第十八章 高效液相色谱法
高效液相色谱 PPT
制备反应如下
+ Si OH
SO Cl 2
HgBr
Si
Si Cl
NH 2 CH 2 NCH 2 H2
Si NH
CH 2 CHNH 2
共价键健合固定相不易水解,并且热稳定较硅酸 酯好。缺点就是格氏反应不方便;当使用水溶液时,必须 限制PH在4～8范围内。
(3)硅烷化(≡Si—O－Si－C)键合固定相 制备反应如下:
第3节 高效液相色谱得固定相和流动相
(－)固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类, 可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅 为基质,可承受高压,可制成直径、形状、孔隙度不同 得颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团,就就 是键合固定相,可扩大应用范围,她就是目前最广泛使 用得一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻 色谱中,她由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。固定 相按孔隙深度分类,可分为表面多孔型和全多孔型固 定相两类。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交
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3 分离系统——色谱柱
色谱柱就是液相色谱得心脏部件,她包括柱管 与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜 及内衬光滑得聚合材料得其她金属。玻璃管耐压有限, 故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm,内径为 4～5mm,凝胶色谱柱内径3～12mm,制备往内径较大,可 达25mm 以上。
(三)液一固吸附色谱法(LSAC)
液一固吸附色谱就是以固体吸附剂作为固定 相,吸附剂通常就是些多孔得固体颗粒物质,在她们 得表面存在吸附中心。液固色谱实质就是根据物 质在固定相上得吸附作用不同来进行分离得。
1、分离原理
当流动相通过固定相(吸附剂)时,吸附剂表面得活性中 心就要吸附流动相分子。同时,当试样分子(X)被流动相带 入柱内,只要她们在固定相有一定程度得保留就要取代数目 相当得已被吸附得流动相溶剂分用)于就是,在固定相表面 发生竞争吸附:
高效液相色谱技术
高效液相色谱技术
高效液相色谱(HPLC)技术是一种用于分离、纯化、定性和定量分析溶液中化合物的技术。
它是在液相色谱技术基础上发展起来的，具有分离能力强、分辨率高、灵敏度高、分析速度快等优点。
HPLC技术的核心是色谱柱和溶液泵。
色谱柱是分离样品的重要部分，根据不同的分离目标可以选择不同类型的柱子，例如反相柱、离子交换柱、大小分子排阻柱等。
溶液泵用于将样品溶液以一定的流速推动通过色谱柱，保持流动相的恒定。
高效液相色谱技术主要包括以下几个步骤：
1. 样品预处理：将待分析样品进行处理，如提取、浓缩、溶解等，以便于后续的分析。
2. 进样：将样品注入到进样装置中，通过自动或手动控制，精确地给定进样体积。
3. 分离：在色谱柱中根据样品分离目标的性质和柱上固定相的特性，通过流动相的带动将样品分离。
4. 检测：利用检测器检测样品的浓度或质量，并将信号转化为电信号输出。
5. 数据处理：通过对检测器输出信号的处理和计算，得到对样品的定性和定量分析结果。
高效液相色谱技术在许多领域得到广泛应用，如药学、环境监测、食品安全等。
它能够对样品中的化合物进行高效、灵敏、准确的分离和分析，为科研和工业生产提供了强有力的工具。
高效液相色谱法
高效液相色谱法1 简述高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离侧定的色谱方法。
注人的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进人检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。
色谱柱内径一般为3.9～4.6μm，填充剂粒径为3～10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度的高效液相色谱仪。
1.1.1色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物符合硅胶和聚合物等；常见的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氛基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
中国药典版高效液相色谱法课件
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3.甲醇和乙睛的截止波长是多少， 应用 意义是什么
甲醇和乙睛的截止波长分别为210nm与 190nm左右，在流动相中，增大甲醇和 乙睛的比例，即增加有机相的比例，能 使出峰面积加快，但同时减少分离度。
中国药典版高效液相色谱法
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二原理
高效液相色谱法是用高压输液泵将 具有不同极性的单一溶剂或不同比例 的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装 有固定相的色谱柱，经进样阀注入供 试品，由流动相带入柱内，在柱内各 成分被分离后，依次进入检测器，色 谱信号由记录仪或积分仪记录。
中国药典版高效液相色谱法
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三 1.对仪器的一般要求
中国药典版高效液相色谱法
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（3）加校正因子的主成份自身对照法 （4）不加校正因子的主成份自身对照法
中国药典版高效液相色谱法
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（5）面积归一化法
由于峰面积归一化法测定误差大， 因此本法 只能通常用于粗略考察供試 品中的杂质含量，除另有规定外，一 般不宜用于微量杂质的检查，方法是 测量各杂质峰面积和色谱图上除溶剂 外的总色谱 峰面积，计算各峰面积及 其之和占总峰面积的百分率。
（11）紧固件或连接件泄漏-------------（11） 拧紧或更换紧固件
（12）进样装置部分堵塞----------------（12） 检修进样器并清洗
中国药典版高效液相色谱法
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现象5：峰重现性差
判断————————————--------------排除方法
（1）注射器针头太长，样品液部分漏掉 ------（1）选用合适的针头
高效液相色谱法
一概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用 极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是 在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的 理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相 和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率 高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更 好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方 面进行比较：
第十八章_高效液相色谱法
疏水基团 C18基 C8基 苯基
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（3）键合相色谱法分离机理 ）
反相键合相色谱: 固定相极性<流动相极性 反相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相： 常用固定相：C18（ODS） ） 常用流动相 甲醇-水 甲醇 水 乙睛-水 乙睛 水 分离对象 非极性 中等极性化合物
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3）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的 越大 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂， 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加， 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 中性盐的加入：使中性溶质的 增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 ：影响弱酸、 流动相的pH降低，弱酸 增大 增大， 增大； 流动相的 降低，弱酸k增大，tR增大；弱 降低 变小。 碱k变小。 变小
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一、化学键合相色谱法的固定相
• 固定相应符合下列要求： 固定相应符合下列要求： –颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀 –化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好 1、键合相的种类 （1）非极性键合相 ： 与苯基等键合在硅胶表面； －非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； 非极性烃基， －用于反相色谱； 用于反相色谱； －长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 稳定性更好。 稳定性更好。
极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
离子交换基团 胺基、 胺基、季铵盐 磺酸、 磺酸、羧酸
高效液相色谱分析法剖析课件
通过高压泵将流动相（溶剂）泵入装有固定相（填料）的色 谱柱，当不同组分的混合物经过色谱柱时，由于在固定相和 流动相之间的分配系数不同，导致不同的组分以不同的速度 通过色谱柱，从而实现各组分的分离。
高效液相色谱法的应用领域
药物分析
用于药物的分离、纯化 和含量测定，以及药物
代谢产物的分析。
食品安全
THANKS
感谢观看
03
土壤中农药残留分 析
高效液相色谱法能够检测土壤中 残留的农药成分，为土壤污染治 理提供依据。
生物样品分析
生物体内药物浓度测定
通过高效液相色谱法，可以测定生物 体内药物的浓度，有助于临床用药的
指导和疗效评估。
生物体内代谢产物分析
高效液相色谱法能够检测生物体在代 谢过程中产生的代谢产物，有助于了
解生物体的生理和生化过程。
建立色谱条件
选择色谱柱
根据待测物的性质选择合适的色谱柱类型和规格。
确定流动相
根据待测物的性质确定合适的流动相组成，包括溶剂、比例、pH 值等。
设置检测器
根据待测物的性质选择合适的检测器类型，如紫外可见光检测器、 荧光检测器等。
进样分析
样品进样
将处理好的样品按照规定的进样量注入色谱柱。
洗脱分离
通过流动相的洗脱作用，使待测物在色谱柱上分离成单个组分。
02
高效液相色谱系统的组成
色谱柱
01
02
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功能
色谱柱是高效液相色谱系 统的核心部件，用于分离 样品中的不同组分。
类型
常用的色谱柱有硅胶、氧 化铝、活性炭、聚合物等 材质，根据不同的分离需 求选择合适的色谱柱。
性能指标
色谱柱的性能指标包括粒 径、孔径、柱长、柱内径 等，这些参数直接影响分 离效果和分离时间。
《高效液相色谱分析》课件
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
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选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
高效液相色谱方法及应用课件
七、高分子材料的分析
高分子工业材料及生物高分子分析是近年 来新兴的课题。凝胶色谱是分离分析高分子组 成及鉴定其性能的最好方法。高分子材料中填 充各种助剂、乳化剂、分散剂等物的分离，色 谱技术也独具特点。
①控制高分子产品质量 在生产工艺中，可 利用凝胶色谱测定聚合物小分子杂质。如用 凝胶色谱测定环氧树脂中未聚合的双酚A，用 C18柱分离小分子环氧化合物，小分子聚苯乙 烯或不能成膜的聚脂等，用以鉴定聚合物的 质量。 ②测定聚合物的分子量分布宽度 分子量大 小和分子量分布宽度是衡量聚合物质量的一 种重要指标，用凝胶色谱可以测定。
高效液相色谱法的特点
• 一、与经典液相色谱法比较 经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装 填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经 色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱 入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。 高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填 在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵 进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散 速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效 和高分离能力。
⑤糖的分析。糖的分析是其它方法较难完成 的。如把糖与硼酸缓冲液预选混合，使生成 糖-硼酸络合离子，再进行分离。可把蔗乳糖、 阿芦糖、果糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖、 山梨糖、木糖、葡萄糖等几十种，全部分开。 也可用胺基柱分离各种天然产物中伯糖的各 绷分。
三、天然产物中主要组分的分析
天然物的组分非常复杂，如中草药中各组 分含量多少对药剂作用影响很大。用此技术分 离分析，具有简便、快速的特点。氨基柱能分 离分析天然物中糖的组分。氰基柱能分离中药 紫草及其衍生物的组成。C18柱分离丹参中主 要组分儿茶酚、桂皮中桂皮酸、烟草中的酚类 化合物、麦角或鸦片中各种植物碱，这些都是 近来日益受到重视的结果。
高效液相色谱法
➢化学键合相色谱法
其他色谱类型
➢亲合色谱法（affinity chromatography； AC）
➢手性色谱法（chiral chromatography； CC）
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操 作严格，这是它的主要缺点。
第一节 高效液相色谱仪
➢组成
➢输液系统 ➢进样系统 ➢色谱柱系统 ➢检测系统 ➢数据记录处理系统
此外还配有辅助装置：如梯度淋洗， 自动进样及数据处理等。
其工作过程如下：首先高压泵将贮 液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱 柱，然后从控制器的出口流出。当注入 欲分离的样品时，流经进样器贮液器的 流动相将样品同时带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将 检测器送出的信号记录下来，由此得到 液相色谱图。
➢ 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速 度快；
➢ 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外 检测器最小检测限可达109g，而荧光检测 器最小检测限可达1012g。
高效液相色谱法与气相色谱法相比
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20 ％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、 热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采 用高效液相色谱法进行分离和分析。
➢特殊用途的键合相
（二）、键合相的性质和特点
➢(1)键合反应
➢硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅 胶进行硅烷化反应
R1 Si OH + Cl Si C18H37
R2
第十八章高效液相色谱法
第十八章 高效液相色谱法15.外标法测定黄芩颗粒剂中黄芩苷含量：色谱柱为Zirchrom C8柱（20cm ×4.6mm ，5um ）；流动相为乙腈-甲醇-水（含0.5%三乙胺，磷酸调pH3.0）（28：18：54）；以黄芩苷对照品配成浓度范围为10.3～144.2ug/ml 的对照品溶液。
进样，测得黄芩苷峰面积，以峰面积和对照品浓度求得回归方程为：A=1.168×105c-1.574×103，r=0.9998.精密称取黄芩颗粒0.1255g ，置于50ml 量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml 于10ml 量瓶中，30%甲醇定容到刻度，摇匀即得供试品溶液。
平行测定供试品溶液和对照品溶液（61.8ug/ml ），得峰面积分别为4250701，5997670. 解：标样标样A A c =c 599767042507018.6110/=样c %4.17%1001255.01050%6=⨯⨯=-样c w 16．校正因子法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量：ODS 色谱柱；甲醇-水（60：40）流动相；检测器UV280nm ；对硝基甲苯为内标物。
（1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物）、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成10ml 溶液，进样10ul ，记录色谱图。
重复三次。
测得含0.0733mg/ml 内标物、0.600mg/ml 炔诺酮和0.035mg/ml 炔雌醇的对照品溶液平均峰面积列于表18-6。
（2）试样测定：取本品20片，精密称定，求出平均片重（60.3mg/片）。
研细后称取732.8mg （约相当于炔诺酮7.2mg ），用甲醇配制成10ml 供试品溶液（含内标物0.0733mg/ml ）。
测得峰面积列于表18-6。
表18-6 复方炔诺酮片中各成分及内标物平均峰面积（u v ·s ）解：02.3)10587.6/(100733.0)10043.1/(10035.0A /m A /m f 55s s =⨯⨯⨯⨯==醇醇醇 试样含炔雌醇的量：)mg (449.010841.610387.1100733.002.3A A m f m 55s s =⨯⨯⨯⨯⨯=⋅⋅=醇醇醇 每片含炔雌醇的量：)/mg 0369.0(3.608.732449.0片=⨯ 17．测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品各0.2000g 配成混合溶液。
第十八章 高效液相色谱法 - 章节小结
一、主要内容1．基本概念（1）化学键合相：利用化学反应将有机基团键合在载体表面形成的固定相。
（2）化学键合相色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法。
（3）正（反）相色谱法：流动相极性小（大）于固定相极性的液相色谱法。
（4）抑制型（双柱）离子色谱法：用抑制柱消除流动相的高电导本底，以电导为检测器的离子交换色谱法。
（5）手性色谱法：利用手性固定相或手性流动相添加剂分离分析手性化合物的对映异构体的色谱法。
（6）亲合色谱法：利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂生物试样中分离和分析特殊物质的色谱方法，是基于组分与固定在载体上的配基之间的专一性亲和作用而实现分离的色谱法。
（7）梯度洗脱：在一个分析周期内程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等。
（8）静态流动相传质阻抗Csm：由于组分的部分分子进入滞留在固定相微孔内的静态流动相中，因而相对晚回到流路中，引起的峰展宽。
（9）键合相的含碳量：键合相碳的百分数，可通过对键合硅胶进行元素分析测定。
（10）键合相的覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。
（11）封尾：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等对键合相进行钝化处理，减少残余硅醇基，即封尾。
（12）溶剂的极性参数P'：表示溶剂与三种极性物质乙醇（质子给予体）、二氧六环（质子受体P'）和硝基甲烷（强偶极体）相互作用的强度。
用于度量分配色谱的溶剂强度。
P'越大，溶剂的极性越强，在正相分配色谱中的洗脱能力越强。
（13）溶剂的强度因子S：常为反相键合相色谱的溶剂洗脱能力的度量。
（14）三维光谱－色谱图：用DAD检测器检测，经过计算机处理，将每个组分的吸收光谱和试样的色谱图结合在一张三维坐标图上，即获得三维光谱-色谱图。
2．基本理论（1）速率理论在HPLC中表达式为：H=A+C m u+C s m u 用于指导实验条件的选择。
A、Cm和Csm均随固定相粒度dp变小而变小，因此保证HPLC高柱效的主要措施是使用小粒度的固定相。
高效液相色谱法PPT课件
13
开机前的准备工作
1、将试验中要求的流动相配制好。 2、流动相要抽滤除气。 3、安装好试验要求的色谱柱。
14
15
正相色谱法
采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与 腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏 水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷）， 常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯 甲烷等以调节组分的保留时间。常用于 分离中等极性和极性较强的化合物(如酚 类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
3、关上排液（或灌注）旋钮，逐渐将流 速升高。平衡至少30分钟后准备进样。
23
进样前准备——样品过滤
一次性注射器
样品瓶
针式（头）过滤器
24
仪器：手动进样器-六通阀/定量环
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手动进样器工作原理
装填状态
样品注入
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手动进样器
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仪器：检测器
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仪器：检测器-紫外
ＤＡＤ检测器 流路
UV/Vis双灯，全波长检测
6
色素 玻璃柱
石油醚
碳酸钙颗粒
俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现 的，色谱法(Chromatography)因之得 名。
7
色谱法的分离原理是：
溶于流动相中的各组分经过固定相时， 由于与固定相发生作用（吸附、分配、 离子吸引、排阻、亲和）的大小、强 弱不同，在固定相中滞留时间不同， 从而先后从固定相中流出。又称为色 层法、层析法。
8
色谱分离过程
流动相 Temporal
course
9
液相色谱理论发展简况
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃 管柱在室温和常压下用液位差输送流动 相，称为经典液相色谱法，此方法柱效 低、时间长（常有几个小时）。高效液 相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相 色谱法的基础上，于60年代后期引入了 气相色谱理论而迅速发展起来的。
第十八章 高效液相色谱法
5 10 72.1
( P2' 8.7 ) / 2
P2' 8.7 1.16 2
6.38 5.1 (1 ) 10.2
= 0.75
即调整溶剂比例为 75%甲醇和25%水可使该组分的 k 值为5。
四、正相键合相色谱法
固定相：极性键合相
如－CN、－NH2或二羟基键合硅胶
）。
A 样品的k降低，tR降低 B 样品的k增加，tR增加 C 相邻组分的增加 D 对基本无影响
2．用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇一水为 流动相时，样品容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好 的办法是（ ）。 A 增加流动相中甲醇的比例 C 流动相中加人少量HAc B 增加流动相中的水的比例 D 流动相中加人少量的氨水
五、反相键合相色谱法
1. 固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶
流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等
应用：非极性至中等极性的组分，还有有机酸、碱及盐等
2. 保留机制：疏溶剂理论
溶质的保留主要是溶质分子与
极性溶剂分子间的排斥力，促
P
' mix
i Pi
i 1
n
'
式中i 为混合溶剂中各溶剂的体积百分数。 二元混合溶剂的则为
P P B P
' AB ' A A
式中A， B分别为二元混合溶剂中溶剂A和溶剂B的体积百分数。
溶剂的选择性
溶剂可分为八组而分别位于图中不同区。 I 组的 xe值较大， 属质子受体溶剂； VII 组的 xd 值较大，属质子给于体溶剂； V 组
18章高效液相色谱法
六、反相离子对色谱法
把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析组分离 子在流动相中与离子对试剂的反离子（或是称对离子） 生成不带电荷的中性离子对，从而增加溶质与非极性固 定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果， 适用于分离可离子化或离子型的化合物。 1、离子对模型
试样离子在流动相中与离子对试剂离解出的反离子 生成不荷电的中性离子对，然后在非极性固定相上产生 保留。
第四节 高效液相色谱分析方法
一、定性和定量分析方法
1、定性方法分为色谱鉴定法和非色谱鉴定法。 2、定量方法常用外标法和内标法进行。 3、主成分自身对照法：
不加校正因子主成分自身对照法： 加校正因子主成分自身对照法： 二、高效液相色谱分离方法的选择 分离模式选择主要依据试样的性质和各种模式的分离 机制。试样的性质包括相对分子量、化学结构、极性和溶 解度等。
（1）化学稳定性好,使用过程中不流失,柱寿命长;
（2）均一性和重现性好;
（3）柱效高,分离选择性好;
（4）适于梯度洗脱;
（5）载样量大. 3、使用注意事项： （1）使用硅胶基质的键合相pH应维持在2-8;硅-碳杂化 硅胶等为基质的键合相pH范围宽（2-12）；
（2）不同厂家，不同批号的同类键合相也可表现不同 的色谱特性。
（3）极性键合相：常用氨基、氰基键合相。是分别 将氨丙硅烷基和氰乙硅烷基键合在硅胶是制成。一般用 作正相色谱固定相。 氰基键合相。对双键或含双键的环状化合物有较好 的分离能力。 氨基键合相对糖类化合物的分离选择性好。在酸性 介质中它是一种弱阴离子交换剂，能分离核酸。不宜分 离带羰基的物质
2、键合相的特点
高效液相色谱法的检测器要求：灵敏度高、噪声 低、线性范围宽、重复性好和适用范围广。
1、紫外检测器简介： 灵敏度较高、噪声低、线性范围宽，对流速 和温度的波动不灵敏，还适用于制备色谱。 工作原理：是朗伯比尔定律，即组分的浓度与吸 光度成正比。 2、紫外检测器分类：
高效液相色谱方法及应用课件
未来发展趋势与展望
超高效液相色谱（UPLC）的普及与发展
随着色谱填料制造技术的进步，UPLC将逐渐成为主流技术，进一步提高分离效率和检 测灵敏度。
联用技术的发展
HPLC将与其他分析技术（如质谱、红外光谱等）更紧密地结合，实现多维、多组分的 同时分析，提高分析速度和准确性。
微纳流控芯片的集成与应用
随着微纳加工技术的发展，HPLC将与微纳流控芯片集成，实现样品制备、分离和检测 的一体化，为便携式、即时分析提供可能。
PART 06
高效液相色谱法的挑战与 展望
技术挑战与解决方案
01 02
分离效率的提高
随着样品组分的日益复杂，分离效率的提高成为HPLC技术面临的重要 挑战。解决方案包括开发新型填料、优化色谱柱参数以及采用先进的色 谱分离技术。
检测灵敏度的提高
对于痕量组分的分析，提高检测灵敏度是关键。解决方案包括采用高灵 敏度检测器、优化检测条件以及发展超高效液相色谱技术。
实验操作流程
流动相制备
根据实验要求，制备适量的流动 相，确保其比例、纯度和稳定性 符合要求。
样品处理
对样品进行预处理，如溶解、过 滤、稀释等，以便进行后续的液 相色谱分析。
柱子安装与条件优化
根据实验需求，选择合适的色谱 柱，并进行安装和条件优化，以 提高分离效果和实验效率。
进样与检测
将处理好的样品注入进样器，按 照设定的条件进行分离和检测， 记录数据。
发展历程与趋势
发展历程
HPLC技术自20世纪60年代问世以来， 经历了不断改进和完善的过程，已成 为一种成熟且广泛应用的分析方法。
发展趋势
随着科技的进步，HPLC技术正朝着 高分离度、高灵敏度、自动化和智能 化的方向发展，同时与其他分析技术 的联用也成为了研究热点。
高效液相色谱法介绍ppt
四、检测系统
要求检测器灵敏度高、噪声低、死体积小、线性范围宽、 重复性好、适用范围广等。
(一)紫外检测器 应用最广,对大部分有机化合物有响应。
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
紫外检测器包括固定波长、可变波长与光电二极 管阵列检测器
高灵敏度,高选择性。对多环芳烃,维生素 B,黄曲霉素,卟啉类化合物,农药,药物,氨基酸 ,甾类化合物等有响应。
(三)示差折光检测器 可连续检测参比池与样品池中流动相之间得
折光指数差值。差值与浓度成正比。
通用型检测器, 但灵敏度低,对 温度敏感,不能 用于梯度洗脱
(四)蒸发光散射检测器
在一定得条件下,光散射强度正比于溶质粒子得 大小与数量。散射光强度与样品微粒质量得关系为
(3)流动相得流速低,一般控制在1mL/min左右
(4)柱温25℃左右为宜。
柱温太高,虽Dm增大,传质阻力减小,但易产生气 泡,太低不仅减小Dm,使传质阻力增大,而且流动 相得粘度增大,柱阻加大。
二、柱外展宽
从进样器到检测器之间,除色谱柱以外,其她 因素导致得谱峰展宽。
采用 小体积检测器,管道对接宜呈流线形,减少柱外 死体积,从而减小柱外展宽,提高柱效。
1、键合反应
化学键合相得载体就是硅胶,表面有≡Si—OH,能与合 适得有机化合物反应,使具有不同极性功能团得有机 分子键合在表面而获得不同性能得化学键合相,她得 制备方法主要就是用有机氯硅烷与硅醇基发生反应 (硅烷化 ),生成Si-O-Si-C键合相。
由于空间位阻效应,不可能将较大得有机官能团 键合到全部硅醇基上,使得部分硅醇基未反应。
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第十八章 高效液相色谱法
15.外标法测定黄芩颗粒剂中黄芩苷含量：色谱柱为Zirchrom C8柱（20cm ×
4.6mm ，5um ）；流动相为乙腈-甲醇-水（含0.5%三乙胺，磷酸调pH3.0）（28：18：
54）；以黄芩苷对照品配成浓度范围为10.3～144.2ug/ml 的对照品溶液。
进样，测得黄芩苷峰面积，以峰面积和对照品浓度求得回归方程为：A=1.168×105c-1.574×103，r=0.9998.精密称取黄芩颗粒0.1255g ，置于50ml 量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml 于10ml 量瓶中，30%甲醇定容到刻度，摇匀即得供试品溶液。
平行测定供试品溶液和对照品溶液（61.8ug/ml ），得峰面积分别为4250701，5997670. 解：标样标样
A A c =c 599767042507018.6110
/=样c %4.17%1001255.01050%6=⨯⨯=-样c w 16．校正因子法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量：ODS 色谱柱；甲醇-水（60：40）流动相；检测器UV280nm ；对硝基甲苯为内标物。
（1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物）、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成10ml 溶液，进样10ul ，记录色谱图。
重复三次。
测得含0.0733mg/ml 内标物、0.600mg/ml 炔诺酮和0.035mg/ml 炔雌醇的对照品溶液平均峰面积列于表18-6。
（2）试样测定：取本品20片，精密称定，求出平均片重（60.3mg/片）。
研细后称取732.8mg （约相当于炔诺酮7.2mg ），用甲醇配制成10ml 供试品溶液（含内标物0.0733mg/ml ）。
测得峰面积列于表18-6。
表18-6 复方炔诺酮片中各成分及内标物平均峰面积（u v ·s ）
解：02.3)10587.6/(100733.0)10043.1/(10035.0A /m A /m f 55s s =⨯⨯⨯⨯==醇
醇醇
试样含炔雌醇的量：
)mg (449.010841.610387.1100733.002.3A A m f m 55s s =⨯⨯⨯⨯⨯=⋅⋅=醇
醇醇
每片含炔雌醇的量：)/mg 0369.0(3.608
.732449.0片=⨯ 17．测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品各0.2000g 配成混合溶液。
测得峰面积分别为3.60, 3.43和4.04cm 2。
称取0.2400g 内标物和试样0.8560g 同法配制成溶液后，在相同色谱条件下测得峰面积为4.16, 3.71和4.54cm 2。
计算试样中黄连碱和小檗碱的含量。
解：05.143
.360.3A A A /m A /m f s s s ====黄黄
黄黄 18．计算在反相色谱中甲醇－乙腈－水（60:10:30）的强度因子。
如果改用四氢呋喃－甲醇－水，水的含量不变，为了保持相同的洗脱强度，甲醇的比例是多少?
解：12.230.0010.02.360.00.3S S S S =⨯⨯⨯=ϕϕϕ=＋＋＋＋水水乙乙甲甲混
设改换溶剂后，甲醇的比例为x ，则
x = 0.687 = 68.7%
19．用15cm 长的ODS 柱分离两个组分。
柱效n =2.84×104m –1；测得t 0=1.31min ；
组分的10.41R =t min ；2
R t =4.45min 。
(1)求k 1、k 2、α、R 值。
(2)若增加柱长至30cm ，分离度R 可否达1.5?
解：(1) 13.231.131.110.4t t t t 't k 00R 0R 111=-=-==
(2) 由212221
L L R R =，则30.015.0R 0.1222= R 2 = 1.4(达不到1.5)。