抗体酶及其应用前景

抗体酶及其应用前景

徐应容，党曦俻,石莹，周烨，顾昱晓

摘要：催化抗体也叫抗体酶，是具有催化活性的免疫球蛋白.由于它兼具抗体的高度选择性和酶的高效催化性，因而催化抗体制备技术的开发预示着可以人为生产适应各种用途的，特别是自然界不存在的高效催化剂，对生物学、化学和医学等多种学科有重要的理论意义和实用价值.综述了催化抗体研究的最新进展，讨论了该领域目前存在的问题，提出了解决这些问题的可能办法。

1．概念介绍：

1.1关于抗体：

当人体（以及其它高等动物）受到外来抗原的刺激时，其免疫系统会根据抗原的特点（抗原表面决定簇）产生特定抗体。一般来说，一种抗原可以刺激产生108种抗体，并且所产生的抗原均具备极高的特异性，即与抗原强烈结合。

1.2关于酶：

首先，酶催化具有两个特征，即高催化效率和高选择性。关于酶的催化机制，已有许多假说，但在众多观点中最有影响的是，鲍林(Pauling) 在1946年用过渡态理论阐明了酶催化的实质，即酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。他指出，酶通过某种方式与高能、短寿命的过渡态结合而起催化作用。这个过渡态构型中某些键在形成，另一些键在断裂，存在时间极短，半衰期约为10 ~10 s，实际中极难捕获。

1.3二者对比：

抗体和酶的根本不同在于前者是结合一个基态分子，并且抗原与抗体结合后会发生沉淀，一般条件下不会自动分离，而抗体选择性的结合一个化学反应的过渡态，帮助反应顺利进行，在完成反应后的瞬间与生成物迅速分离

2.背景知识：

1946年，Pauling用过渡态理论阐明了酶催化的实质，后经过Jencks等人的探索，他们发现，过渡态分子难以捕获，而过渡态类似物是能够模拟一个酶催化反应过渡态的结构的稳定物质，于是设想，只要寻找到与反应中决定性步骤的相应酶紧密结合的酶竞争性抑制剂，就等于发现了过渡态类似物；还有一种思路，就是这种类似物也能根据化学反应机制推测设计出来。然后，以过渡态类似物为半抗原，利用哺乳动物的免疫系统，诱导与其互补构象的抗体产生，这种抗体即具有催化活性；接着，Kohler和Milstein于1975年发明了具有历史意义的单克隆技术，使抗体酶的生产成为可能。

1984年Lerner进一步推测：以过渡态类似物作为半抗原，则其诱发出的抗体即与该类似物有着互补的构象，这种抗体与底物结合后，即可诱导底物进入过渡态构象，从而引起催化作用。根据这个猜想Lerner和P．C．Schultz分别领导各自的研究小组独立地证明了：针对羧酸酯水解的过渡态类似物产生的抗体，能催化相应的羧酸酯和碳酸酯的水解反应。1986年美国《Science》杂志同时发表了他们的发现，并将这类具有催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶（abzyme）或催化抗体（catalyticantibody）。

3.抗体酶的制备

3.1抗体酶的制备原则

实现抗体向酶转变的关键是抗原能诱导已具有酶活性的抗体。要使抗体具备催化活性即要使其具备酶的特征，为使抗体具有酶的结构，就必须在抗原的结构上进行改造。而抗体设计的原则就是酶的催化机制，故免疫学原理以及过渡态理论是抗体酶设计的主要依据。

酶－底物、抗体－抗原的结合模式是相近的，即均具有高亲和力和空间结构及电荷分布上的互补特性。但上述两种结合对象不同，由于抗体仅仅与低能结构结合，所以通常情况下抗体不具备催化活性。

那么，若利用某一反应过渡态的模拟物作为抗原，则可得到催化该反应的抗体。且这一过渡态类似物具有稳定结构，这样就可以用化学手段加以合成。

制备抗体酶的关键在于设计半抗原，只有这种特定的抗原才能诱导具有酶样结构与功能的抗体。

3.2制备抗体酶的主要策略

3.2.1利用抗体稳定带电过渡态

到目前为止，大多数抗体酶是通过理论设计合理的、与反应过渡态类似的小分子作为半抗原，继而让动物免疫系统产生针对半抗原的抗体来获得。由于针对半抗原的抗体在几何形状和电学性质上与反应过渡态互补，故可以稳定过渡态，加速反应。

在这方面最早设计出的催化抗体是像酯水解反应一样具有较低活化能的酰基转移反应。根据金属肽酶的研究成果并以磷酸酯作为碳酸酯的过渡态类似物，Lerner小组合成了一个含有吡啶甲酸的磷酸酯化合物作为半抗原，得到单克隆抗体6D4以催化不含吡啶甲酸的相应的碳酸酯的水解反应，使得反应速率加快近1000倍。

1990年，Shultz小组利用与底物扭曲构象相似的扭曲卟啉作为半抗原，制备出可催化卟啉金属螯合反应的抗体。

此工作不仅说明抗体结合能可扭曲底物结构，而且表明可用抗体检验催化作用机制。由于N－甲基原卟啉因内部甲基取代而呈现扭曲结构，故它是亚铁螯合酶（可催化亚铁离子插入原卟啉的生物合成的酶）的有力抑制剂，也与酶催化的卟啉金属螯合反映的过渡态类似。由于甲基卟啉的抗体可催化平面结构原卟啉的金属螯合，这就为该反应过渡态扭曲结构的作

用提供了证据。

3.2.2抗体作为熵阱

这种方法是利用抗体结合能克服反应熵垒。抗体结合能被用来冻结转动和翻动自由度，这种自由度的限制是形成活化复合物所必须的。

Jackson等合成一个有椅式构象的氧杂双环化合物来模拟有分枝酸生成予苯酸这样一个Claisen重排反应的过渡态结构

用此双环半抗原诱导的抗体可使重排反应加速10000倍。此反应加深了人们对酶作用机理种熵阱模型的理解，因为反应中不形成离子或游离基中间体，也不需要酸、碱等催化基团催化。

3.2.3抗体静电互补效应

抗体与其配体的相互作用是相当精确的。已经发现带正电的配体常能诱导出结合部位带负电残基的配体，而带负电的配体也能诱导出结合部位带正电残基的配体。抗体之所以具有高亲和力及选择性识别能力，是因为抗体与半抗原之间的电荷互补起着关键作用。

Shokat等利用抗体于半抗原之间的电荷互补性，制备了针对带正半抗原的抗体，使得在抗体部位上产生带负电的羧基，可作为一般碱基催化β－消除反应。

他们采用合成的季铵化合物H1作半抗原，获得的6株抗体，其中有4株具有催化活性，其中一个抗体43D4-3D3可加速反应100000倍。

3.3制备抗体酶的常用方法

目前，制备抗体酶较常用的经典方法就是单克隆抗体技术。此方法可大致概括为以下过程：

（注）此半抗原是与过渡态立体结构相似的模拟物。

这种方法重点在于用来作半抗原的模拟物要满足制备需要而且要稳定，只有这样才能产生与过渡态高度亲和的抗体酶。

Tsumuraga等用多种半抗原分次免疫，获得的抗体酶亲和力和催化活性均有所提高。

3.4制备抗体酶的其他方法

最近发展了几种新的抗体酶制备方法：

蛋白质工程技术：通过该技术使抗体的氨基酸残基产生定向改变，既可以直接产生酶活性，也可以对初步具有酶活性的抗体进行进一步改造，构建高活性抗体。

化学诱变法：将合成的或天然的具有催化活性的基团通过化学修饰法引入到抗体分子

中。

此外，还有相似分子诱导法、共价抗原免疫法、抗体基团组合文库法、多底物类似物法、抗体结合部位修饰法等可制备抗体酶。

4.抗体酶的应用

抗体酶的专一性和多样性使之具有很大的应用潜力，人体这一复杂的生物体，经过长时间的进化，这一灵敏的机器对任何分子几乎都可通过免疫系统产生抗体，也决定了相应的抗体酶的丰富性。

4.1抗体酶在基础研究的作用

4.1.1抗体酶在有机合成上的应用

有机反应由于其机理的复杂性，造成副反应多，产率不高，原子经济性不好，抗体酶的应用可以大大改观这一现象，由于其可以选择性的催化平行反应中的某一反应，从而大大增加产率。不对称合成是现代化学和药学的一个重要研究项目，手性合成催化生成某一特定的旋光异构体，与传统方法相比省去了手性化化合物的拆分，减少副产物的生成，更符合绿色化学的要求。抗体酶同时可使苛刻条件下的化学反应在温和条件下进行。Diels-Alders反应没有天然酶来催化,人工设计的抗体酶解决了这个问题。

Janda等描述了抗体酶在化学合成中的新应用环氧化物1可以自动环化四氢呋喃产物2，反应速度不利生成四氢呋喃产物3。利用抗体酶技术设计生成半抗原4模拟环氧化物1的不利的6-内-四面体型闭环反应，从而通过稳定这一过渡态，使反应的不利产物3的比例升高。

催化抗体的不同类型的反应越来越多，抗体酶溶于反向胶束，其固定化形式在有机溶剂中起作用，从而为其商业用途开辟了广阔的前景。

4.1.2抗体酶阐明化学反应机制

Pauling于1946年提出：酶催化化学反映的原理在与酶与高能的过渡态结合，从而大大的降低反应的活化能。酶抑制剂的研究支持了Pauling过渡态理论，但它只能提供作用过程中结合专一性的信息，不能给出结合后发生催化反应以及结合与催化之间的关系。抗体酶实验则弥补了这一缺陷。利用过渡态模拟物法得到的抗体酶具有相当的反应活性和较好的催化效果也是对Pauling理论的最直接、最有力的证实。N-甲基原卟啉由于内部甲基的取代而成扭曲的结构，但其作为半抗原诱导产生的抗体酶可催化原卟啉的金属螯合反应，也就证明了亚铁螯和酶催化亚铁离子插入原卟啉的反应过渡态是原卟啉的扭曲结构及平面的卟啉只有经过扭曲以后才能螯合亚铁离子。

4.2抗体酶在临床医学上的应用

抗体酶的高度专一性可由于药物对靶细胞的定位，临床应用时可减少药物对正常细胞的损害，达到更好的疗效。目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗（ADEPT）技术，即将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶就会

将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物，从而提高肿瘤细胞局部药物浓度，增强对肿瘤的杀伤力，达到提高肿瘤化疗效果的目的。当然交药只能被抗体酶水解而不能被内源性酶水解，抗原还要尽量减少免疫原性 。Campbell用半抗原3诱导产生的抗体酶能水解5FdU的前体化合物1时至转变为2，抗癌药5FdU在体内可转变为5FdUMP,它是胸苷酸合成酶的抑制剂，能抑制DNA的合成，而5FdU不但抑制肿瘤细胞的DNA的合成，同时影响正常细胞，高毒性。5FdU 的前体化合物1无毒，给药后化合物遇到抗体酶才释放出有毒的5FdU,杀死癌细胞。设想用此抗体酶与肿瘤专一性抗体偶连成双特异性抗体，从而开发成特异性抗癌药物，避免了化疗缺乏专一性而产生的高毒性、半寿期短以及达肿瘤细胞的化疗药物低等缺点。

抗体酶可应用于定量分析。酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay ELISA）是将酶作为标记物质，使之和抗原（或抗体）结合形成酶与抗原（或抗体）复合物，然后再根据待测抗体（或抗原）与复合物专一且定量的结合关系，通过测定待测抗体（或抗原）结合的标记酶活力，从而计算出抗原或抗体的量。

5.现阶段存在的问题及解决策略

现阶段制备抗体酶主要存在两个问题：

第一，抗体酶的催化能力不强。

由传统方法合成的抗体酶，其催化能力一般为天然酶的千分之一。主要原因有三个：

1、结构复杂程度不同

抗体酶的结构简单，只是由两条轻链和两条重链连缀而成，而天然酶结构复杂，其空间结构能更好地和底物匹配，催化反应。

2、制备方法问题

根据抗体酶对话的动力学模型：

Ab + S ==== Ab + S* ==== Ab + P

K m

K i

K Ab

Ab·S ==== Ab ·S* === Ab + P

其中，Ab——抗体

S——底物

S*——过渡态底物

P——产物

K m——Ab与S结合的解离平衡常数（米氏常数）

K i——Ab与S*结合的解离平衡常数（抑制常数）

K Ab、K N——分别表示有抗体或无抗体催化条件时的速度常数

则抗体酶存在时的转换速率与抗体酶不存在时的转换速率之比：

K cat/K uncat = K m/K i

而K m的值波动不大，故影响催化效率的主要是K i。

所以，抗体酶的催化效能，主要取决于和底物过渡态的亲和力大小。

由于反应的过渡态是一个非常不稳定的状态，很难获得，所以在诱导抗体酶的时候采用人工合成的过渡态类似物。这种类似物显然不能和过渡态一模一样，它们在形状、电性、键长、键角、极性等方面都会存在差异。所以由类似物诱导产生的抗体酶和过渡态的结合就没有那么紧密。而抗体酶的催化效能也就不高。事实上，Lerner小组在诱导可以催化酰胺水解的抗体酶时，设计了磷酰胺类半抗原。结构得到的却是催化胺与羧酰酯合成反应的抗体酶。而天然酶经过几百万年的进化，可以和底物完美地结合。所以，用过渡态类似物诱导产生抗体酶这个方法本身就决定了抗体酶的催化活性不如天然酶。

针对这个问题，人们提出了一些改进的方法：

1、以底物修饰物为半抗原

按照Menger的酶催化理论，酶催化反应，一种作用是稳定过渡态，另一种作用是使底物的反应部位活化，即不稳定。因此，在酶的某个地方加入可以对底物产生附加引力的基团同样可以提高抗体酶的催化效能。事实上，对于某些酶，是底物的反应部位不稳定是其主要的催化机理。在此基础上，一种新的方法诞生。该方法以底物修饰物为半抗原，产生抗体酶后由化学方法将具有催化活性的基团引入。该方法取得了很好的效果。以谷胱甘肽的各种修饰物为半抗原诱导出来的抗体酶，经化学诱变在抗体上引入催化基团后，产生的抗体酶的活力甚至超过了天然兔肝谷胱甘肽过氧化物酶的活力。

2、修饰法

修饰法包括化学修饰法和遗传修饰法，既用化学合成的方法或者用蛋白质工程的方法定向改变抗体酶的氨基酸组成，以提高抗体酶和过渡态的结合能力，从而达到提高催化效果的作用。有趣的是，在实际中，由蛋白质工程定点突变抗体酶这种方法主要用来研究抗体酶中起关键作用的氨基酸是哪一个，因为人工突变后的抗体酶活性一般会降低，而且会降低很多。

而化学修饰法的主要应用是用化学方法把抗体酶固定在如玻璃等介质上或固定在反向胶团中，这样固定化的酶稳定性大大提高，在溶液中不易失活，使抗体酶的应用范围大大增加。

3、多种半抗原综合应用

即用多种过渡态类似物连续免疫动物，而后多次杂交。每种类似物总有一部分和半抗原过渡态相同，所以这样得到的抗体酶就能更好地和过渡态结合，其催化性能也就优于单一相似物所诱导的抗体酶。

第二，抗体酶的存在率低，制备过程费时费事且价格昂贵。

新的方法也从一定程度上解决了这个问题。主要的解决方法如下：

1、抗体库法

即用基因克隆技术将全套抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段。这样可以省去用单克隆抗体制备时细胞融合的步骤，省时省力，而且可以从易于培养的原核生物中得到大量的，甚至在真核细胞中不存在的特异性抗体。

2、直接筛选法

传统的筛选法是通过筛选出具有亲和力的抗体，但具有亲和力的抗体并不是都有催化作用，具有催化作用的抗体只是其中很少的一部分。而直接筛选法，即直接筛选出有活力的抗体。如用硫化物筛选出可以和它共价结合的抗体；或者用抗体感染相应的缺陷型的微生物，而抗体正好能弥补这种缺陷，通过筛选出不再有缺陷的微生物而筛选出有活力的抗体。

6.结语

抗体酶的出现，为人们根据自己的需要设计酶开辟了一条道路。它应用的抗体的多样性和酶的专一性，把本来独立、各司其职的两种事物相结合，是一种伟大的创造。虽然现在抗体酶的各种性能还不尽如人意，技术还不是特别成熟，离大规模的应用还有一定的差距。但我们相信，随着一代又一代人的努力，总有一天，抗体酶会走近我们的生活，在各个领域发

挥它的神奇功效。

参考文献：

1．罗贵民《酶工程》北京：化学工业出版社，2002．2

2．周晓云《酶学原理与酶工程》北京：中国轻工业出版社，2005．8 3．陈苏婷《抗体酶的研究进展》

4．张今《分子酶学工程导论》北京：科学出版社，2003.8