2014-5-6 PI法细胞周期检测
细胞周期的检测方法
1、收集样本细胞，细胞数量在 10X105 个以内。 1、 用冷 PBS 洗涤细胞两次。 2、 75％冰冻乙醇-20℃固定 1 小时或 4℃固定过夜。 3、 用冷 PBS 洗涤细胞一次。 4、 用 200-500ul 冷 PBS 重悬细胞。 5、 加入 Rnase A 溶液 20ul 37℃水浴 30 分钟。 6、 400 目筛网过滤。 7、 加入 400ul 染液，轻轻混匀后 4℃避光孵育 30 分钟-1 小时。 8、 流式检测结果。最大激发波长为 488nm。
BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133
产品说明书
JC-1 线粒体膜电位试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒 Caspase 8 活性检测试剂盒 Caspase 9 活性检测试剂盒 Caspase 10 活性检测试剂盒 细胞凋亡形态学检测试剂盒 Rhodamine 123 染色试剂盒
参考文献：
● 马玉樊 卢婷利等. 中国细胞生物学学报,
二氢青蒿素对人成骨肉瘤 MG-63 细胞凋亡的诱导作用. 2011, 33(12): 1324–1330
● 张春晶 顾立刚等. 黄芩苷干预甲型 H1N1 流感病毒感染诱导的 A549 细胞周期分布及凋亡. 病毒学报, 2011, 2.
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产品 Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒
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本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
期其 DNA 含量不同从而结合的荧光染料不同，流式细胞仪检测的荧光强度也不一样来检测 细胞周期。
细胞发生凋亡时，由于胞浆和染色质浓缩、核裂解，产生凋亡小体，使细胞的光散射性 质发生变化。在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对 90°角光散射 的能力增加或没有变化。在细胞凋亡的晚期，前向角和 90°角光散射的信号均降低。因此 可通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化观察凋亡细胞。用 PI 对细胞进行染色，凋亡细胞 由于总 DNA 量降低，于正常 G0/G1 细胞群前出现一 DNA 低染细胞群，即 G1 峰前出现亚 二倍体峰（sub-G1），细胞凋亡群。
全程服务（六）流式细胞仪周期检测
全程服务（六）流式细胞仪周期检测大家总是想让自己的实验数据有不动声色的高级感，流式细胞仪检测就是细胞生物学的必备高级技能。
周期实验是检测药物、基因或蛋白对细胞周期影响的一种检测方法，具体要怎么做呢？且听我道来。
实验原理细胞周期（Cell Cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。
细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。
表1 细胞周期细胞周期特征间期G1期DNA合成前期S期DNA合成期G2期DNA合成后期分裂期M期有丝分裂前、中、后、末期G0期分裂结束后暂时离开细胞周期流式细胞仪用PI染色法检测细胞周期。
由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而 G2/ M期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。
PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。
因此,通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0 期，S期和G2/M期，获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过软件计算各时相的细胞百分率（如图1所示）图1 流式周期检测图说明技术应用检测异倍体的肿瘤细胞，检测药物、基因或蛋白等对细胞周期的影响。
实验步骤1. 细胞收集：取对数生长期的细胞，按1×106cells/ ml以1 ml接种24孔板或2 ml接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，用常规胰酶消化并收集于离心管中，然后用PBS洗涤细胞2-3次，制备成单细胞悬液。
2. 细胞固定：1000 rpm离心5 min，收集细胞沉淀，弃上清，用PBS洗涤两次后加入250 µl PBS使细胞重悬，再逐滴加入750 µl预冷的无水乙醇（-20℃），使其终浓度为75% 4℃放置过夜固定。
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI法)
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI法)产品简介：Leagene细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一种采用经典的碘化丙啶染色(PI staining)方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种可以嵌合到双链DNA和RNA的碱基对中与直接和的荧光染料，无碱基特异性。
碘化丙啶与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。
细胞内的DNA被Propidium Iodide染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。
碘化丙啶染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组DNA片断在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。
细胞凋亡时，流式细胞检测可呈现亚二倍体核型的特征，根据光散射的特点，PI染色可以区分细胞凋亡和细胞坏死的细胞峰型。
细胞凋亡时，出现凋亡细胞皱缩、染色质浓缩、核碎裂，产生凋亡小体，使细胞的前向光散射低于正常。
在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对侧向光散射的能力增加或没有变化。
在细胞凋亡的晚期，前向和侧向光散射的信号均降低。
细胞坏死时细胞多表现为细胞肿胀，因此前向光散射高于正常，对侧向光散射高于正常。
Leagene Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit经常用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测，亦可用于区分细胞凋亡和细胞坏死。
流式细胞仪应用——利用PI检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)
流式细胞仪应用——利用PI检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis) 本文主要讲述PI单染检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)PI（碘化丙啶）染色特点：一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合，二是不能通过功能正常的完整细胞膜。
基于以上特性，目前主要有两大方面的应用，配方也不同：细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)一方面的应用是检测细胞周期，检测细胞周期时，为了保证所有的细胞都能染上PI，因此要将细胞用乙醇固定，并加入Triton X-100 ，以增加膜的通透性；同时由于DNA使细胞的粘附性增大，加入EDTA以降低细胞粘附性；为了消除RNA的干扰，要加RNAase。
由于要鉴定DNA含量，因此PI染料必须过饱和，所以PI终浓度很高，一般50ug/mL。
由于晚期凋亡细胞DNA断裂形成亚二倍体峰，因此可同时检测凋亡。
另一方面的应用是检测膜通透性（凋亡），由于PI不能进入完整的活细胞膜，因此一般认为PI染色阳性的细胞是死细胞。
Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒中就是这种染液，它的作用是鉴定死细胞，从而与凋亡细胞区分开来。
它的配制就是将PI溶于PBS，终浓度较低，一般2.5ug/mL。
所需试剂：1、PI染液：用于检测细胞周期的PI配制如下：方法一：10×PI配制方法,用时用PBS稀释至工作液：5mg-----PI0.1ml---Triton X-1003.7mg--EDTA10ml----PBS2、RNaseA——2mg方法二,直接配制PI工作液：PI -----5mgRNaseA——2mg1.0%Trition X-100——0.25ml枸椽酸钠——100mg生理盐水——65ml调pH值至7.2-7.5加蒸馏水至100ml, 棕色瓶分装，保存在4℃操作步骤1.细胞培养铺细胞至6孔板或者35mm培养皿，约4－5*10e5 cells/well, 如果要加药物，在此时可以加以不同种或不同浓度的药物。
细胞周期测定实验具体步骤及详细说明
细胞周期测定实验具体步骤及详细说明
体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。
它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。
分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。
具体步骤
一、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。
二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。
三、取出盖片，按下列顺序操作：
PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。
四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。
五、计算
分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%
操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。
Giemsa染液配制
称Giemsa粉末0.5 g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33 ml）。
56℃中保温90-120分钟。
加入33 ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。
使用时按要求用PBS稀释。
一般稀释10倍。
细胞周期测定实验
细胞计数法：实验方法原理体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。
它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。
分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。
实验材料细胞试剂、试剂盒胰酶甲醇培养液冰醋酸Giemsa染液仪器、耗材CO2培养箱普通显微镜培养皿盖玻片吸管实验步骤一、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。
二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。
三、取出盖片，按下列顺序操作：PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。
四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。
五、计算分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%展开注意事项1. 操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。
其他一、Giemsa染液配制称Giemsa粉末0.5 g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33 ml）。
56℃中保温90-120分钟。
加入33 ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。
使用时按要求用PBS稀释。
一般稀释10倍。
BrdU参入法实验方法原理细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。
从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。
细胞周期反应了细胞增殖速度。
单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。
BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。
如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。
细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。
计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。
实验材料细胞试剂、试剂盒BrdU 甲醇冰醋酸Giemsa染液秋水仙素SSC 柠檬酸三钠NaCl仪器、耗材冰箱玻片水浴锅锅盖紫外灯光学显微镜实验步骤一、试剂配制1. BrdU配制BrdU 10 mg加双蒸水10 ml ，4℃下避光保存。
细胞实验技术之细胞周期检测
细胞实验技术之细胞周期检测导读细胞周期是指细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的时间，它代表着生命从一代向下一代传递的连续过程，与前几期我们介绍过的细胞学实验（细胞增殖、克隆形成等）一样，细胞周期也是评价细胞增殖功能的重要实验。
流式细胞仪是检测细胞周期最常用的方法，然而我们会碰到细胞量不够、细胞碎片太多等原因，导致实验一次次重复，本文就一起看看如何把细胞周期的数据变的更加漂亮，准确！一、细胞周期简介主要分为以下2大过程：1.分裂间期：间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）；2.分裂期M期：细胞分裂期，指细胞分裂开始到结束。
细胞周期图（来自网络）•注：G0期是指某些细胞在分裂结束后会暂时离开细胞周期，停止细胞分裂；但在一定适宜刺激下，又可进入周期；•因为分裂间期持续的时间远远比分裂期持续时间长，在一个正常细胞周期中，分裂间期时间会占整个细胞周期的90%～95%；•不同类型细胞的G1期时间长短不同，所以其细胞周期时间存在差异。
如：人类胃上皮细胞为24小时，骨髓细胞为18小时，HeLa细胞为21小时。
二、常用的实验方法细胞周期常用检测方法有流式检测法、BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)掺入法及同位素标记法等，其中流式检测法因适用于大量样品检测，可快速分析单个细胞的多种特性，是目前最为常用的测定细胞周期的一种方法，下面就详细介绍如何利用流式细胞仪进行周期分析。
1. 流式检测的实验原理由于细胞周期各时相的DNA含量不同，因此，可通过特异性与DNA结合染料来检测细胞内的DNA含量来测定细胞周期。
流式中常用碘化丙啶(Propidium，简称PI)与DNA结合，其荧光强度与DNA 含量成正比。
因此，通过流式细胞仪对细胞内DNA含量进行检测，同时获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。
2. 流式细胞仪的实验步骤A. 收集细胞取适量的对数生长期细胞接种于6cm中，在相应的条件下（如药物）处理相应时间后，倒去培养基，用胰酶适度消化细胞，离心收集细胞，弃去上清；Tips:•细胞数量：一般情况下，由于在细胞周期中分析的细胞数应达到1.0*104~3.0*104才具有统计学意义。
组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一--PI法
组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法schoman无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。
主要操作步骤如下：1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。
2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。
3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。
4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h。
5、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。
注意事项：1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。
如组织难以消化，可加入适量胶原酶。
另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。
2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。
3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。
4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。
其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。
在此不赘述。
yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA 结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。
应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。
偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。
细胞周期检测点简介
2019/2/22
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细胞周期检测点的特点及作用机制
检测点类型
未复制-DNA检测点
作用特点
监控DNA复制，决定细胞是否 进入M 期
监控纺锤体组装，决定细胞是否 进入后期
Байду номын сангаас与作用相关的主要蛋白质
ATR、Chl1、 Cdc25、 cyclinA/B-Cdk1
纺锤体组装检测点
Mad2、APC、securin
2019/2/22 9
S期检验点
2019/2/22
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G2期检验点
• DNA复制结束，细胞周期由S期进人G2期， 并准备进行细胞分裂。当DNA复制尚未完 成时，M期激酶的活性不能表现出来。G2 期检验点的功能是阻止带有DNA损伤的细 胞进入M期，确保细胞基因组的完整性和稳 定性。这是一个复杂的信号转导网络，涉 及多种分子的相互作用，ATM／ATR— CHK2／CHK2一CDC25C—CDC2是主要 的转导途径。
2019/2/22
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正常分离才能通过染色体分离检测 点进入末期
• Cdc14磷酸酶的活化-促使M期cyclin经多聚 泛素化被降解-致MDF活性丧失-引发细胞进 入末期
2019/2/22
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DNA损伤检测点DNA损伤后的修复
• 损伤-激活-活化蛋白激酶Chk2-磷酸化 Cdc25磷酸化-经多聚泛素化被降解
2019/2/22 12
未复制DNA检测点保证分裂必须发 生于DNA复制之后
• 识别未复制DNA并抑制MPF激活 • ATR、Chk1 • ATR磷酸化-Chk1激酶-Chk1磷酸化Cdc25 磷酸酶-使抑M期Cdk磷酸基不被去除-c yclinA/B-Cdk1复合物保持被抑制状态-不能磷 酸化启动M期的靶蛋白
PI单染流式细胞术检测细胞周期
1.消化：将细胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化1-3min，（时间尽可能长，以减少吸管吹打），待消化充分，弃去胰酶，加入PBS5ml。
2.收集细胞：吸管吹打，移入离心管。
3.低速度离心：1000转5min弃去上清。
4.反复漂洗离心：加入PBS5-8ml，低速离心，同上步，重复3次，以除去细胞碎片。
5.获得单细胞悬液：加入1mlPBS，调整单细胞悬液至1-5*10^6/l，吸管吹打，制成单细胞悬液，4度保存。
6.PI染液制备：100ml去离子水加入5mgPI。
调PH值7,2-7。
4度棕色瓶保存。
4度避光保存。
7.、加入-20度预冷的乙醇。
4度过夜。
8.1000转5分钟离心弃去上清，
9.加入3mlPbs重悬。
10.1000转5分钟离心弃去上清，
11.加入100ulRNA酶37度水浴孵育30min
12.加入500ulPI染液4度避光孵育30min
13.上机前轻弹试管，，设立PI单染细胞组，检测。
PI单染细胞周期检测-protocol(mo--new)
PI单染检测细胞周期操作步骤：1、铺板：5×105 cells/ml，六孔板，每孔1ml。
2、血清饥饿法进行细胞同步化处理：无血清培养基培养8-12h，然后才加药。
注意：实验细胞应处于对数生长期，而不能是完全长满，一般在50～80％比较好。
自然状态下，不增殖的细胞应该处于G0/G1期。
周期特异性药物阻滞哪一期，哪一期就升高，不会使其他阶段细胞增多。
3、收集细胞悬浮细胞：直接离心收集细胞，弃上清，在4 ℃、1200rpm用预冷的PBS洗细胞2次；贴壁细胞：a.将上清转入离心管（其中含有脱落的凋亡细胞）b.PBS冲洗液c.不含EDTA的0.25%的胰酶消化1-5min后，将细胞吹打成单细胞悬液将a、b、c合并后1200rpm离心5min；弃上清；用PBS清洗一次，再次弃上清，加入1.5ml PBS重悬细胞；注：为了既保持初始条件相同，又可搜集到足够的细胞，可选用多孔培养板；在搜集细胞时，浓度大、抑制强的组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。
4、固定：将细胞悬液加入预冷（-20℃）无水乙醇3.5ml，使乙醇终浓度为70%，4℃固定过夜。
注意：（1）加入无水乙醇的时候要逐滴、慢速；（2）不是向细胞中加70%乙醇，而是向细胞悬液中加无水乙醇，这样是为了减少细胞聚集；（3）在染色之前细胞4 ℃固定可保存3周；5、离心收集细胞：以预冷（4℃）PBS洗细胞一次，调整细胞浓度≧1.0×106；6、PI综合染液：弃上清，在106细胞中加入0.5ml综合染液，重悬细胞后37 ℃水浴30 min。
PI stocking solution:5mg PI+5ml PBS--------混匀于15ml避光离心管RNase A stocking solution: 10mg +1ml PBS--------混匀于1.5ml避光离心管Triton X-100:0.5ml+25ml PBS--------混匀于50ml避光离心管注：（1）RNase A于－20 ℃保存，其它4℃保存并避光；（2）Triton-X-100（曲拉通）主要是通透细胞膜使PI能进入细胞核，提前两小时配，难溶；（3）在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI易透过细胞膜和核酸结合，为避免干扰染色前需用RNAse A降解RNA。
PI染色检测细胞周期试验步骤
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染色检测细胞周期：protocolPI）消化收集对数生长期细胞（加热处含EDTA1、收集细胞：胰酶（*6个），吸取旧10理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×（根据培养皿大小决定量，PBS培养基到一个新离心管里；少量常温也要收集到上述离PBSPBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的然后胰酶消化心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；而不是成片脱落）显微镜下观察细胞呈单个，（注意一定要消化完全，后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀。
PBS清洗细胞两次。
2、用预冷的重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮预冷的PBS3、固定细胞：用0.5ml乙醇终无水乙醇(1.2ml预冷的99.7%成单细胞，再将重悬细胞加入浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定至过夜。
2H1.84、细胞染色：离心（1000r/300g）收集固定的细胞，以5min才把细胞离mL的7000rpm(第一次实验时用PBS 洗细胞一次，离心1再次获取细胞沉淀后加入但最后流式结果显示细胞没有碎)心下来，30避光染色lPI，最后加入400μ30minlRNaseA00μ于37℃水浴℃均可）min（常温或4P用染色剂（据样本数，500uL 【有的试剂盒说明是：每个样本加入Triton 、A PI BS临时配好总量，其中50ug/ml、RNase 100ug/mL 染色30分钟】避光4）X-100
0.2% ℃、流式分析52
/ 1
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结果用细胞万个细胞，2-3以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数
去FL2-A显示，和使用分析。
周期拟和软件ModFit分析时，FL2-w 除联体细胞。
2
/ 2。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤流式细胞仪是一种能够对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。
在细胞生物学研究中，流式细胞仪常用于检测细胞周期，这对于了解细胞的增殖、分化和凋亡等生理过程具有重要意义。
以下是流式细胞仪检测细胞周期的详细操作步骤：一、实验前准备1、细胞培养选择处于对数生长期的细胞进行实验，以保证细胞状态良好且增殖活跃。
根据细胞类型和实验要求，在合适的培养条件下培养细胞。
2、试剂和材料70%乙醇：用于固定细胞。
碘化丙啶（PI）染液：用于染色细胞核中的 DNA。
RNA 酶：用于去除 RNA 对染色的干扰。
磷酸盐缓冲液（PBS）：用于洗涤细胞。
流式细胞仪专用的上样管。
3、仪器设备流式细胞仪，并确保仪器处于正常工作状态，包括光路校准、液流系统稳定等。
离心机：用于离心细胞。
二、细胞收集1、当细胞培养达到所需的密度和状态时，小心吸出培养基。
2、用 PBS 轻轻洗涤细胞两次，以去除残留的培养基和杂质。
3、加入适量的胰蛋白酶或其他细胞解离试剂，将细胞从培养容器表面解离下来。
4、加入含有血清的培养基终止胰蛋白酶的作用，防止过度消化细胞。
5、将细胞悬液转移到离心管中，离心（一般 1000 1500 rpm，510 分钟），使细胞沉淀。
三、细胞固定1、弃去上清液，留下细胞沉淀。
2、缓慢加入预冷的 70%乙醇，边加边轻轻涡旋或吹打细胞，使细胞充分分散在乙醇中。
乙醇的最终浓度应在 70%左右。
3、将细胞在 4°C 下固定至少 1 小时，可固定过夜以确保固定效果。
四、PI 染色1、离心固定后的细胞，弃去乙醇。
2、用 PBS 洗涤细胞两次，以去除残留的乙醇。
3、加入适量的 RNA 酶溶液，在 37°C 水浴中孵育 30 分钟，以去除 RNA 对染色的干扰。
4、加入 PI 染液，使其终浓度达到合适的范围（通常为 50 100μg/mL），在室温下避光孵育 30 分钟。
细胞周期的流式检测方式技巧
细胞周期的流式检测方法细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为G0/G1期、S期、G2/M期。
在科研实践中，很多实验具有对细胞群体的周期分布进行检测的需求。
细胞群体周期测定的方法有很多种，最常用的是PI（碘化丙啶）渗入DNA进行染色，然后通过流式细胞仪检测PI从而测定细胞群体的周期分布。
因此，下面笔者主要通过BD（Becton＆Dickinson）公司生产的BD FACSCalibur流式细胞仪测定PI标记的细胞群体为例，对细胞周期的流式检测方法进行阐述。
一、PI染色步骤概略1、单细胞悬液离心，1500rpm , 5min，弃上清。
2、PBS 1ml离心，弃上清。
3、70%酒精2ml，4℃，30min，离心，弃上清液。
4、PBS 1ml离心，弃上清。
5、RNase A的PBS溶液(20ug/ml)，500ul，37℃，30min，离心弃上清。
6、PBS 1ml离心，弃上清。
7、PI的PBS溶液(50ug/ml)，500ul，室温避光孵育30min。
8、吹打混匀，300目筛网过滤至流式管中，4℃保存，待测。
二、Calibur仪器设置及数据收集1、依次打开Calibur机器电源、电脑开关和CellQuest Pro软件，按快捷键Command+B连机，按快捷键Command+1、2、3、4调出Detectors/Amps面板、Threshold面板、Compensation 面板和Status面板，软件的操作界面如图1所示。
图1. Cell Quest Pro软件操作界面2、建立实验模板，包括FSC/SSC散点图、FL2-W/FL2-A散点图和FL2-A直方图。
因为PI 在Calibur上是由488nm的激光器激发，530/30滤光片收集信号，所以选择FL2通道进行检测。
细胞周期是2N和4N的循环，所以FL2通道的Mode参数应设置为Lin模式，同时阈值（Threshold）的Primary Param参数设置为FL2-H，Four Color DDM Param参数设置为FL2，如图2、图3所示。
细胞周期检测
生化与分子生物学研究所黄永业细胞周期测定细胞周期（cell cycle）是指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程。
在这个过程中，细胞遗传物质复制并加倍，且在分裂结束时平均分配到两个子细胞中去。
细胞周期又可以分为间期（interphase）和有丝分裂期(M phase)，细胞间期又常划分为休眠期（G0）,DNA合成前期（G1），DNA合成期（S），DNA合成后期（G2），整个周期可表示为G1→S→G2→M。
DNA周期检测可用来反应细胞周期的各个期的状况，即细胞增殖状况。
利用细胞内DNA能够和荧光染料（如碘化丙啶--PI）结合的特性，细胞各个时期其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同，流式细胞仪检测的荧光强度也不一样。
细胞发生凋亡时，由于胞浆和染色质浓缩、核裂解，产生凋亡小体，使细胞的光散射性质发生变化。
在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对900角光散射的能力增加或没有变化。
在细胞凋亡的晚期，前向角和900角光散射的信号均降低。
因此可通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化观察凋亡细胞。
用PI对细胞进行染色，凋亡细胞由于总DNA量降低，于正常G0/G1细胞群前出现一DNA低染细胞群，即G1峰前出现亚二倍体峰（sub-G1），细胞凋亡群。
一、实验步骤1．用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组，并收集细胞：2000rpm离心5min，去上清；（即一种细胞收集两管）2．用PBS洗涤细胞一次，2000rpm离心5min，去除上清；3．用体积分数为70％冷乙醇固定，4℃保存（2小时至过夜）；（先加入200μL PBS，然后在涡旋状态下，逐滴加入500无水乙醇，一般-20℃过夜）4. 2000rpm离心5min，去除固定液；5. 用1ml PBS制备细胞悬液，用200目筛网过滤一次；6. 2000rpm离心5min，去除上清；7．加100μL RNase A 37℃水浴30min；8．加入400μL PI染色混匀，4℃避光30min；9．上机检测，记录激发波长488nm 处红色荧光。
细胞周期测定方法
细胞增殖是生命的基本特征，种族的繁衍、个体的发育、机体的修复等都离不开细胞增殖。
一个受精卵发育为初生婴儿，细胞数目增至1012个，长至成年有1014个，而成人体内每秒钟仍有数百万新细胞产生，以补偿血细胞、小肠粘膜细胞和上皮细胞的衰老和死亡。
细胞增殖是通过细胞周期（cell cycle）来实现的，而细胞周期的有序运行是通过相关基因的严格监视和调控来保证的。
细胞无限制增长对个体来说意味着癌症，个体无限制繁殖对地球来说意味着灾难。
一个大肠杆菌若按20分钟分裂一次，并保持这一速度，则两天即可超过地球的重量。
第一节基本概念一、什么是细胞周期细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。
可分为四个阶段（图13-1）：①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期，只有在这一时期H3-TDR 才能掺入新合成的DNA中；③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
图13-1 细胞周期可划分为四个阶段从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。
②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。
③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。
细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人了成纤维细胞18小时，CHO 细胞14小时，HeLa细胞21小时。
不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。
二、细胞周期时间的测定标记有丝分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM）是一种常用的测定细胞周期时间的方法。
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细胞周期检测（PI法）
一、实验方法原理
细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。
G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。
S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。
当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。
G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。
因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。
一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。
因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。
通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。
流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。
细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。
PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。
PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光
强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
细胞周期示意图如（图一）所示
（图一）
二、材料及准备工作
1.材料准备
试剂、耗材名称品牌货号
细胞培养瓶corning
6孔板corning
10ml离心管国产
1.5ml EP管国产
胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括
RNase-A 贝博试剂盒中包括
PI 贝博试剂盒中包括
无水乙醇国产
PBS 自配
2. 试剂配制
10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）
以1L量为例：
NaCl 80g
Na2HPO4·12H2O 32.3g
NaH2PO4·2H2O 4.5g
（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）
加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。
使用时用去离子水稀释成1XPBS
3.仪器设备
流式细胞仪；细胞培养孵箱；离心机；水浴；冰箱；离心管；封口膜；移液器
三、实验步骤及注意事项：（采用贝博公司的细胞周期检测试剂盒）
1.细胞样品的准备：
①单次流式细胞仪检测，1份样品细胞数量约106（我校8楼免疫教
研室的要求）
②收集细胞培养液备用。
③用胰酶（无EDTA）消化细胞，至细胞可以被轻轻用吹打下来时，
加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。
④将细胞悬液收集到10ml的离心管内。
800g左右离心5min，沉淀
细胞。
小心吸除上清，残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。
⑤加入1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞， 800g×5min。
为减少细胞
损失可用1.5ml离心。
⑥再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，残留约20ul左右的PBS，以避免吸走细胞。
重复第5步操作，用预冷的PBS再次洗细胞，并离心收集细胞。
轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团，用250ul预冷的PBS重悬细胞。
2. 细胞固定：
缓慢加入750ul冰浴预冷无水乙醇，轻轻吹打混匀，4℃固定2小时或-20℃固定1小时，封口膜封口（此步可停止，-20℃保存样品，1周内样品检测不受影响）。
3. 染色：
①1000g左右离心3-5min，沉淀细胞。
小心吸除上清，可以残留约
50ul左右的70%乙醇，以避免吸走细胞。
③加入约1ml冰浴预冷的PBS，洗涤细胞一次。
再次离心沉淀细胞，
小心吸除上清。
④用200ul预冷的PBS重悬细
⑤加入Rnase A溶液20ul，37℃水浴30min。
⑥每管细胞样品中加入400ul碘化丙啶染色液，缓慢并充分混匀后
4℃避光孵育30 min。
染色完成后宜在24h内完成流式检测。
⑦. 流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红
色荧光，同时检测光散射情况。
采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。
注意事项
1.RNaseA用PBS配制，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。
试剂
盒中带有配制好的酶。
2.流式分析时需要的是单个细胞悬液，因此在操作过程中充分混悬细
胞。
3.固定过程中不直接加70%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。
乙醇固定之后没有细胞沉淀。
3. PI液体4℃避光保存。
FlowJo分析细胞周期数据的过程
1.把细胞周期样品拖入FlowJo软件，双击打开原始数据。
如(图二)
所示：
(图二)
X轴选择FSC,Y轴选择SSC。
分析细胞周期的细胞选择上图所示的细胞群体进行分析。
2. 在SSC/FSC图中双击分析的细胞群体，如（图三）所示：
（图三）
X轴选择FL3-LIN,用来表示PI的线性信号。
Y轴选择FL3-PEAK,用来表示PI的峰值信号。
本实验数据采集采用的是贝克曼仪器采集的数据。
（如果是BD的仪器采集的数据，X轴选择FL2-W,用来表示PI
的宽度信号。
Y轴选择FL2-A,用来表示PI的面积信号），如上图所示多倍体或异倍体细胞不予分析。
3.在FlowJo工作台中选中“用于周期分析的二倍体细胞”这个结点，在工具栏的“工具”中选择“细胞周期”。
如（图四）所示
（图四）
说明：
1) 分析的模型有Watson和DJF两种，用户可以选择任意一种进行
分析，两模型间没有实质的差别。
模式右边是两种模型的显示方式。
2) 细胞周期拟合原则：G1峰限制和G2峰限制。
根据实验结果拟合
情况，对G1峰限制和G2峰限制进行适当的调整。
曲线调整原则：粉色的曲线为模型曲线，黑色的为样本曲线，理想状况是粉色和黑色曲线吻合一致为最佳。
拟和的好坏可以
●根据右边的RMS值来判断。
RMS(root mean square)值越小
越好。
但是这只是一个相对值，只在同样本不同模拟情况下，
选取最小值来达到最佳拟和。
你可以选中G1期的峰或G2
期的峰，根据调节按钮调节峰的宽度
●通常来说，G2的位置为G1的2倍。
你可以根据相对固定
的那个峰来确定另外一个峰的位置，如G1峰相对固定的话，
就选择G2峰的均数为G1的2倍(2G1)；如果G2峰相对固定
的话，就选择G1峰为G2峰的0.5G2细胞周期结果解读：
G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76
G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43
S期占25.73
G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）
峰的变异系数为4.54%（好）
细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。
总的细胞数（仪器检测到的）为17525个，
在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）CV是变异系数。
一般CV越小，峰形越好，越尖锐。
能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。
细胞周期分析常用术语：
•CV：变异系数。
不同细胞群体DNA含量的细微差别可能有生物学上的重要意义，因此DNA含量的流式分析中分辨率尤其关
键。
通常检测分辨率或精度由G0/G1峰的CV来反映。
影响CV
的因素主要包括两方面：仪器因素和样品制备及染色过程对标
本的人为影响。
•Ploidy:倍体。
原指染色体数目。
流式中用来描述总的DNA含量。
二倍体细胞有正常细胞的DNA 含量但不排除染色体的异常。
S期含量 :S期细胞占总细胞周期的比例。
细胞周期数据结果输出
1. 细胞周期结果的输出根据最终的需求可以有多种输出方式
•在细胞周期分析窗口工具栏中选择“文件”并单击，选择下拉菜单中的“另存为”，选择保存位置、重新命名文件名以及文
件保存的文件类型（SVG、PNG、EMF、JPG）。
把上述样品的分析应用到组中，在Flow Jo软件界面中单击打开布局编辑器，在工作台的样品空间把“分析的细胞群体结点”拖入布局编辑器中，单击布局编辑器右上角的Batch工具。
输出整个实验组的数据。
如（图五）所示
（图五）。