｙ ＡＮＤ ＣＹＴ０ＣＨＥＭ Ｉ ＳＴＲＹ
Ｖｏ １ ． １ ６ ． ＮＯ ． ２
Ａｐｒ ．２ ００ ７ ห้องสมุดไป่ตู้
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ｋ ｉ ｄ ｎ ｅ ｙ，ｃ ｏ ｍｐ ａ ｒ ｅ ｎ ＮＯＳ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｎ ｅ ｗｂ ｏ ｒ ｎ ａ ｎ ｄ ａ ｄ ｕ ｌ ｔ ｍｉ ｃ ｅ ，ａ ｎ ｄ ｄ ｉ ｓ ｃ ｕ ｓ ｓ ｔ ｈ ｅ ｒ ｏ ｌ ｅ ｏ ｆ ｎ ＮＯＳ ｉ ｎ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ｉ ｎ ｇ ｍｏ ｕ ｓ ｅ ｋ ｉ ｄ ｎ ｅ ｙ ．Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｋｕ ｎ — Ｍｉ ｎ ｇ ｍｉ ｃ ｅ ｗｅ ｒ ｅ ｄ ｉ ｖ ｉ ｄ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ６ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ ｓ ｏ ｆ ８ ｍｉ ｃ ｅ ｅ ａ ｃ ｈ：ｎ ｅ ｗｂ ｏ ｒ ｎ ａ ｎ ｄ ３， ５， ７ ， １ ４ ａ ｎ ｄ ４ ０ ｄ ａ ｙ ｓ ．Ｉ ｎ ｔ ｒ ａ ｒ ｅ ｎ ａ ｌ ｎ ＮＯＳ ｌ ｏ ｃ ａ ｌ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗａ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｉ ｍｍ ｕ ｎ ｏ ｈ ｉ ｓ ｔ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｓ ｔ ｒ ｙ。 ａ ｎ ｄ ｒ ｅ ｎ ａ ｌ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ
大鼠生后肾内皮型一氧化氮合酶的定量分析
大鼠生后肾内皮型一氧化氮合酶的定量分析穆长征;张晓明;包翠芬;陶仕英;王晓梅【期刊名称】《数理医药学杂志》【年(卷),期】2005(018)004【摘要】为探讨内皮型一氧化氮合酶在大鼠生后肾发育中的作用,采用SD大鼠按生后年龄随机分为6组,即新生组、生后3天组、5天组、7天组、14天组和成年组,用免疫印记技术和光密度分析法对各组大鼠生后肾内皮型一氧化氮合酶进行定量检测,以测得的一氧化氮合酶最大量为1(100%),计算蛋白相对含量,SPSS10.0统计软件包统计分析.结果显示,新生组酶含量最高为1,随年龄增长酶含量逐渐减少,至第7天达到最少为44.60±2.41%,以后又增高至14天达成年水平为71.55±4.35%.提示大鼠生后不同年龄组肾内皮型一氧化氮合酶有明显的变化规律,NO可能在肾脏的成熟与发育中起重要作用.【总页数】2页(P321-322)【作者】穆长征;张晓明;包翠芬;陶仕英;王晓梅【作者单位】锦州医学院组织胚胎学教研室,锦州,121001;锦州医学院组织胚胎学教研室,锦州,121001;锦州医学院科学实验中心;锦州医学院组织胚胎学教研室,锦州,121001;锦州医学院附属第一医院【正文语种】中文【中图分类】R322.6+1【相关文献】1.姜黄素对急性肺损伤大鼠肺组织诱导型一氧化氮合酶和内皮型一氧化氮合酶表达的影响 [J], 解东兴;史妍;李萍;刘伟;李莉;凌腾涛2.内皮型一氧化氮合酶和神经型一氧化氮合酶在胚胎小鼠肾发育过程中的表达 [J], 穆长征;王小梅;刘霞;包翠芬;王雅光3.生后不同发育阶段大鼠卵巢内诱导型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的表达[J], 屈丽华;屈姣华;龙治峰;石金凤;莫中成;罗红梅;李美香4.后适应对大鼠脑缺血神经细胞凋亡和内皮型一氧化氮合酶与诱导型一氧化氮合酶的影响 [J], 方芳;王婉灵;余术宜;张辉;谢立新;方云祥5.内皮型一氧化氮合酶基因体内转染对大鼠颈总动脉损伤后血管狭窄程度的影响[J], 盛净;蔡文玮;王士强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一氧化氮合酶在小鼠脑内的表达
一氧化氮合酶在小鼠脑内的表达
谢兴国;朱晓华;李双飞;蔡文琴
【期刊名称】《川北医学院学报》
【年(卷),期】2001(016)003
【摘要】目的:研究一氧化氮合酶(NOS1)在小鼠脑内的表达.方法:采用免疫组织化学技术,观察了一氧化氮合酶在正常小鼠脑内的表达.结果:NOS1阳性神经元分布于中枢神经系统的广泛区域,包括大脑皮质、海马、齿状回、间脑和脑干.结论:表明NO与中枢神经系统的诸多功能有关.
【总页数】3页(P6-8)
【作者】谢兴国;朱晓华;李双飞;蔡文琴
【作者单位】川北医学院解剖学教研室;川北医学院解剖学教研室;顺庆区环保局;第三军医大学组织胚胎学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】Q559
【相关文献】
1.小鼠脑内不同脑区中一氧化氮合酶免疫阳性神经元的分布、形态特征和起源 [J], 黄增金;刘芳
2.单纯疱疹病毒性脑炎小鼠脑内诱导型一氧化氮合酶的表达 [J], 左联;谢鹏;赵高年;李勇;徐平;邹德智;魏有东
3.复方戒毒肽对吗啡成瘾小鼠脑内N-甲基-D-天门冬氨酸受体1和一氧化氮合酶表达水平的影响 [J], 安玉会;杨松华;马红霞;毛红丽;郭茂锋;李萍
4.一氧化氮合酶在小鼠脑内的表达 [J], 谢兴国;朱晓华;张吉强;蔡文琴
5.中药补髓健脑方对帕金森小鼠脑内神经型一氧化氮合酶的影响 [J], 惠凯;程为平;马莉;张洋
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小鼠肾脏发生发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析(一)
作者：刘霞包翠芬张晓明穆长征
【摘要】目的：对生后小鼠肾脏发生发育不同阶段中神经型一氧化氮合酶（nNOS)的表达进行定量分析，探讨nNOS在小鼠生后肾脏发育中的意义。
方法：分别取新生（出生小于2h）、生后3、5、7、14、40天昆明小鼠各8只，共6组,用免疫印迹技术和光密度分析方法对各组小鼠生后肾神经型一氧化氮合酶进行定量检测，以测得的一氧化氮合酶最大量为1(100%),计算蛋白相对含量，SPSS10.0统计软件包统计分析。
结果：新生组酶含量最高为100%,随年龄增长酶含量逐渐减少，至成年达到最低水平为44.8±2.4%。
结论：这一趋势表明nNOS可能在小鼠生后肾脏发育的早期阶段起重要调节作用。
【关键词】小鼠;肾;神经型一氧化氮合酶
一氧化氮（NO）作为体内重要的信使分子和效应分子，在调节肾脏血流动力学方面具有重要的作用。
肾脏中的NO主要由一氧化氮合酶（NOS）催化产生。
NOS有三个亚型，即神经型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)〔1〕。
目前对肾发生发育过程中NO和NOS的研究还刚刚起步,本实验通过定量方法检测生后小鼠的发生发育不同阶段nNOS的含量，旨在探讨nNOS在小鼠肾脏发生发育中的意义。
1材料和方法
1.1实验动物与分组
成年健康昆明小鼠（辽宁医学院实验动物中心提供）。
根据小鼠孕程确认仔鼠出生时间,取新生（小于2h）、3、5、7、14、40天小鼠各8只，共6组。
1.2主要试剂
nNOS兔抗鼠多克隆抗体（北京中杉公司）；细胞裂解液、丙稀酰胺、N，亚甲基双丙稀酰胺、甘氨酸、Tween20、、Trisbase、SDS和PVDF膜（SIGMA公司）。
1.3Westernblot步骤
各组小鼠麻醉后剖腹取右肾,PBS冲洗,迅速置于液氮冷冻,-70℃冰箱保存。
取冷冻肾组织,加入3倍体积的细胞裂解液,0℃下剪碎、匀浆,将组织匀浆液静置30min,4℃,12000rpm离心10min,留取上清液。
用Bradford 法测定蛋白含量,分装成每离心管中含10μg蛋白,-20℃冰箱保存。
配制10%分离胶和5%浓缩胶,取10μg(30μl)肾组织蛋白细胞裂解上清液,加入10μlSDS样品缓冲液,100℃加热3min,离心。
取上述裂解液加入电泳胶样品槽,100V电压下电泳,待样品到达合适位置,停止电泳，将胶板取下,转膜液洗涤10～30min。
将胶与0.45μmPVDF膜(用前置于甲醇内浸透5min左右，再放入转膜液中至少5min)置于厚滤纸(已用转膜液浸泡)之间,赶尽气泡,常温下半干转印,转印完成后将PVDF膜用
溶液)冲洗,5%脱脂奶粉溶液室温封闭1～2h。
与一抗(兔抗小鼠nNOS抗体,稀释度为1∶400)4℃孵育过夜,TBST洗脱3次,每次至少5min；再与二抗(碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体,稀释
度为1∶200)室温孵育1h,TBST溶液洗脱3次,每次至少5min；NBT/BCIP 显色；扫描电泳条带,输入电脑,用光密度分析软件分析电泳条带光密度。
1.4统计学分析
SPSS10.0统计软件包统计分析，组间比较采用q检验，以P0.05为有统计学意义，P0.01为有明显统计学意义。
2结果
生后小鼠肾脏发生发育不同阶段nNOS含量分析Westernblot电泳条带图显示新生小鼠nNOS含量最高，随着肾脏发生发育逐渐降低，到成年降低至最低水平。
光密度分析显示：以测得的nNOS最大量为1,计算各组nNOS表达相对含量（百分数）。
新生小鼠nNOS含量最高（100%），出生后3天降低，生后5天进一步降低，到成年降至最低水平。
见表1。