肿瘤细胞培养方法和培养基

肝癌細胞培養一、培養基

1、RPMI-1640+ 10%

胎牛血清培養基

2、DMEM+ 15%胎牛血清培養基

成分表

GAGGAGAGGAFFFFAFAF

二、實驗前準備工作:

GAGGAGAGGAFFFFAFAF

操作者的皮膚、培養瓶的蓋和外壁常用酒精消毒。用紫外線

消毒實驗室空氣、工作臺面和一些不能使用其他方法消毒的培養器皿。進無菌室前或做完實驗后，均應開燈照射30min 進行消毒。紫外線照射60min可以消滅空氣中大部分細菌。

1、玻璃器皿的清洗滅菌（5％鹽酸溶液、重鉻酸鉀120ml、硫酸200ml、蒸餾水200ml）：

（1）浸泡:新使用或重復使用的玻璃器皿須經5％鹽酸溶液或自來水浸泡過夜或煮沸30min，水洗。以去除新購進玻璃器皿所帶有灰塵、鉛、砷等物質，并消除其弱堿性。

（2）刷洗:浸泡后用軟毛刷和優質的洗潔精進行刷洗。刷洗后經行烘干。

（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前須適當晾干或烘干，以免造成酸浸液稀釋，影響效果。將玻璃制品完全浸泡入清潔液中24h。清潔液具有極強酸蝕作用，操作過程需戴防護用具。

（4）沖洗、烘干備用:浸酸后的玻璃器皿先用自來水充分沖洗，吸管需沖洗10min，器皿需每瓶灌滿自來水、倒掉反復

10次以上，不留任何酸浸液殘跡，然后用蒸餾水漂洗2～3

GAGGAGAGGAFFFFAFAF

次，將清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干凈透明，無油煙，不能殘留任何有害物質及化學藥品等。

（5）包裝滅菌:器材經清洗烤干或晾干后，先應嚴格包裝，然后再行消毒滅菌處理，以防止消毒滅菌后再次遭受污染。包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。

2、橡膠制品清洗消毒：

0.5mol/L NaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用

3、塑料制品的清洗消毒（瓶蓋、離心管）：

使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時，晾干備用。

三、細胞復蘇：

凍存細胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必

GAGGAGAGGAFFFFAFAF

須快速冷凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，致使細胞死亡。在凍存細胞的保存管中含有對細胞有毒害的成分DMSO,故在解凍應馬上將其去除。在冷凍活化前應在無菌臺上將細胞培養液配好，然后將保存管從液氮中取出，放于37℃的溫水中快速使細胞解凍。解凍后懸液快速移入培養液中混勻，離心去掉上清液，再加入細胞培養液。

實驗人員穿上無菌實驗室操作服用酒精噴于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭實驗臺

（1）取一15ml離心管用滴管在其內滴加5--9ml培養液（取8ml）。

（2）從液氮罐中取出凍存管，并迅速放入37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內完成。

（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液轉移入上述離心管中（用培養基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細胞都洗下來）。

（4）低速離心(1000r／min) 5min，去上清后再用8ml培養液再清洗離心一次。

（5）離心后倒掉上清液，在離心管中滴加3ml培養液

GAGGAGAGGAFFFFAFAF

（RPMI-1640），混勻（可用滴管輕柔吹打）。

（6）將離心管中的混合液轉移到培養瓶中，并在培養瓶中滴加15滴10%小牛血清，蓋上瓶蓋，標好細胞種類和日期、培養人姓名等，將培養瓶平放，置于37°C培養箱中培養。2-3天換一次培養基。

四、細胞傳代：

當觀察到培養瓶中細胞鋪滿度為90%時（細胞生長處于對數期時），解凍復活成功后的細胞要進行分離培養，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養障礙，影響細胞生長。細胞由原培養瓶內分離稀釋后傳到新的培養瓶中培養的過

程稱之為傳代培養。傳代細胞細胞株的最大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于實驗。

（1）試驗臺的消毒工作準備好，棄去舊培養液，用PBS液（不含鈣，鎂離子）洗1-2次，以免剩余培養液影響胰蛋白酶活性。（細胞貼壁生長）。

（2）向瓶內加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，1--3min后

把培養瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發現胞質回縮、細

GAGGAGAGGAFFFFAFAF

胞間隙增大后，應立即中止消化（將培養瓶翻轉過來，以保證細胞沒有脫壁）。

備注：若細胞沒有脫壁，生長良好，則直接倒掉消化液，加培養液8ml，離心收集細胞；若發現很多細胞已解離已脫壁（即解離過度），則直接加培養液進行離心收集細胞。

（4）倒出消化液，向瓶內用滴管加入培養液少量（約2ml），輕輕轉動培養瓶，把殘留胰蛋白液消化液沖掉，然后再加3ml 培養液+15滴小牛血清。

（5）使用吸管，吸取瓶內培養液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。

（6）將準備好的細胞懸液轉入離心管中，離心(1000r／min) 5min。

（7）將離心后離心管中液體倒掉，在離心管中加入3ml培養液，并反復吹打細胞，制成細胞懸液。

（8）取3個無菌培養瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精燈下過火消毒。

（9）在培養瓶中各加入1ml細胞懸液、2ml培養液（用移液

GAGGAGAGGAFFFFAFAF

槍）、15滴小牛血清，加好后酒精燈下過火加塞。

（10）細胞培養換液時間應根據細胞生長的狀態和實驗要求來確定。一般2～3d后應換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續傳代擴大培養或換成維持液。五、細胞凍存：

細胞的凍存最常用的方法是液氮冷凍保存法，主要是加入適量的保護劑緩慢的冷凍細胞。由于細胞在不加任何保護劑的情況下，細胞內外水分會很快結成冰晶，從而引起一系列不良反應。如細胞脫水使局部電解質濃度升高，PH值改變，部分蛋白質因此變性使細胞內部結構紊亂，溶酶體膜被破壞而放出大量酶將細胞內部結構破壞。因此在細胞凍存時的關鍵是盡可能減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成，故凍存時采用甘油或DMSO做保護劑，這兩種物質分子量較小，溶解度大，易穿透細胞，可使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，對細胞毒害作用小，梯度慢速冷凍可使細胞內水分滲出細胞外，減少形成冰晶對細胞產生的傷害。細胞低溫凍存是培養室常規工作和通用技術。細胞凍存在-196℃液氮中，

儲存時間幾乎是無限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快

GAGGAGAGGAFFFFAFAF