第二章 海洋生物样品的采集与活性筛选方法

（二）活性筛选模型的分类
根据所选材料、药物作用对象以及操作特点的不同，可以
将活性筛选模型分为三类：

整体动物水平模型与传统筛选程序 理想的动物模型应具备的基本条件：病理机制与人类 疾病的相似性、病理表现的稳定性和药物作用的可观察性。 优点：可从整体水平直观地反映药物的治疗作用、不良反 应以及毒性作用。临床试验不可或缺的前提。 缺点：依赖手工操作、样品量大、病理模型太少。
模进行筛选，效率高。
缺点：离体实验，可能造成假相。
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（三）样品处理和活性筛选流程
水相提取体系
海洋生物原料+水→浸提→过滤或离心→减压浓缩→浓缩液→喷雾干燥→粗品 └→ 液液萃取→有机相
粗品←喷雾干燥←浓缩←水相
有机相提取体系
海洋生物原料+有机溶剂→浸提→过滤或离心→减压浓缩→浓缩液→有机溶剂
→二次提取→喷雾干燥→粗品
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细胞、分子水平模型和高通量药物筛选
以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板
形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过
程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算 机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品 检测，并以相应的数据库支持整个体系运转的技术体系。
优点：材料用量少、作用机制比较明显、可大规
采样步骤 6 将拖网缝隙里的浮游动物冲至网底
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3. 深海潜水器采集：海洋生物密集地、岩石
的斜坡、深海底部或峭壁等
8 目前最深可潜到5000米
4. 其他采集方式
潮间带或者滩涂的生物一般采用捡拾、挖掘，岸 边还可以进行手抛网采集，而一些海洋样品亦可以从 当地市场买得。
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二、采集样品的具体要求
（一）采样工具及试剂 1、采样工具 铁锹：掘取栖息在泥沙中的动物 铁钩子或小铁铲：采集栖息在浅层泥沙中的贝类
采集大型藻类样品后用现场海水冲洗干净，放入双层 聚乙烯袋中冷冻保存或现场摊晾、晒干后包装。
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海洋微生物的采集
采自海洋底泥、海水、海洋动植物等→从泥样和水样中分 离微生物，从海洋动植物分离附生菌（生物的表面）、内生菌 （生物的体内组织）等共生微生物。 采集的样品最好立即或尽快进行目的菌的分离，如无条件 ，则需将样品暂存于4～8℃的低温环境中。 分离过程与环境的要求：无菌 一般分离过程:将采集的材料接种到分离介质中培养，然 后将生长出的菌落在显微镜下转移到其它培养基中，直至分离 到单一菌株。最后选择合适的培养基放大培养。
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四、 样品的活性筛选
（一）活性筛选发展的三个阶段 1、有目的地寻找某类已知的活性化合物及其类似 物——测定不同生物中感兴趣的化合物的含量； 活性测定方法仅作为研究手段。 2、寻找具有某种生物活性的物质，一般是未知物 ——采用某一筛选模型对大量样品进行广泛筛选， 在确定样品具有活性后再开展深入研究。目前多 数研究处于这一阶段 3、高通量（HTS）筛选——采用多种药理模型，在 分子、受体水平上对大量样品进行快速、高效、 低成本的活性筛选。 21

常用的活性筛选方法包括以下几种：
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1. 抗菌活性筛选---抗生素的研究

抗菌活性筛选是目前应用非常广泛的活
性筛选方法之一，特别在药用微生物和 抗生素的筛选上，本方法起到了举足轻 重的作用。抗菌活性主要包括抗细菌、 抗真菌、抗支原体活性的筛选。
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（1） 抗一般细菌药物筛选

据世界卫生组织（WHO）规定的标准方法，即
Bauer-Kirby纸片法进行药效测定。

初筛菌株包括：金黄色葡萄球菌（G＋）、藤黄八
迭球菌（G＋）、大肠杆菌（G－）、绿脓杆菌(G－) 等。

深入研究的试验菌株有以上细菌的耐药株和临床 株。
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(2) 抗厌氧细菌药物筛选
微量液体稀释法：培养基： Mueller-Hinton Broth(组 厌氧菌（Anaerobic）是一类对游离氧敏感的微 成肉浸膏300g/柠檬酸17.5g/淀粉1.5g/蒸馏水1000ml） 生物，生长需要一定的厌氧环境，目前对抗厌氧菌药 ，灭菌后， 25℃水浴中调节pH7.1-7.4,在配制好的培养 2+和Mg2+各25mg/L; 操作：选择U字形微量板 基中加入 Ca 物筛选尚无一种公认的标准方法。 进行试验，每孔中加入约0.1ml含样品的上述培养基， -60℃Micro-Dilution 下保存，有效期可以维持 3个： 用专用盖密封后，在 微量液体稀释法(Broth Method) 月左右，抗菌药物的溶解与稀释需用蒸馏水和上述培养 筛选抗变形链球菌（龋齿的主要病原菌）药物； 基；接种菌量最终达到每孔 104cuf;一般在5±1℃的条 件下培养18-24小时；结果判定：确认用于对照的未添 加药物的培养基中有细菌生长后，将肉眼观察到没有细 琼脂稀释法(Agar Dilution Method) ：筛选抗幽门 菌生长的培养孔中的药物浓度定为 MIC。 螺杆菌（胃及十二指肠溃疡的致病菌）药物。 可在一个平板上同时 31 作多株菌MIC测定
凿子：凿取栖息在岩石或岩石缝隙内的动物，如牡蛎等
冰瓶：保存样品 组织捣碎机：制作样品匀浆 解剖用不锈钢刀、各类型镊子及剪刀；医用酒精棉球；一 次性塑料袋、乳胶手套；广口瓶、聚乙烯袋、纱布、卡尺 、记录本、记号笔等。 如进行潜水采集，需配备全套潜水器具
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2、常用试剂 70%乙醇溶液 取市售的95%乙醇溶液70ml，加25ml蒸馏水，用于贮存 样品 5%甲醛溶液
第二章 海洋生物样品的采集 与活性筛选方法

相Biblioteka Baidu与陆地生物样品，海洋生物样品采集 和保存更加困难。

海洋样品采集困难 海洋样品活性成分含量少，药物分析需求量较 大。

样品保存要求较高
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一、海洋生物样品的采集方法
1.潜水采集：（采样深度~数十米） 样品主要为海绵、珊瑚、海藻、海星和贝类等。
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必须由经过科研潜水培 训且具有生物学知识的 潜水员或实践经验丰富 的渔民来完成。


采集原料信息的记录：地理位
置、生物的性别和生长阶段等。 留出适当的样品作为 今后种类鉴定用。

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2、生物种类鉴定

采集的样品必须确定种属： 比对照片、图谱


海洋生物分类学专家鉴定
样品应留存标本，并注明样品的来源信息。
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3、样品用自来水冲洗

水冲洗是为了 减少样品的无 机盐和附着的 大量样品的处理 浮游生物等。 曾有报道：从 上岸之前进行冷藏处理。 样品中分离的 上岸后根据样品的情况进行分别处理。 化合物有些其 实是共生或附 绝大多数样品可以进行冷冻处理。 生的生物含有 不稳定的化合物---特殊处理：冷冻保存、冷 冻干燥（干冰贮器或液氮罐，如柳珊瑚中提取前列 腺素；保温桶或泡沫塑料箱放入冰块；）
样品液中，然后观察对致死性或对变态过程、定
殖效果、虫室形成等方面的影响。
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（2）对无脊椎动物运动的影响：在加有样品的 溶液中，如果一个饲养着的水螅或者其他动 物总保持收缩状态，可以认为遇到有毒的代
谢物。
（3）金鱼毒性试验：样品对小金鱼的影 响，可表现为致死或者失去平衡等。 （4）通过器官和生理系统检测：可检测 心脏、血压和肌肉等的作用活性。
随渔民拖网 作业：未设定 明确的目标样 品，研究者需 随船对捕获物 采样步骤 1 – 准备采集网具 进行辨识、捡 拾，获得所需 样品。
采样步骤 2 – 采集水桶、福尔马林、洗涤瓶与采样瓶
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采样步骤 3 – 进行拖网采集作业
采样步骤 4 将可能附着的浮游动物冲至网底
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采样步骤 5 将网里附着的浮游动物冲至网底
？许多海洋生物体内的共生菌难以在体外培养。
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海洋活体样品的采集
某些海洋生物仅需研究其分泌物或毒液，采集时应尽量保
证能捕捉到活的生物个体，并采用与其栖息环境相似的条件饲
养。也可在现场即刻采取毒液等样品，如芋螺毒液的收集。
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三、样品的处置和保存
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1、样品的编号、采集、记录

根据采集样品的安排，对采集后分拣的不同样品进 行编号。 编号后的样品应选择形状、色泽好的进行拍照。 记录样品的一些初步特征。

对于成分 未知或含 肽类易变 活性成分 的样品
少量样品：密封的聚乙烯袋，与样品标签一起放 入另一聚乙烯袋或洁净广口瓶，封口，冷冻保存。
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上岸后根据样品的情况进行分别处理。

无条件者可用有机溶剂（95％乙醇）浸泡，之后密
封入塑料袋或桶中。运回实验室可直接提取活性成
分。但对多肽等遇有机溶剂变性的样品不适合。
时，含有指示剂的培养基不再变色，据此判断药效。

初筛的试验菌株有溶脲支原体（人体致病菌，细胞株污染）
和人型支原体（人体常见株，条件致病，细胞株污染）。
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2. 对动物影响活性的模型
（1）对动物幼体的定殖或变态的抑制

环节动物、鲍鱼以及咸水虾的幼体可用于检测样
品对动物的毒性或其他影响。通常多个幼体置于
取市售的40%甲醛水溶液12.5ml，加入95ml蒸馏水或海 水，用于制作和保存标本
碘液
2g碘化钾 + 1g碘溶于200ml蒸馏水
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（二）采样方式
采集样品时尽量保持生物个体不受损伤。栖息在岩石 或其它附着物上的个体，要用凿子凿取；栖息在沙底或泥 底的生物个体可用铲子铲取或铁钩子扒取。 贝类样品的采集 挑选体长大致相似的个体，若壳上有附着物需去除， 彼此相连的个体应分开，现场用海水冲洗干净后，放入双 层聚乙烯袋中冷冻保存。 藻类样品的采集
(3) 抗真菌药物筛选
真菌是高级进化的微生物，种类多，生长发育过
程复杂，其菌体可分化成菌丝型和酵母型，对药物的敏
感性不同。

常用
在新药筛选时，除用纸片法或琼脂稀释法测定药效、 测量抑菌圈范围外，还要仔细观察被测物质是否阻止分 生孢子萌发，抑制菌丝生长扩散，或造成菌丝畸形等。

初筛真菌有：白色假丝酵母（酵母型）和红色毛癣菌 （菌丝型）。
局限性、低效率、高成本
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离体血管实验，心脏灌流实验、组织培养实验等

组织器官水平模型和体外药物筛选方法
优点：通过观察活性成分对特定组织或器官的作用， 可以有效地观察药物的作用原理和可能具有的药理作 用——降低筛选样品的用量和动物用量；提高筛选效
率，降低筛选成本；减少了影响药物作用的因素，易
于评价药物作用。 缺点：规模小、效率低、反映药物作用有限、样品 需要量大、不易实现一药多筛、人工操作技术要求高。
水相 ↓ 粗品 干燥 回收溶剂 轻相 液液萃取
喷雾干燥←液膜浓缩
重相
柱层析体系——纯化
海洋生物原料→浸提→过滤或离心→减压浓缩→浓缩液→溶解→微孔过滤超滤 →柱层析→分部收集组分→浓缩→冷冻干燥→目标成分
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海洋微生物活性物质的筛选与研究流程
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（四）常用的活性筛选方法

生物活性的筛选方法各式各样，筛选效率直接与 实验的设计有关，靶标越明确，越有可能获得特 定活性的产物，因此如果对病理和药理方面有越 深入越具体的了解，就越有利于筛选。
一个大气压 人工操作潜 水器的应用 使采集者可 以深入水下 1000米采集 20世纪90年 代，出现遥 控潜水装置 （非人工）
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2. 捕捞、拖网采集：海洋鱼类、浮游生物等。
雇佣专门的海洋 考察船：大量采集 某一特定海洋生物 样品 搭乘远洋渔船： 仅以收集多种海洋 生物样本进行活性 筛选为目的
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(4) 抗支原体药物筛选

支原体（Mycoplasma）是界于病毒和细菌之间没有细胞
壁的微生物，广泛分布于自然界，能引起人类和动植物的
感染以及各种组织细胞培养的污染。

支原体能在特殊的培养条件下生长繁殖，引起pH值变化， 故采用颜色改变单位（Color Change Unit, CCU）检定 其生长状况。当被测物质发挥生长抑制效应或杀灭支原体
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举例：海虾生物致死法(初筛)

海藻等可以晒干或者晾干保存：会损失部分有效成 分，采集量要大。

活体饲养：采集后应营造与生物个体生存环境相近
的条件进行饲养，并尽早运回实验室。
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4、样品的实验室处理
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夏威夷大学在研 究箱鱼毒素时， 曾采用巧妙的方 采集到的大量样品浸泡于酒精中，如果时间允许，应 法，箱鱼捕捉后 尽快提取进行成分分析。 立即放入已经准 备好的蒸馏水 样品浸泡时间不宜过长，防止样品中的化学物质发生 中，由于环境发 生变化箱鱼排出 变化。 毒素，然后将含 样品储存应该尽量保持低温，防止样品腐烂。海藻等 毒素的蒸馏水用 丁醇提取浓缩后 样品也要注意防虫、防腐、防霉等处理。 经纯化得到。