第3章基因工程载体精简版
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pYES2质粒载体的多克隆位点
第3章基因工程载体精简版
质粒载体的构建
• 载体必须具备
– 复制必需区 – 选择标记基因 – 克隆位点
第3章基因工程载体精简版
第3章基因工程载体精简版
第3章基因工程载体精简版
质粒的复制类型
• 严紧型(stringent plasmid)
–质粒复制受宿主染色体DNA严格控制， –拷贝数少，1-3个
• 松弛型（relaxed plasmid)
–受宿主 控制比较松 –拷贝数多，10-200个
第3章基因工程载体精简版
质粒的不亲和性（不相容性）
第三章 基因工程载体
• 概述 • 质粒载体 • 噬菌体载体和粘粒载体 • 人工染色体
第3章基因工程载体精简版
概述
什么是载体
所谓载体是指能够携带外源DNA片段进入受 体细胞并具有自我复制功能的核酸分子。
载体具备的基本条件
• 在宿主细胞内独立自我复制 • 具有合适的限制酶切位点 • 具有合适的选择标记基因
不亲和性（plasmid incompatibility ): 在没 有选择压力的情况下，两种不同的质粒 不能在同一个宿主细胞系中稳定共存的 现象。
在细胞的增殖过程中一种质粒逐渐被排斥、 稀释掉，这样的两种质粒称为不亲和质 粒。
第3章基因工程载体精简版
• 前提条件: A和B质粒
–B质粒进入含A质粒的寄主细胞 –B质粒DNA并不受寄主细胞的限制体系所降
第3章基因工程载体精简版
▪ 载体的功能
1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件
第3章基因工程载体精简版
第一节 质粒载体
• 什么是质粒 • 质粒的生物学特性 • 质粒的分离与纯化 • 质粒载体的构建及类型 • 质粒载体的稳定性
第3章基因工程载体精简版
解 –A和B质粒不能长期共存
第3章基因工程载体精简版
不亲合群
• 彼此不相容的质粒属于同一个不亲合群 • 彼此相容的质粒属于不同的不亲合群
第3章基因工程载体精简版
质粒的不亲和性机理
质粒的转移特性
什么是质粒的转移？ 是指接合型质粒具有自主从一个细胞转
移到另外一个细胞的特性 接合型与非接合型质粒
接合型：携带控制细菌配对和质粒结合 转 移的基因，能我转移。
第3章基因工程载体精简版
表达载体与克隆载体之区别
大肠杆菌表达载体具备: • 强启动子 • 核糖体结合位点序列 • 强转录终止序列 • 信号肽编码序列
第3章基因工程载体精简版
植物表达载体
第3章基因工程载体精简版
多功能载体
具有体外转录、克隆、基因表达、测序等 功能
第3章基因工程载体精简版
穿梭载体(shuttle plasmid vector)
• λ噬菌体作为克隆载体的优越性 • λ噬菌体的分子生物学概述 • λ噬菌体载体的构建 • λ噬菌体载体的类型 • λ噬菌体的体外包装
第3章基因工程载体精简版
质粒的一般分子特性
细胞质粒大多是环形DNA分子 质粒可以稳定的存在于染色体外，在一
定条件下也会整合到染色体上 质粒一般有三种构型：共价闭合环形DNA；
开环DNA；线形DNA
第3章基因工程载体精简版
自主复制型载体和附加载体的扩增方式
Liner DNA Open circle DNA
什么是质粒(plasmid)
质粒是染色体外的能自我复制的环状核 酸分子 。
不能独立的存在，只能随寄主细胞 分裂而遗传，能独立进行复制，广泛的 存在于原核生物或一些真核生物中
第3章基因工程载体精简版
第3章基因工程载体精简版
质粒的生物学特性
➢质粒的一般性质 ➢质粒编码遗传表型 ➢质粒的结合转移特性 ➢质粒的不亲和性 ➢质粒的复制特性
非接合型：不能自我转移
第3章基因工程载体精简版
✓ 关于F质粒 控制质粒结合转移的因子主要是F因子，F因
子称为F质粒。 ✓ F因子
又叫致育因子，是雄性决定因子。 是单拷贝接合型质粒，94kb
F+ ：含F因子 的细胞，是雄性细胞 F ― ：不含F因子 的细胞，是雌性细胞
第3章基因工程载体精简版
F 质粒转移机制
F+
F 混―合培养
F+表面的性须结构作用
雌、雄细胞配对
通过性须结
F因子进入F ―细构胞
F ―细胞变成F+细胞
第3章基因工程载体精简版
F 质粒转移机制
非接合型质粒
• 不能自我转移 • 只携带自主复制所必需的遗传信息 • 不具有细菌配对和质粒接合转移的基因 • 分子量小 • 属于松弛型
第3章基因工程载体精简版
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
质粒载体的构建
理想的质粒载体
–分子量小，拷贝数高。 –有多克隆位点（mcs) –有两种以上的选择标记基因 –缺失mob基因和tra基因 –重组质粒易导入宿主细胞
第3章基因工程载体精简版
多克隆位点（mcs): multiple cloning site 是载体上人工合成的含有紧密排列的多种限 制性核酸内切酶位点的DNA片断。
具有两种不同复制起点和筛选标记， 可在两种不同的宿主中存活复制的质粒载体
穿梭质粒类型
• 大肠杆菌—土壤农杆菌 • 大肠杆菌—酿酒酵母 • 大肠杆菌—枯草芽孢杆菌 • 大肠杆菌—动物细胞
第3章基因工程载体精简版
第二节 噬菌体载体与粘粒载体 • λ噬菌体载体 • 粘粒载体
第3章基因工程载体精简版
一、 λ噬菌体载体
载体的类型
▪ 克隆质粒载体 ▪ 表达质粒载体 ▪ 多功能质粒载体 ▪ 穿梭质粒载体
第3章基因工程载体精简版
克隆质粒载体
第3章基因工程载体精简版
• pBR322
pBR322
第3章基因工程载体精简版
•表 达 质 粒 载 体
pGEM3Z载体的结构及外源DNA的转录
• 胞内表达载体 • 分泌型表达载体 • 原核细胞表达载体 • 真核细胞表达载体
Super circle DNA
第3章基因工程载体精简版
质粒编码遗传表型
由于质粒的存在赋予寄主细胞许多额外的表型 如:抗药性特征、代谢特征、修饰寄主生活方 式的特征等
在基因克隆过程中应用较多的有抗药性特征、 促进质粒转移的特征、产生大肠杆菌素的特征 等，这些特征在重组子的筛选和表达载体的构 建过程中得到充分的应用
pYES2质粒载体的多克隆位点
第3章基因工程载体精简版
质粒载体的构建
• 载体必须具备
– 复制必需区 – 选择标记基因 – 克隆位点
第3章基因工程载体精简版
第3章基因工程载体精简版
第3章基因工程载体精简版
质粒的复制类型
• 严紧型(stringent plasmid)
–质粒复制受宿主染色体DNA严格控制， –拷贝数少，1-3个
• 松弛型（relaxed plasmid)
–受宿主 控制比较松 –拷贝数多，10-200个
第3章基因工程载体精简版
质粒的不亲和性（不相容性）
第三章 基因工程载体
• 概述 • 质粒载体 • 噬菌体载体和粘粒载体 • 人工染色体
第3章基因工程载体精简版
概述
什么是载体
所谓载体是指能够携带外源DNA片段进入受 体细胞并具有自我复制功能的核酸分子。
载体具备的基本条件
• 在宿主细胞内独立自我复制 • 具有合适的限制酶切位点 • 具有合适的选择标记基因
不亲和性（plasmid incompatibility ): 在没 有选择压力的情况下，两种不同的质粒 不能在同一个宿主细胞系中稳定共存的 现象。
在细胞的增殖过程中一种质粒逐渐被排斥、 稀释掉，这样的两种质粒称为不亲和质 粒。
第3章基因工程载体精简版
• 前提条件: A和B质粒
–B质粒进入含A质粒的寄主细胞 –B质粒DNA并不受寄主细胞的限制体系所降
第3章基因工程载体精简版
▪ 载体的功能
1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件
第3章基因工程载体精简版
第一节 质粒载体
• 什么是质粒 • 质粒的生物学特性 • 质粒的分离与纯化 • 质粒载体的构建及类型 • 质粒载体的稳定性
第3章基因工程载体精简版
解 –A和B质粒不能长期共存
第3章基因工程载体精简版
不亲合群
• 彼此不相容的质粒属于同一个不亲合群 • 彼此相容的质粒属于不同的不亲合群
第3章基因工程载体精简版
质粒的不亲和性机理
质粒的转移特性
什么是质粒的转移？ 是指接合型质粒具有自主从一个细胞转
移到另外一个细胞的特性 接合型与非接合型质粒
接合型：携带控制细菌配对和质粒结合 转 移的基因，能我转移。
第3章基因工程载体精简版
表达载体与克隆载体之区别
大肠杆菌表达载体具备: • 强启动子 • 核糖体结合位点序列 • 强转录终止序列 • 信号肽编码序列
第3章基因工程载体精简版
植物表达载体
第3章基因工程载体精简版
多功能载体
具有体外转录、克隆、基因表达、测序等 功能
第3章基因工程载体精简版
穿梭载体(shuttle plasmid vector)
• λ噬菌体作为克隆载体的优越性 • λ噬菌体的分子生物学概述 • λ噬菌体载体的构建 • λ噬菌体载体的类型 • λ噬菌体的体外包装
第3章基因工程载体精简版
质粒的一般分子特性
细胞质粒大多是环形DNA分子 质粒可以稳定的存在于染色体外，在一
定条件下也会整合到染色体上 质粒一般有三种构型：共价闭合环形DNA；
开环DNA；线形DNA
第3章基因工程载体精简版
自主复制型载体和附加载体的扩增方式
Liner DNA Open circle DNA
什么是质粒(plasmid)
质粒是染色体外的能自我复制的环状核 酸分子 。
不能独立的存在，只能随寄主细胞 分裂而遗传，能独立进行复制，广泛的 存在于原核生物或一些真核生物中
第3章基因工程载体精简版
第3章基因工程载体精简版
质粒的生物学特性
➢质粒的一般性质 ➢质粒编码遗传表型 ➢质粒的结合转移特性 ➢质粒的不亲和性 ➢质粒的复制特性
非接合型：不能自我转移
第3章基因工程载体精简版
✓ 关于F质粒 控制质粒结合转移的因子主要是F因子，F因
子称为F质粒。 ✓ F因子
又叫致育因子，是雄性决定因子。 是单拷贝接合型质粒，94kb
F+ ：含F因子 的细胞，是雄性细胞 F ― ：不含F因子 的细胞，是雌性细胞
第3章基因工程载体精简版
F 质粒转移机制
F+
F 混―合培养
F+表面的性须结构作用
雌、雄细胞配对
通过性须结
F因子进入F ―细构胞
F ―细胞变成F+细胞
第3章基因工程载体精简版
F 质粒转移机制
非接合型质粒
• 不能自我转移 • 只携带自主复制所必需的遗传信息 • 不具有细菌配对和质粒接合转移的基因 • 分子量小 • 属于松弛型
第3章基因工程载体精简版
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
质粒载体的构建
理想的质粒载体
–分子量小，拷贝数高。 –有多克隆位点（mcs) –有两种以上的选择标记基因 –缺失mob基因和tra基因 –重组质粒易导入宿主细胞
第3章基因工程载体精简版
多克隆位点（mcs): multiple cloning site 是载体上人工合成的含有紧密排列的多种限 制性核酸内切酶位点的DNA片断。
具有两种不同复制起点和筛选标记， 可在两种不同的宿主中存活复制的质粒载体
穿梭质粒类型
• 大肠杆菌—土壤农杆菌 • 大肠杆菌—酿酒酵母 • 大肠杆菌—枯草芽孢杆菌 • 大肠杆菌—动物细胞
第3章基因工程载体精简版
第二节 噬菌体载体与粘粒载体 • λ噬菌体载体 • 粘粒载体
第3章基因工程载体精简版
一、 λ噬菌体载体
载体的类型
▪ 克隆质粒载体 ▪ 表达质粒载体 ▪ 多功能质粒载体 ▪ 穿梭质粒载体
第3章基因工程载体精简版
克隆质粒载体
第3章基因工程载体精简版
• pBR322
pBR322
第3章基因工程载体精简版
•表 达 质 粒 载 体
pGEM3Z载体的结构及外源DNA的转录
• 胞内表达载体 • 分泌型表达载体 • 原核细胞表达载体 • 真核细胞表达载体
Super circle DNA
第3章基因工程载体精简版
质粒编码遗传表型
由于质粒的存在赋予寄主细胞许多额外的表型 如:抗药性特征、代谢特征、修饰寄主生活方 式的特征等
在基因克隆过程中应用较多的有抗药性特征、 促进质粒转移的特征、产生大肠杆菌素的特征 等，这些特征在重组子的筛选和表达载体的构 建过程中得到充分的应用