生化设计实验

蛋白质与核酸的定性与定量

一.实验目的

1.学习和掌握纯化蛋白质的原理和方法、蛋白质等电点的测量原理

和方法。

2.掌握使用双缩脲法对蛋白质的定性测定。

3.学会利用定糖法对核酸的定性与定量测定

二.实验原理

1.区分蛋白质和核酸：蛋白质在碱性溶液中可与Cu2+紫红色反应。这是蛋白质分子中肽键的反应，肽键越多反应颜色越深。核酸由单核苷酸所组成，无此反应。另外，核酸组成成分嘌呤及嘧啶碱基具有强烈的紫外吸收，所以核酸也具有强烈的紫外吸收，最大吸收值在260mn，利用这一性质亦可鉴别核酸样品和蛋白质样品。

2.蛋白质的纯化方法：

（1）粗分离：中性盐对蛋白质胶体的稳定性有显著的影响。一定浓度的中性盐可破坏蛋白质胶体的稳定因素而使蛋白质盐析沉淀。盐析沉淀的蛋白质一般保持着天然构象而不变性。

（2）蛋白质类别及分子量的确定：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定样液中含有几种蛋白质，每种蛋白质的分子量大小。由于SDS 是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小

成正比变化。

（3）蛋白质的精制：根据上一步骤得到的蛋白质的分子量，采用葡聚糖凝胶层析的方法。聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。

3.蛋白质的含量测定以及等电点、比旋度等性质

（1）蛋白质的含量测定：采用Folin-酚试剂法。蛋白质中有带酚基的酪氨酸，故能与试剂乙反应而呈蓝色，蓝色深浅与蛋白质溶度相关，在一定溶度范围内呈线性关系，因此可做比色测定。

（2）等电点与比旋度。蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的PH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。蛋白质的比旋度可用旋光仪。

4.核酸种类的测定方法及含量测定：

（1）核酸种类的测定：RNA与地衣酚试剂反应由黄色变成绿色为阳性反应。DNA与二苯胺试剂由乳白色变成蓝色为阳性反应。

（2）含量测定：紫外吸收法测定核酸含量。DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处。紫外吸收使嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质，所有含嘌呤和嘧啶的物质，都具有吸收紫外线的特性。核酸和核苷酸的摩尔吸收系数用ε（P）表示。ε（P）为每升溶液中含有1mol核苷酸时的光密度（即吸光度或光吸收）。RNA的ε（P）为7700～7800，RNA中磷的质量分数约为9.5%，因此每毫升溶液中含1.0μg RNA的光密度为0.022～0.024。小牛胸腺DNA钠盐的ε（P）（260nm，pH7）为6600，含磷的质量分数为

9.2%，因此每毫升溶液中含1.0μg DNA钠盐的光密度为0.020。

三.实验试剂

双缩脲试剂、饱和硫酸铵试剂、30%丙烯酰胺（Acr）、10%SDS （十二烷基磺酸钠）、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液、

1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液、0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液、

10%过硫酸铵(AP)、TEMED（四甲基乙二胺）、考马斯亮蓝、上样缓冲液、电极缓冲液、脱色液、Sephadex G-x、双缩脲试剂、

0.1mol/L硼酸缓冲液A、B、Folin-酚试剂、钼酸铵—过氯酸沉淀

剂等

四.实验方法

1.区分蛋白质和核酸：取两样品个1ml于试管中，滴加双缩脲试

剂，出现蓝色为阳性反应；

2.蛋白质粗分离：1.取锥形瓶一个，加入蛋白质溶液5.0ml，再加等量的饱和硫酸铵（半饱和硫酸铵)溶液，混匀后静置数分钟，则析出球蛋白。将混合液转移至两离心管（等量）中，3000rpm离心20min，小心将上清夜转移至小烧杯。2.95乙醇洗涤，转移至两离心管（等量）中，2000rpm离心10min，弃上清，重复步骤。再用无水乙醇洗涤一次，2000转离心10min。

3.蛋白质类别及分子量的确定：a.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形瓶. b.把玻璃板在灌胶支架上固定好. c.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟. 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.d.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟,梳口处不得有气泡,梳底需水平.e.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖，否则会影响加样效果.f.加样三个:（1）取10µl 标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上样量为20µl。2）取10µl样品1溶液，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上样量分别为5µl和10µl。g.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合,以防刺破胶,也不可过高，在样下沉时会发生扩散。最好选用中部的孔注样h.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在