分光光度法(精)
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2.3 分光光度法
2.3.1 分光光度法概述
1.目视比色法
以比较溶液颜色深浅，从而确定被测定 组分含量的方法，称为目视比色法。 • 目视比色法的准确度和精密度受视力
条件影响很大，一般相对误差约在5％～
20％的范围。
常用的目视比色法（1）
最常用的目视比色法是标准系列法。
取一套比色管，于各管中分别加入一系列 不同体积的标准溶液，在测定条件下进行显色 定容。此时一系列标准溶液的管中显出由浅到 深的色阶。
单色器（1）
单色器的作用是获得单色光。 1、滤光片
常用的滤光片是由有色玻璃（或其他材料）构成，使通 过的光与滤光片的颜色相同。为了表示滤光片的质量，
可制作透光率－波长曲线（即透光曲线），以峰高的一
半与曲线相交波长范围（光谱半宽度）来表示单色光的 质量。半宽度愈窄，单色光愈纯。选择滤光片，必须使 能被溶液吸收最大的光通过，也就是滤光片颜色是溶液 的补色。
2.3.2.测量条件的选择（2）
（3）选择适当的参比溶液 参比溶液的作用在于用它来抵消比色 皿及试剂对入射光的反射和吸收，也可 以抵消一些有色干扰离子的影响。
2.3.2.测量条件的选择（3）
• 参比溶液的选择方法： 1、如果试液、显色剂及其他试剂都无色， 可选用蒸馏水作为 参比溶液； 2、若显色剂无色而试液中存在有色干扰物， 可用不加显色剂的被测溶液作参比溶液； 3、若试液无色而显色剂和其他试剂有色， 则可用试剂空白作参比溶液。
2. 有其他物质共存时，可选适当的入射光和参 比溶液来消除干扰，提高选择性。 3. 对于大批试样分析，校正曲线可简化手续， 提高分析速度。
2.3.2.测量条件的选择(1)
（1）选择合适的入射光 由于溶液对光的吸收是有选择性的，因此 必须选择溶液吸收最大的波长作为入射光的波 长。 （2）控制适当的吸光度范围 用光度计测量吸光度，都存在着误差。当 测量小于0.2和大于0.7吸光度时，误差会迅速 增加。为了使测量误差落在0.2～0.7之间，可 以控制试样的称取量。对于组分含量高的试样， 可减少称取量，或是稀释;对于含量低的溶液 可增加称样量或浓缩的方法来提高浓度。
单色器（2）
2. 棱镜
分光光度计常用棱镜作为单色器。棱镜 获得单色光的纯度与棱镜色散率和出口狭缝 宽度有关。可见光区用玻璃棱镜（对可见光 有较大色散率），紫外区则用石英棱镜（玻 璃吸收紫外光）。
3. 光栅，是在镀铝的光学玻璃上刻了许多相距 很小、等距又相平行，并具有反射面的沟槽 构成的一种单色器。
检测器和Biblioteka Baidu数装置 （2）
2. 光电管. 是一个二极真空管由一个阳极和一个光敏阴 极组成。 3. 光电倍增管。 是利用光敏阴极把光信号放大的装置。 4. 读数装置。 读数装置常用的是微安计或检流计。
几种类型的分光光度计（一）
图2－7 721分光光度计
几种类型的分光光度计（二）
图2－8 721分光光度计的光学系统
（1）校正曲线法
校正曲线法，又称工作曲线或标准曲线法。
当溶液厚度b固定时，吸光度A与溶液浓度c成 正比.取一系列不同浓度标准溶液（5－7图）， 分别测定其吸光度，以浓度c为横坐标，吸光 度为纵坐标，作校正曲线.试液用同样条件显 色，测定吸光度，从曲线上求得试液浓度。
（2）比较法
比较法又称单对照法。 根据两个液层厚度相同而浓度不同的同一种有色 溶液，它们的浓度与吸光度成正比：
光下进行，不符合比尔定律的试液亦可以进行
测定。
但由于经显色反应后溶液往往不稳定.标准 色阶须临时配制，故有时采用稳定的有色物质 如K2CrO7(橙色)、CuSO4(蓝色)、CoSO4(粉红色) 等配制标准色阶。
2.分光光度法
光度可用光电比色计或分光光度计进
行测量。
测定时常用的是校正曲线法或比较法。
几种类型的分光光度计（三）
图2－9 7530G紫外—可见光分光光度计
几种类型的分光光度计（四）
图2－10 7530G紫外-可见分光光度计光学系统
A标=K1c标
K1=K2,故有：
A试=K2c试
由于有色溶液性质一致，入射光波长也一致，因此
A标 /A试 =c标 /c试 故： c试＝ A试×c标/A标
采用比较法时，c标与c试必须相近，结果才可靠。
光度法的优点
与目视比色法相比，光度法的优点：
1. 用光电仪器进行测量可消除轻度色盲、眼睛 疲劳等主观误差。
2.3.3分光光度计的结构
分光光度计种类和型号繁多，但其基本结 构和原理相似，主要由下列4个部分组成： （1）光源 （2）单色器 （3）吸收池 （4）检测器和读数装置
光源
可见光分光光度法使用的光源常为6～12V 的钨丝灯，它可以发出波长约为320nm～ 2500nm的连续光谱. 若紫外光谱法，则采用氘灯，它能够产生 200～320nm的连续光谱。
检测器和读数装置 （一）
检测器和读数装置都是光电转换元件，目的是把 透过光信号转换成电流信号，并加以测量。
1、硒光电池
是一种光敏半导体元件，经常使用的是硒光电池。 硒光电池适用于波长范围380～750nm的光，在540～ 580nm处灵敏度最高。它产生的光电流较大，可毋须放 大，直接用灵敏电流计测量。 光电池使用时间过长或受强光照射时会导致灵敏度 下降，称为“疲劳现象”，故使用时须注意不可令光 源未经单色器调节便直接照射光电池，出现疲劳现象 时可放置暗处使其恢复。
被测溶液在同一条件下显色。 将被测溶液管与标准系列进行比较(从管口 垂直向下观察)，若与其中某一管颜色相同可 认为被测溶液浓度与此管浓度相等，若被测溶 液颜色介于两标准颜色之间，可认为被测溶液 浓度等于两管浓度的平均值。
常用的目视比色法（2）
这种方法设备和操作简单，液层厚，对于
很稀的溶液亦可以辨色，故灵敏度高,可在白
2.3.1 分光光度法概述
1.目视比色法
以比较溶液颜色深浅，从而确定被测定 组分含量的方法，称为目视比色法。 • 目视比色法的准确度和精密度受视力
条件影响很大，一般相对误差约在5％～
20％的范围。
常用的目视比色法（1）
最常用的目视比色法是标准系列法。
取一套比色管，于各管中分别加入一系列 不同体积的标准溶液，在测定条件下进行显色 定容。此时一系列标准溶液的管中显出由浅到 深的色阶。
单色器（1）
单色器的作用是获得单色光。 1、滤光片
常用的滤光片是由有色玻璃（或其他材料）构成，使通 过的光与滤光片的颜色相同。为了表示滤光片的质量，
可制作透光率－波长曲线（即透光曲线），以峰高的一
半与曲线相交波长范围（光谱半宽度）来表示单色光的 质量。半宽度愈窄，单色光愈纯。选择滤光片，必须使 能被溶液吸收最大的光通过，也就是滤光片颜色是溶液 的补色。
2.3.2.测量条件的选择（2）
（3）选择适当的参比溶液 参比溶液的作用在于用它来抵消比色 皿及试剂对入射光的反射和吸收，也可 以抵消一些有色干扰离子的影响。
2.3.2.测量条件的选择（3）
• 参比溶液的选择方法： 1、如果试液、显色剂及其他试剂都无色， 可选用蒸馏水作为 参比溶液； 2、若显色剂无色而试液中存在有色干扰物， 可用不加显色剂的被测溶液作参比溶液； 3、若试液无色而显色剂和其他试剂有色， 则可用试剂空白作参比溶液。
2. 有其他物质共存时，可选适当的入射光和参 比溶液来消除干扰，提高选择性。 3. 对于大批试样分析，校正曲线可简化手续， 提高分析速度。
2.3.2.测量条件的选择(1)
（1）选择合适的入射光 由于溶液对光的吸收是有选择性的，因此 必须选择溶液吸收最大的波长作为入射光的波 长。 （2）控制适当的吸光度范围 用光度计测量吸光度，都存在着误差。当 测量小于0.2和大于0.7吸光度时，误差会迅速 增加。为了使测量误差落在0.2～0.7之间，可 以控制试样的称取量。对于组分含量高的试样， 可减少称取量，或是稀释;对于含量低的溶液 可增加称样量或浓缩的方法来提高浓度。
单色器（2）
2. 棱镜
分光光度计常用棱镜作为单色器。棱镜 获得单色光的纯度与棱镜色散率和出口狭缝 宽度有关。可见光区用玻璃棱镜（对可见光 有较大色散率），紫外区则用石英棱镜（玻 璃吸收紫外光）。
3. 光栅，是在镀铝的光学玻璃上刻了许多相距 很小、等距又相平行，并具有反射面的沟槽 构成的一种单色器。
检测器和Biblioteka Baidu数装置 （2）
2. 光电管. 是一个二极真空管由一个阳极和一个光敏阴 极组成。 3. 光电倍增管。 是利用光敏阴极把光信号放大的装置。 4. 读数装置。 读数装置常用的是微安计或检流计。
几种类型的分光光度计（一）
图2－7 721分光光度计
几种类型的分光光度计（二）
图2－8 721分光光度计的光学系统
（1）校正曲线法
校正曲线法，又称工作曲线或标准曲线法。
当溶液厚度b固定时，吸光度A与溶液浓度c成 正比.取一系列不同浓度标准溶液（5－7图）， 分别测定其吸光度，以浓度c为横坐标，吸光 度为纵坐标，作校正曲线.试液用同样条件显 色，测定吸光度，从曲线上求得试液浓度。
（2）比较法
比较法又称单对照法。 根据两个液层厚度相同而浓度不同的同一种有色 溶液，它们的浓度与吸光度成正比：
光下进行，不符合比尔定律的试液亦可以进行
测定。
但由于经显色反应后溶液往往不稳定.标准 色阶须临时配制，故有时采用稳定的有色物质 如K2CrO7(橙色)、CuSO4(蓝色)、CoSO4(粉红色) 等配制标准色阶。
2.分光光度法
光度可用光电比色计或分光光度计进
行测量。
测定时常用的是校正曲线法或比较法。
几种类型的分光光度计（三）
图2－9 7530G紫外—可见光分光光度计
几种类型的分光光度计（四）
图2－10 7530G紫外-可见分光光度计光学系统
A标=K1c标
K1=K2,故有：
A试=K2c试
由于有色溶液性质一致，入射光波长也一致，因此
A标 /A试 =c标 /c试 故： c试＝ A试×c标/A标
采用比较法时，c标与c试必须相近，结果才可靠。
光度法的优点
与目视比色法相比，光度法的优点：
1. 用光电仪器进行测量可消除轻度色盲、眼睛 疲劳等主观误差。
2.3.3分光光度计的结构
分光光度计种类和型号繁多，但其基本结 构和原理相似，主要由下列4个部分组成： （1）光源 （2）单色器 （3）吸收池 （4）检测器和读数装置
光源
可见光分光光度法使用的光源常为6～12V 的钨丝灯，它可以发出波长约为320nm～ 2500nm的连续光谱. 若紫外光谱法，则采用氘灯，它能够产生 200～320nm的连续光谱。
检测器和读数装置 （一）
检测器和读数装置都是光电转换元件，目的是把 透过光信号转换成电流信号，并加以测量。
1、硒光电池
是一种光敏半导体元件，经常使用的是硒光电池。 硒光电池适用于波长范围380～750nm的光，在540～ 580nm处灵敏度最高。它产生的光电流较大，可毋须放 大，直接用灵敏电流计测量。 光电池使用时间过长或受强光照射时会导致灵敏度 下降，称为“疲劳现象”，故使用时须注意不可令光 源未经单色器调节便直接照射光电池，出现疲劳现象 时可放置暗处使其恢复。
被测溶液在同一条件下显色。 将被测溶液管与标准系列进行比较(从管口 垂直向下观察)，若与其中某一管颜色相同可 认为被测溶液浓度与此管浓度相等，若被测溶 液颜色介于两标准颜色之间，可认为被测溶液 浓度等于两管浓度的平均值。
常用的目视比色法（2）
这种方法设备和操作简单，液层厚，对于
很稀的溶液亦可以辨色，故灵敏度高,可在白