2014-5-6 PI法细胞周期检测

细胞周期检测（PI法）

一、实验方法原理

细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。

流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。

细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光

强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

细胞周期示意图如（图一）所示

（图一）

二、材料及准备工作

1.材料准备

试剂、耗材名称品牌货号

细胞培养瓶corning

6孔板corning

10ml离心管国产

1.5ml EP管国产

胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括

RNase-A 贝博试剂盒中包括

PI 贝博试剂盒中包括

无水乙醇国产

PBS 自配

2. 试剂配制

10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）

以1L量为例：

NaCl 80g

Na2HPO4·12H2O 32.3g

NaH2PO4·2H2O 4.5g

（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）

加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。使用时用去离子水稀释成1XPBS

3.仪器设备

流式细胞仪；细胞培养孵箱；离心机；水浴；冰箱；离心管；封口膜；移液器

三、实验步骤及注意事项：（采用贝博公司的细胞周期检测试剂盒）

1.细胞样品的准备：

①单次流式细胞仪检测，1份样品细胞数量约106（我校8楼免疫教

研室的要求）

②收集细胞培养液备用。

③用胰酶（无EDTA）消化细胞，至细胞可以被轻轻用吹打下来时，

加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。

④将细胞悬液收集到10ml的离心管内。800g左右离心5min，沉淀

细胞。小心吸除上清，残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。

⑤加入1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞， 800g×5min。为减少细胞

损失可用1.5ml离心。

⑥再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，残留约20ul左右的PBS，以避免吸走细胞。重复第5步操作，用预冷的PBS再次洗细胞，并离心收集细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团，用250ul预冷的PBS重悬细胞。

2. 细胞固定：

缓慢加入750ul冰浴预冷无水乙醇，轻轻吹打混匀，4℃固定2小时或-20℃固定1小时，封口膜封口（此步可停止，-20℃保存样品，1周内样品检测不受影响）。

3. 染色：

①1000g左右离心3-5min，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约

50ul左右的70%乙醇，以避免吸走细胞。

③加入约1ml冰浴预冷的PBS，洗涤细胞一次。再次离心沉淀细胞，

小心吸除上清。

④用200ul预冷的PBS重悬细

⑤加入Rnase A溶液20ul，37℃水浴30min。

⑥每管细胞样品中加入400ul碘化丙啶染色液，缓慢并充分混匀后

4℃避光孵育30 min。染色完成后宜在24h内完成流式检测。

⑦. 流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红

色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

注意事项

1.RNaseA用PBS配制，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。试剂

盒中带有配制好的酶。

2.流式分析时需要的是单个细胞悬液，因此在操作过程中充分混悬细

胞。

3.固定过程中不直接加70%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。

3. PI液体4℃避光保存。

FlowJo分析细胞周期数据的过程

1.把细胞周期样品拖入FlowJo软件，双击打开原始数据。如(图二)

所示：

(图二)

X轴选择FSC,Y轴选择SSC。分析细胞周期的细胞选择上图所示的细胞群体进行分析。

2. 在SSC/FSC图中双击分析的细胞群体，如（图三）所示：