蛋白质组双向电泳原理及实验步骤.
双向电泳详细操作过程
蛋白质的双向电泳一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二、实验步骤：1. 芽孢杆菌蛋白质的提取2. 蛋白质样品的纯化将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥，放在-80度冰箱里备用，取出蛋白质干粉300mg 加水化液(尿素水化储备溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，离心，吸除丙酮酸，用超纯水中（加DTT），清洗两次，离心，加水化液溶解。
水化液配置：用dd H20定容水化液浓度100ml 20ml尿素（60.06）7M/L 42.0g 8.4g硫脲（76.12）2M/L 15.2g 3.04gCHAPS 4% 4g 0.8gDTT(154.2) 1% 1g 0.2g（注：DTT现用现加）3. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul的BSA溶解液，在分别加入100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入4ml的Bradfor。
另取2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，各管中分别加入4ml的Bradfor，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
例如：标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为OD值，X为蛋白含量。
a、b通过作图输入数据可知G250的配置：称取G250 固体0.1g加水定容至1L。
使用前滤纸过滤。
比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。
Westernblot蛋白质双向电泳的原理方法及在医学中的应用最终版
31
技术流程
提出 生物学问题
实验组和对照组样品制备
双向电泳(2DE/DIGE)
凝胶图像分析
差异蛋白点选取 蛋白酶解及质谱分析 差异蛋白点的成功鉴定
Western blot 、蛋白质双向电泳的 原理、方法及在医学中的应用
湘雅医学院精神医学 1301班
CONTENTS
1
Western blot 原理及方法
2
蛋白质双向电 泳的原理
4
应用
3
蛋白质 双向电 泳的方
法
2
Western blot 原理及方法
蛋白质印迹法
3
Western blotting
? 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别 凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉 反应条带 。
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化学显色法
方便、便宜、灵敏 度较低、费抗体、 反应慢、线性窄、 不易保存、不能重 新剥离检测
Western blotting ！！
4
什么是蛋白质印迹法 ？
Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化技术及分 子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在 于把凝胶已分离的区带并印迹于固化纸上，可分为 电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和 特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定 的方法。
Western Blotting 间接法操作流程
Western Blotting 设计标准
分子量 标准
膜的选择
抗体
显色结果
双向电泳的原理应用
双向电泳的原理应用1. 原理介绍双向电泳是一种用于分离和分析蛋白质的技术。
它利用电场的力作用将蛋白质分子根据其大小和电荷分离成不同的带状条带，从而实现对蛋白质的分离和分析。
在双向电泳中，电泳液在两个方向（水平和垂直）上施加电场。
水平的电场用于推动蛋白质分子在凝胶中移动，而垂直的电场用于将蛋白质分子根据其电荷进行分离。
2. 双向电泳的步骤双向电泳通常包括以下几个步骤：2.1 凝胶制备首先制备凝胶，常用的凝胶包括聚丙烯酰胺凝胶和聚酰胺凝胶。
凝胶的选择取决于所要分析的蛋白质的分子量范围。
2.2 样品制备将待分析的蛋白质样品进行处理，通常包括蛋白质提取、蛋白质纯化和蛋白质标记等步骤。
2.3 水平电泳将样品加载到凝胶上，并将凝胶放入水平电泳槽中。
施加水平电场后，蛋白质会根据其分子量在凝胶中移动，形成水平方向上的分离。
2.4 凝胶固定水平电泳后，将凝胶固定，通常使用乙醇或甲醛进行固定，以防止蛋白质在后续步骤中的移动。
2.5 垂直电泳固定后的凝胶被垂直放置，然后施加垂直电场。
此时，蛋白质会根据其电荷进行进一步的分离。
2.6 染色和可视化分离完成后，凝胶通常会被染色，以便观察和分析分离的蛋白质条带。
常用的染色方法包括银染和荧光染色。
3. 双向电泳的应用双向电泳在蛋白质分离和分析方面具有广泛的应用。
3.1 蛋白质组学研究双向电泳可以用于研究蛋白质组学，包括蛋白质的组成、结构和功能等。
通过双向电泳可以分离出不同的蛋白质条带，从而有助于研究蛋白质的表达和变化。
3.2 蛋白质质量测定双向电泳可以用于测定蛋白质的质量。
通过与已知质量的蛋白质进行比较，可以确定待测蛋白质的质量范围。
3.3 蛋白质互作研究双向电泳还可以用于研究蛋白质之间的相互作用。
通过在凝胶中一同加载多个蛋白质样品，可以观察到不同蛋白质之间的相互作用。
3.4 蛋白质标记双向电泳常常与蛋白质标记技术结合使用。
通过将蛋白质样品与荧光染料或同位素标记剂结合，可以在凝胶上可视化和定量分析蛋白质。
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤双向电泳操作步骤及相关溶液配置A(实验过程一实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二实验步骤:1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。
其中每隔10,15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。
2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul,10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
3. 双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05, 的溴酚兰，3.5ul(0.5,v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。
在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。
3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析操作步骤:1.样品准备:将待测蛋白质混合物进行样品处理，如蛋白质提取、浓缩和去污等步骤，以获得高纯度、高浓度的样品。
2.第一维电泳:将样品加载到等电点聚焦凝胶中。
等电点聚焦是根据蛋白质的等电点进行分离的方法，即根据蛋白质电荷差异使其定位到等电点位置。
通常使用毛细管等电点聚焦，具体操作步骤是：将样品注入到毛细管中，两端分别连接正负电极，施加电压使得蛋白质开始迁移，直到在等电点位置停止。
这个阶段的电流较低。
3. 第一维凝胶电泳结束后，可使用pH梯度(pH gradient)的凝胶电泳或两种缓冲液浸泡在两边以建立静电场将蛋白质进一步扩散。
4.第二维电泳:将第一维电泳分离得到的凝胶嵌入到另一种凝胶中进行第二次电泳。
通常使用SDS-凝胶。
该凝胶使用离子溶液降解电荷，所有的蛋白质都将带有同样的电荷。
这个阶段的电流较高。
5. 染色和图像分析: 电泳结束后，可以用染色剂进行染色，如Coomassie蓝染色或银染色。
然后使用透射扫描或数字图像分析仪，获取电泳凝胶的图像，并进行质谱分析。
解析与解释:1.蛋白质双向凝胶电泳可以提供更高的分辨率和更好的分离效果，因为它结合了等电点聚焦和SDS-的优势。
2.在等电点聚焦过程中，蛋白质根据其等电点的差异而聚集在凝胶中的不同位置。
这一步骤可以将样品分离成多个窄条带，每个窄条带包含具有相似等电点的蛋白质。
3.在第二维电泳中，蛋白质将根据其分子质量而进一步分离。
较小分子量的蛋白质可以迁移到更远的位置，而较大分子量的蛋白质则停留在较近的位置。
4.通过染色和图像分析，可以将电泳凝胶的图像数字化并用于质谱分析。
这将帮助确定每个蛋白质的分子质量和相对丰度。
蛋白质双向凝胶电泳是一种非常有价值的蛋白质分析方法，尤其适用于分析复杂的混合物。
通过合理的操作步骤和解析方法，可以获得高质量的实验结果。
这些结果对于了解蛋白质的功能和相互作用，以及发现新的生物标志物具有重要的意义。
蛋白质双向电泳及质谱技术
– 蛋白沉淀法 – DNase/RNase处理 – 超声(机械破坏)、超高速离心 – DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)
其他杂质的去除
• 脂质
– 使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI – 丙酮沉淀
• 多糖
– 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 – TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pH
平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪 器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合
凝胶的图像处理分析
典型流程
• 凝胶图像的扫描 • 图像加工 • 斑点检测和定量 • 凝胶配比 • 数据分析 • 数据呈递和解释 • 2-DE数据库的建立
2-DE 分离的可溶性 E. coli 蛋白
目前双向电泳需解决的问题
• 胺基黑染色
– 转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色 – 转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色
• 银染
– 可减少胶内蛋白质产量 – 对某些种类的蛋白质染色效果差 – 对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响
银染色
50% 甲醇 25% 乙酸 4h
ddH2O 洗3次 30min/次
0.004% DTT 溶液 30min
两亲性电 解液浓度
(w/v) 40% 40% 40% 40% 40% 40% 40% 20%
样品溶液 样品溶液
体积
体积
(/5ml) (/5ml)
25l 250 l
12.5 l 125 l
12.5 l 125 l
25 l 250 l
12.5 l 125 l
25 l 250 l
12.5 l 125 l
– 通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用一、双向凝胶电泳（2-DE）的原理双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，蛋白质沿pH梯度分离至各自的等电点；第二向则按分子量的差异用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
二、关键参数分辨率和可重复性。
目前，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点。
采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的、可以随意精确设定的pH梯度。
建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对意向区域在pH范围内做第二轮分析，从而大大提高分辨率，威斯腾生物实验中心对这方面的研究比较全面和成熟。
灵敏度。
双向凝胶电泳灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的是用同位素标记，20ppm的标记蛋白可通过其荧光或磷光的强度而测定。
双向凝胶电泳用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即“参考胶图谱”。
三、蛋白质组研究的主要困难对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量分析。
双向凝胶电泳最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF膜上后再进行分析，确定是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。
四、蛋白质的翻译后修饰和加工指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成等，可能有一百种以上。
双向凝胶电泳翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。
双向电泳操作步骤蛋白质技术
双向电泳操作步骤-蛋白质技术水化上样(被动上样)1 .从冰箱中取出IPG胶条，室温放置IOmin o2 .沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各Icm左右不加样，中间的样品液一定要连贯。
注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。
3 .用银子轻轻撕去IPG胶条上的保护层。
注意：碱性端较脆弱,应小心操作。
4 .将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。
注意：不要将样品溶液弄到胶条背面，因为这些溶液不会被胶条吸收；还使胶条下面的溶液产生气泡。
如产生了气泡，用镜子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。
5 .放置30~45min大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油,每根胶条约3m1(17cmIPG),防止胶条水化过程中液体蒸发。
6 .置等电聚焦仪于-20。
C水化11〜15h。
第一向等电聚焦1 .将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH205~8μ1润湿。
2 .取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。
3 .将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。
4 .在每根胶条上覆盖2-3m1矿物油。
5 .对好正、负极，盖上盖子。
设置等电聚焦程序。
6 .聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。
或将胶条置于样品水化盘中，-20。
水箱保存，电泳前取出胶条，室温放置10分钟,使其溶解。
第二向SDS-PAGE电泳1 .配制12%的丙烯酰胺凝胶。
2 .待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MiI1iQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MiIIiQ水冲洗。
3 .配制胶条平衡缓冲液I4 .在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。
将另一份厚滤纸用Mi1IiQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
双向电泳法
双向电泳法双向电泳法（Bidimensional Electrophoresis，2-DE）是一种常用的蛋白质分离技术，可以同时分析样品中上千种蛋白质。
本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。
原理双向电泳法结合了等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种技术，通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。
在第一维度中，根据蛋白质的等电点（pI）进行分离；在第二维度中，根据蛋白质的分子量进行分离。
通过将这两个维度的分离结果叠加，可以获得高分辨率的蛋白质图谱。
双向电泳法的关键步骤如下：1.等电聚焦（IEF）：在第一维度中，使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。
等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子（OH-）或氢离子（H+）方向移动的分离方法。
在等电聚焦过程中，蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移，直到净电荷为零。
通过控制pH梯度和应用的电压，可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。
2.SDS-PAGE分离：在第二维度中，将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。
在SDS-PAGE凝胶中，蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。
由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。
因此，蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。
3.染色和分析：经过双向电泳分离后，凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点，每个斑点代表一个蛋白质。
常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。
对于银染法，它在灵敏度和线性范围上具有优势。
染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。
通过对斑点的比较和定量，可以识别不同样品之间的差异和变化。
步骤双向电泳法的步骤如下：1.样品制备：将待分析的生物样品（如细胞提取物）进行蛋白质提取，并使得蛋白质在石蜡中可溶解。
常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。
2.等电聚焦（IEF）：将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。
Western blot 、蛋白质双向电泳的原理、方法及在医学中的应用
行封闭处理。
5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h）
Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司）
Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原
的结合。
一抗、二抗杂交
抗体表面主要采用间接法。即先加入未标记特异性抗体（Ab1） 与膜上抗原结合，再加入标记的抗抗体（ Ab2 ）进行杂交检测，标记 Ab2 物质有放射性核素，酶，以及生物素等。
CLDM处理A链 球菌株
THANKS!
N：正常晶状体混合样品
M：白内障混合样品
2-DE 的医学应用
抗生素作用机制
大剂量克林霉素(CLDM)和青霉素G(PCG)常被用 于治疗化疗后A链球菌群造成的中毒性休克， Tanaka等以2-DE等蛋白质组学研究方法研究： 正常A链球菌 株
达蛋 差白 异质 表
SpeB, SpeA, streptolysin O (Slo）等蛋白表达明显受抑制
举例说明
一、应用Western 印迹方法检测人肾细胞癌组织及癌旁组织 中NF-κ B信号通路蛋白表达,探究NF-κ B信号通路与人肾细 胞癌之间的可能关系。
(参考文献： 钟加滕； 衣豪伟； 康劲松； 于春艳； 李晓宁； 孙连 坤.Western印迹检测人肾细胞癌中NF-κ B信号通路分子蛋白的表达水 平.中国老年学杂志.2011,10:108-109)
操作者个人技术影响结果
固相 pH梯度 (IPG)
等电聚焦实验步骤
取出IPG预制胶条（7cm,pH4-7），室温平衡 在聚焦盘或水化盘中加入样品 去除预制IPG胶条上的保护层
将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中
在每根胶条上覆盖1ml矿物油 对好正、负级，盖上盖子 设置等电聚焦程序
双向电泳的原理及步骤
双向电泳的原理及步骤
双向电泳是一种分离蛋白质的方法，基于蛋白质在电场中的电荷和大小的不同进行分离。
以下是双向电泳的原理及步骤：
原理：
双向电泳是将蛋白质样品首先进行等电聚焦，然后再进行垂直于等电聚焦方向的SDS-PAGE电泳，从而获得更高的分离效率。
等电聚焦可以将蛋白质按照等电点的不同进行分离，而SDS-PAGE电泳可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离。
通过这两个步骤的组合，可以更加准确地分离出蛋白质。
步骤：
1. 等电聚焦：将蛋白质样品加入到等电聚焦电极中，该电极包含有一系列等电点缓冲液。
在等电聚焦过程中，电极会产生一个电场，该电场会将带有不同电荷的蛋白质分子朝向不同方向移动，最终在等电点处停留。
这样可以将蛋白质按照等电点的不同进行分离。
2. SDS-PAGE电泳：在等电聚焦完成后，将电极旋转90度，使其与等电聚焦电极垂直。
然后将电极中的蛋白质样品注入到SDS-PAGE凝胶中，并进行电泳。
在SDS-PAGE电泳中，蛋白质会在电场中移动，但由于SDS的存在，蛋白质会被完全线性化。
这样可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离。
3. 结果分析：通过电泳分离，可以得到一系列不同的蛋白质带，每个带代表一个蛋白质。
通过比对蛋白质带的大小和位置，可以鉴定蛋白质的分子量和等电点，从而确定蛋白质的特征。
蛋白质组双向电泳原理及实验步骤
胶条的平衡
冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。 配制胶条平衡缓冲液 I 。 吸去胶条上的矿物油及多余的样品。 第一次平衡。振荡15分钟。 配制胶条平衡缓冲液 II 。 第二次平衡 ，振荡15分钟。
吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。
琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓冲液。
快速
任意时间
l l l
选择所放置的胶条数。 设置每根胶条的极限电流。（30-50A/根） 设置等电聚焦时的温度。（17℃）
配制SDS-PAGE凝胶
配制 12% 的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电 泳专用梳子；或在上部留 0.5cm 的空间， 用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。 聚合30分钟。 待凝胶凝固后，拔去梳子，用MilliQ水冲 洗；或倒去分离胶表面的乙醇或水饱和正 丁醇，用MilliQ水冲洗，备用。
PDQuest软件分析（Software analysis）
质谱鉴定（Protein identification）
样品制备基本原则：
• 使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态，制 备方法应具有可重现性。 • 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而 保证待研究蛋白的可检测性。
等电聚焦的 操作
等 电 聚 焦 程 序 的 设 置
7c 1000V 4000V 4000V 慢速 快速 线性 快速
12小时（17℃） 被动水化
30分钟 60分钟 3小时 24,000伏小时 ~28,000伏小时 除盐 除盐 升压 聚焦
S5
500V 保持
蛋白质双向电泳
模块五蛋白质双向电泳1. 实验目的掌握双向电泳能根据等电点和分子量分离蛋白质的原理，第一向等电聚焦电泳（IEF）和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）操作步骤，掌握凝胶染色方法，掌握凝胶分析软件的使用，了解对分离出的特异蛋白质的进一步分析方法，了解利用电泳技术分析生物大分子的方法。
2. 实验原理从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。
目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。
这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。
双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。
在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。
第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
以电泳观点看，蛋白质最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoeletric point，PI）。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH 环境中以阳离子形式向负极移动。
如果在pH梯度环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH即可知道该蛋白质的等电点。
第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。
双向电泳实验蛋白质样品制备要点
双向电泳实验蛋白质样品制备要点双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是蛋白质组学研究中的一种常用技术。
这项技术利用蛋白质的两种特性，即等电点与相对分子量，通过等电聚焦（IEF）与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）这两项技术，将上千种不同的蛋白质分离，同时得到每种蛋白质的等电点、相对分子量和含量等信息。
这里将蛋白质样本分为两种，一种是血清样本，另一种是组织和细胞样本，分别介绍样本的制备方法。
一、血清样本的制备血清和其他生物液体中的蛋白质存在有大量的白蛋白和IgG而很难用双向电泳分离，因为这些蛋白质会掩盖凝胶上的其他蛋白，从而难以分辨血清蛋白量。
而且这些蛋白质的等电点和分子量分布范围广，会掩盖一些低分度的蛋白质，因此需要使用白蛋白和IgG清除试剂盒（使用IgG结合树脂作为清除试剂），具体步骤如下：①用移液管移取15μL人血清，放入带盖样本管中（为保证良好的树脂与样本的混合，推荐采用一次性15mL离心管）。
②在含有样本的管中加入750μL悬浮匀浆，取液前必须保证树脂匀浆为均匀的悬浮液。
③室温下在振荡混合器上混合匀浆/样本混合液3分钟，混合转速应确保混合液处于悬浮液状态。
④将微离心柱的底端折去，置于试剂盒中所配的离心管中。
⑤孵育完成时，确保树脂处于悬浮状态，然后小心地将树脂/样本混合物移入微离心柱的上层槽中。
⑥以大约6500×g离心5分钟。
⑦将含有树脂凝胶的上层槽弃去，收集滤出液。
⑧样品即可用于下一步的处理和储存备用。
二、组织和细胞样本的制备裂解不同种类的蛋白质样本应采取不同的处理和条件，裂解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质浓缩和裂解的方法，去污剂的选择以及样本溶液的组成等。
1. 破碎细胞的方法细胞破碎过程中蛋白酶可能被释放出来，并引起蛋白质的分解，使双向电泳的最后结果复杂化。
因此，应直接将样本在强变性液裂解（8mol/L尿素、10%TCA或2%SDS）来抑制蛋白酶，并且在低温下制备样品。
western-blot与蛋白质双向电泳的原理,方法及应用
增加样品溶解性的方法： ①变性剂，使蛋白质的疏水基团暴露，降低接近疏水残 基 的能量域。如尿素、硫脲等 ②表面活性剂，可溶解疏水基团，如离子去污剂SDS，非 离子去污剂NP-40及两性离子去污剂CHAPS，其中CHAPS 最好 ③还原剂，可使蛋白质展开更完全，溶解更彻底
预处理细胞 （清洗等）
破碎细胞
问：什么决定了蛋பைடு நூலகம்质能走多远？
首先明白：决定蛋白质运动快慢的是蛋白质带电 量和蛋白质的质量 那么：此处是什么起决定作用?
SDS所带电荷极多
蛋白质电荷相比之下可以忽略
按体重分电荷
III .转膜
转膜两种方法
1.半干法：
2.湿法
注意事项：
IV .封闭
封闭是什么?为什要要进行封闭？
V .杂交
缺点：二次免疫导致的非特异性条带可能影响结果
VI.显色
第
2
蛋白质双向电泳
章
实验原理
第一向：等点聚焦电泳 （IEF，isoelectric focusing）
第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
等电聚焦电泳 在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）中放入载体两性电解质，当通以直流电 时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质 放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位 置上，形成分离的蛋白质区带。
2.双向电泳技术在人类恶性肿瘤研究中的进展
人们通过双向电泳技术分离正常组织细胞与肿瘤之间的差异蛋白质组分，
在寻找肿瘤的特异标志物、揭示肿瘤的发病机制以及开发新的肿瘤治疗 方式和治疗药物提供理论依据等方面都取得了一些重要的进展。肿瘤发 生的早期常常无任何症状，而只有在转移时才容易被发现，这往往导致 延误了治疗的最佳时期。因此找到肿瘤早期的标志物进行及时的诊断和 治疗显得尤为重要。
蛋白质双向电泳实验流程
蛋白质双向电泳实验流程一．样品制备1.研磨研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。
2.加入8mLTris饱和酚（pH8.8）和8mL抽提液，在通风橱内研磨30s。
先加8mLTris饱和酚，Tris饱和酚会变成固体，此时需用研磨碓将固体的Tris饱和酚研磨成小块。
接着加入8mL抽提液，也需将固体的抽提液研磨成小块。
等三者混匀后，将粉末转移至45 mL tube。
3.振荡30min。
室温静置，待tube中固体变成液体后，开始振荡。
振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。
4.10000g，4℃，10min。
将酚相（top phase）转移至45mL tube。
酚相（top phase）可置于冰上。
酚相应该是绿色的，水相应该是淡黄色的。
5.取6mL的抽提液和6mL饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。
振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。
6.10000g，4℃，10min。
将酚相（top phase）转移至45mL tube。
7.沉淀酚相。
取一定体积（是酚相的5倍）的0.1M乙酸铵/甲醇溶液（–20℃保存）于酚相（45mL tube）。
振荡30s，–20℃培育1h或过夜。
8.清洗沉淀①15 min，20,000 g，4℃。
弃上清。
②加10mL 0.1 M乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
–20℃沉淀30min。
③15 min，20,000 g，4℃。
弃上清。
④加入10 mL乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
–20℃沉淀30min。
⑤15 min，20,000 g，4℃。
弃上清。
⑥加10mL 80%丙酮（ice-cold)，用移液器吸打。
–20℃沉淀30 min。
⑦15 min，20,000 g，4℃。
弃上清。
⑧加入10 mL 80%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。
–20℃沉淀30 min。
⑨15 min，20,000 g，4℃。
弃上清。
实验八 蛋白质双向电泳
蛋白质双向电泳【实验目的】1、学习和掌握蛋白质双向电泳的基本原理和方法。
2、了解双向电泳技术在蛋白质组学研究中的应用。
【实验原理】蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing, IEF），根据蛋白质的等电点（pI,isoelectric point）不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按蛋白质亚基分子量大小(Mr, relative molecule)进行分离。
经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
等电聚焦(IEF, isoelectric focusing)是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳，其特点是在凝胶中加入一种两性电解质载体，从而使凝胶在电场中形成连续的pH梯度。
蛋白质是典型的两性电解质分子，它在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向电场的正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。
这种泳动只有在等于等电点的pH环境中才停止。
如果在一种pH梯度的环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，那么在电场作用下，不管这一群混杂的蛋白质分子原始分布如何，各蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度相对应的位置进行聚集经过一定时间后，不同的蛋白质组分便分割在不同的区域之中。
这个过程称作等电聚焦，蛋白质聚集的部位蛋白质所带电荷为零，测定此部位的pH值，即可知该蛋白质的等电点。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），主要用于测定蛋白质亚基分子量，SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
强还原剂（DTT，二硫苏糖醇）则能使半光氨酸残基之间的二硫键段裂。
在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，分子被解聚成它们的多肽链。
解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有电荷的差异。
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选择所放置的胶条数。 设置每根胶条的极限电流。（30-50A/根） 设置等电聚焦时的温度。（17℃）
配制SDS-PAGE凝胶
配制 12% 的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电 泳专用梳子；或在上部留 0.5cm 的空间， 用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。 聚合30分钟。 待凝胶凝固后，拔去梳子，用MilliQ水冲 洗；或倒去分离胶表面的乙醇或水饱和正 丁醇，用MilliQ水冲洗，备用。
10
Fig1 上下图分别为正常大鼠和失神经大鼠腓肠肌蛋白双向电泳 图谱，右图为左图方框内的局部放大图。
应用 Application
•
双向电泳技术在病原微生物蛋白质组学研究中挥着重要作用，可 用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、 蛋白质修饰等。病原微生物的蛋白质组学研究，可以了解其毒性因子、 致病机理以及药物抗性等方面，对疾病的诊断、治疗和预防非常重要。 目前病原微生物蛋白质组学和肿瘤蛋白质组学的研究正在兴起，而 双向电泳技术是研究蛋白质组学最关键的技术之一，广泛应用于生物 医学领域的研究工作，如通过寻找差异蛋白质，发现疾病相关的蛋白 质，寻找用于诊断的疾病相关标记分子，寻找疾病相关的蛋白质药靶， 以用于药物设计，研究疾病的致病机理等。随着蛋白质组学相关技术 的发展，如液相２－ＤＥ，蛋白质芯片结合ＳＥＬＤＩ－ＭＳ技术的 应用，蛋白质组学必将得到进一步的发展，并在疾病的发病机制、诊 断和治疗方面发挥重要的作用。蛋白质组双向电泳技术为人类疾病， 特别是恶性肿瘤的早期诊断和治疗方面已显示出了广阔的前景，必将 造福于人类。
两维间的平衡
• 等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电 泳，也可于－80°保存数月。
• 但在第二向电泳前一定要进行胶条的平衡， 以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合， 从而使SDS-PAGE电泳能顺利进行。
二维SDS-PAGE
• 同普通SDS-PAGE类似。
• 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因 为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩， 可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺 胶）充当了浓缩胶。
• 考马斯亮兰染色
凝胶染色
• Bio-Safe染色
• 水洗3次，5min/
次。 • Bio-Safe染色1小
Bio-Safe染色 法
时。
• 水洗30min.
图像扫描及 软件分析
Isoelectric point
201
Molecular mass (kD) 120 100 56 38 30 20 7
pH 3-10
pH 3 - 6
pH 5 - 8
pH 7 - 10
pH 3- 6
pH 5- Narrow Range IEF
聚焦时间的优化
• 要获得高质量的图谱以及很好的试验重复性，所需的最佳 时间即为等电聚焦达到稳定态所需的时间。 • 聚焦最佳时间由不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长 度通过经验来确定。 • 聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。 • 过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性 水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋 白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。
+
pH 3 pH 7.5 pH 10
–
+
pH 3 pH 7.5 pH10
SDSPAGE
电 泳
charge
– size
第 二 向：
双向电泳实验流程
样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG strip equilibration） 第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） 凝胶的染色及检测（Detection/Staining）
胶条的平衡
冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。 配制胶条平衡缓冲液 I 。 吸去胶条上的矿物油及多余的样品。 第一次平衡。振荡15分钟。 配制胶条平衡缓冲液 II 。 第二次平衡 ，振荡15分钟。
吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。
琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓冲液。
操作
Method
双向电泳实验流程
样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG strip equilibration） 第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） 凝胶的染色及检测（Detection/Staining）
PDQuest软件分析（Software analysis）
质谱鉴定（Protein identification）
样品制备基本原则：
• 使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态，制 备方法应具有可重现性。 • 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而 保证待研究蛋白的可检测性。
胶条的转移
SDS-PAGE电泳
在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电 泳槽中。
在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的
低电流（ 5mA/gel/7cm ），待样品在完全走出 IPG 胶条， 浓缩成一条线后，再加大电流（15-20mA/gel/7cm）， 待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角 以作记号（戴手套，防止污染胶面）。
不同样品的基本处理方法
可溶性样品 固体组织样品 细胞
样品的分级处理 通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀 等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样 品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单 有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不 同进行分离。
双向电泳样品的溶解
• 是成功进行双向电泳的最关键因素之一 • 溶解的目标：
PDQuest软件分析（Software analysis）
质谱鉴定（Protein identification）
• 最高电压10,000 V • 10–25C 温度控制
• 7, 11, 17, 18, 和 24 cm的聚 焦盘，可以各放12根胶条
• 可以储存10个程序，每个程序有 10步 • 程序可进行时时编辑 • 可供选配的打印机
等电聚焦的 操作
等 电 聚 焦 程 序 的 设 置
7cm胶条
水化
S1 S2 S3 S4 250V 1000V 4000V 4000V 慢速 快速 线性 快速
12小时（17℃） 被动水化
30分钟 60分钟 3小时 24,000伏小时 ~28,000伏小时 除盐 除盐 升压 聚焦
S5
500V 保持
– 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全 破坏，从而形成各个多肽的溶解液； – 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和 核酸等物质的去除； – 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
• 溶解的手段：
离液剂、去垢剂、还原剂、两性载体电解质
Broad Range Separations
pH 3 - 10
中南大学湘雅医学院 精神卫生1201班 谓
吴所 方
• 蛋白质组（Proteome）：
在一种细胞内存在的全部蛋白质。
• 蛋白质组研究中主要应用的技术包括：
双向电泳(2-DE)、 新型质谱(MS)技术、 数据库设置与检索系统等。
原理
Theory
实验操 作
应用
Method
Application
第 一 向 ： 等 电 聚 焦