植物基因在大肠杆菌中的原核表达
水稻密码子优化的cry1Ca基因在大肠杆菌中表达、纯化及抗体制备
水 稻螟 虫是 造成 水稻减 产 的常发 性 害虫 ，我 国 每 年 由于水 稻螟 虫 为 害 的 面积 约 ０ １ ． ５亿 ｈ ，其 ｍＺ
ｗａ ｈ ｎ ｐ ｒｆ ｄ ｗｉｈ Ｎｉ ｓｔｅ ｕ ｉｅ ｔ — ｉ ＮＴＡ ｆｅ ｒ ａ ｍｅ ｔｏ ｏ ｖ ｎ ｓ ａ ｔ ｒｔ ｅ ｔ ｎ ｆｓ ｌ ｅ ｔ ．Ｔｈ ａ ｇ ｔｐ ｏ ｅ ｎ ｗａ ｓ ｄ ａ ｈ ｎ ｉ ｅ ｏ ｉ ｅ ｔ ｒ ｅ ｒ ｔ ｉ ｓｕ ｅ ｓｔ ｅ ａ ｔｇ ｎ ｔ ｍｍｕ ｉｅ ｎｚ ｒ ｂ ｉ ．ＥＬＩ Ａ ｓ ａ ｈ ｗｅ ｔ ａ ｈ ｉｅ ｆ ｔ ｅ ｒ ｐ ｒ ｄ ｏ ｙ ｌ ｎ ｌ ａ ｔｂ ｄ ｓ ： ５ ０ ａ ｂｔ ｓ Ｓ ａ ｓ ｙ ｓ ｏ ｄ ｈ ｔ ｔ ｅ ｔｔ ｒ ｏ ｈ ｐ ｅ ａ ｅ ｐ ｌ ｃｏ ａ ｎ ｉ ｏ ｙ ｗａ ｌ ０ ０ ０，ａ ｄ ｈ ｄ ｈ ｇ ｎ ａ ｉｈ
要 ：将 水 稻 偏 好 密 码 子 优 化 并 人 工 合 成 抗 虫 基 因 ｃｙ Ｃ ｒ ｌ ａ通 过 限 制 性 内切 酶 酶 切 的 方 法 构 建 原 核 表 达 载 体
ｐ Ｔ一２ｂ ａ Ｅ ８ ｃ ，成 功 表 达 了带 ６个 组 氨 酸 标 签 的 Ｈｉ ｃｙ Ｃ 融 合 蛋 白 ，其 表 达 量 约 占菌 体 总 蛋 白 的 ２ ，表 达 的 ｓ ｒｌ ａ — ４ 融 合 蛋 白 主要 以包 涵 体 的形 式 存 在 。对 包 涵 体 蛋 白进 行 可溶 性 处 理 ，亲 和 纯 化 出 带 ６个 组 氨 酸 标 签 的融 合 蛋 白 ， 将 其 作 为抗 原 免疫 家兔 获 得 了滴 度 （ ＩＳ Ｅ Ａ） 为 ｌ ５ ０ Ｉ ： Ｏ０ ０的抗 血 清 ，并 具 有 较 强 的 特 异 性 。 关键 词 ：ｃｙ Ｃ ｒ ｌ ａ基 因 ；原 核 表 达 ；融 合 蛋 白 ；多 克 隆 抗 体
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。
2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。
可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。
3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。
4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。
5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。
6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。
在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。
苹果PGIP基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
苹果PGIP基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达熊帅;张军科;谌悦【摘要】[目的]从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础.[方法]根据Genbank 中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP 基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序.然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳.对pET-PGIP-X基因工程菌表达产物的可溶性进行检测.[结果]苹果PGIP cDNA序列长为1 091 bp,编码区为993 bp,可编码330个氨基酸残基,将其命名为MdPGIP;重组表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP.X在宿主大肠杆菌中分别表达出分子质量约49.6和46.1 ku的融合蛋白,pET-PGIP-X表达产物以包涵体的形式存在.[结论]成功克隆了苹果PGIP基因,并在大肠杆菌中获得高效表达.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(038)002【总页数】7页(P123-128,134)【关键词】苹果;多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白;基因克隆;内源多聚半乳糖醛酸酶【作者】熊帅;张军科;谌悦【作者单位】西北农林科技大学,园艺学院,农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,园艺学院,农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,园艺学院,农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室,陕西,杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】S661.1植物细胞壁可以有效地阻碍植物病原真菌的侵染，但植物病原真菌可分泌一系列的酶来降解植物细胞壁。
第4章 基因在大肠杆菌和酵母中的表达
降低包含体形成的措施： 降低培养温度；诱导物浓度； 培养基中加入添加剂；培养基组分、pH等。
包含体复性方法： 尿素； 透析、稀释和超滤复性法； PEG、TritonX、肝素、人工伴侣等
原核表达系统的优点与不足
优点：
产量高、表达高效； 操作简单（可调控表达、方便纯化）； 可大规模发酵生产； 成本低。
不足：
缺乏真核中的修饰系统，产物有时缺乏活性。 表达产物易形成包含体。
第二节 真核表达——目的 基因在酵母中的表达
酵母菌表达外源蛋白的优点：
遗传背景清楚 属真核模式生物，具备蛋白质翻译后加 工系统 可发酵生产 不产生内毒素，属安全的表达系统
2
ü 优点： 1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标
蛋白质的纯化就比较简单
2. 蛋白质酶解的程度不甚严重
3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用 （氧化环境）
4. 蛋白质的N-末端结构真实
正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在 体内对信号肽进行切割
五、包含体及复性
包含体（inclusion body）：蛋白质在大肠杆菌中 大量表达时，在胞内聚集形成不可溶的、没有生物 活性的固体颗粒。
T7 RNA聚合酶/T7启动子的优点：
合成RNA的速度高；
只识别T7启动子，不启动其它基因的转录；
对利福平（能抑制大肠杆菌RNA聚合酶）等抗 生素有抗性，能表达一些大肠杆菌RNA聚合酶 不能转录的序列；
产物量大，可达总蛋白的25％以上。
1
94kDa 67 kDa 43 kDa
原核表达系统的工作原理
原核表达系统的工作原理原核表达系统是指利用原核生物（如大肠杆菌等）来表达外源蛋白质的工具，在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。
原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中，并利用细胞自身的代谢机制，将目标蛋白质大量表达出来。
本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。
1. 原核表达系统的基本构成原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。
表达载体是一种重组DNA分子，通常包括以下基本组成成分：（1）起始位点（起始密码子）：在大肠杆菌中通常为AUG。
（2）表达基因：包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。
（3）选择标记：旨在筛选出带有目标基因的细胞，并提高表达效率。
常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。
（4）复制起点：能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制，提高表达效率。
宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。
2. 原核表达系统的工作流程原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达：（1）制备表达载体将目标基因插入表达载体中，构建成重组DNA分子。
（2）转化宿主细胞将制备好的表达载体转化（transform）到宿主细胞内。
转化过程中，表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法，被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。
（3）表达基因转录和翻译转录因子识别插入表达载体的启动子序列，调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。
转录后的mRNA与核糖体结合，开始翻译，合成蛋白质。
（4）目标蛋白质的后处理和纯化将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。
通常采用离心、过滤或柱层析等方法，对蛋白质进行分离和纯化。
3. 原核表达系统的优缺点原核表达系统在生物技术和基因工程领域应用广泛，主要因为其有以下的优缺点。
（1）优点①高效：能够表达大量的目标蛋白质，通常能够达到10%以上的蛋白质总产量。
②简便：操作简便，不需要昂贵的设备，很容易进行规模化操作。
原核表达详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
白菜BcMF2基因在大肠杆菌中的高效表达
[收稿日期]20060626 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(30370975);浙江省重大科技项目(2005C12019-02) [第一作者简介]张 弢(5),女,黑龙江双鸭山市人,农学博士,主要从事植物分子生物学研究 [通讯作者]曹家树,博士,教授,博士生导师白菜BcM F 2基因在大肠杆菌中的高效表达 张 弢 (浙江大学蔬菜研究所,浙江杭州310029;莱阳农学院生命科学学院,山东青岛266109) 刘乐承 (浙江大学蔬菜研究所,浙江杭州310029;长江大学园艺园林学院,湖北荆州434025) 曹家树 (浙江大学蔬菜研究所,浙江杭州310029)[摘要]通过PCR 方法扩增BcMF2cDNA 完整的编码区序列,构建p ET 2BcM F2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IP TG 诱导融合蛋白高效表达;SDS 2PA GE 电泳检测发现在70kD 处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致,同时发现,其阳性克隆在30℃和IP TG 终浓度为0.4～1.0mmol L -1时诱导6h ,均能获得较高的表达量。
[关键词]白菜(B r assica c ampestr is L.ssp.Chinensis Ma kino );多聚半乳糖醛酸酶;BcM F2;原核表达[中图分类号]Q786[文献标识码]A [文章编号]16731409(2006)03015303多聚半乳糖醛酸酶(polygalact urona se ,P G )基因参与植物发育的许多阶段,在果实、叶和花脱落以及花粉发育中起着重要作用。
目前,许多植物中的P G 基因得到了克隆,其中包括与花粉发育相关的P G 基因如玉米花粉中PG (X 57627)[1]、油菜花粉中大量表达的P G 基因(L19879)[2]、烟草花粉特异的N p g 1(X71020)[3]、苜蓿花粉中特异表达的P G 基因P 73(U20431)[4]等等。
实验九 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用
实验九外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用【实验目的】1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。
2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。
【实验原理】1.外源基因在原核细胞中的表达蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。
常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。
原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。
本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。
（1）大肠杆菌表达系统的特点：生物学特性和遗传背景清楚，易于操作；已开发较多的克隆载体可供选择；容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌总蛋白50％左右）。
（2）蛋白质在原核细胞中的表达特点：原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。
因此，在用原核细胞表达目的基因（无论是真核基因还是原核基因）时，一般应使用原核启动子。
原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。
而在真核基因上则缺乏该序列。
因此，一些商品化原核表达载体上设计有SD序列，以方便真核基因的表达。
原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。
因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA 为目的基因。
原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。
如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关，必须慎重使用原核表达系统。
外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。
包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。
但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。
（3）蛋白质在原核细胞表达的调控启动子是转录水平调控的主要因素。
根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。
遗传学实验20种技术
一、DNA提取1、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠、十六烷基三甲基溴化铵(简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
二、RNA提取1、实验原理Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂,在匀浆和裂解过程中,能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。
在氯仿抽提、离心分离后,RNA处于水相中,将水相转管后用异丙醇沉淀RNA2、操作步骤1、取植物嫩叶,液氮研磨,每1.5ml tube分装0.1克样品;2.每管加入0.5ml Trizol液,迅速混匀,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
3、室温下静置5~10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离4、加入O.5mI的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒,室温静置5分钟5、10000r/min离心10分钟6、取上清液(水相)转入一新的离心管,加入等体积异丙醇,室温放置10分钟,10000r/min离心10分钟。
7、弃去上清液,加入至少1ml的70乙醇,涡旋混匀,4℃下7500r/min离心5分钟。
8、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5—10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于TE或DEPC处理过的水中,必要时可55℃—60℃水溶10分钟。
大肠杆菌
用大肠杆菌快速检测植物功能基因的研究北京五中分校李思佳指导教师韩竹戴毅新【摘要】大肠杆菌是基因工程研究中最常用的原核表达宿主系统。
大肠杆菌表达体系与植物表达体系相比具有培养条件简单，生长周期短，操作简便等优点。
将植物基因分别转化大肠杆菌表达体系和植物表达体系，并在胁迫培养基中进行功能验证，分析结果表明大肠杆菌表达体系具有与植物表达体系相似的作用。
【关键词】大肠杆菌、基因分离鉴定、基因表达、功能验证、胁迫【前言】一、问题的提出生物课上老师讲到细菌的用途和危害时，同学们自己归纳出了很多细菌的危害，如可以引发人和动物的肺炎、腹泻、败血症、霍乱和肺结核等疾病；植物的叶斑病和萎蔫等。
细菌的益处是可以制酒、酱油、醋，还可以利用细菌发电。
老师引导我们说：细菌（如大肠杆菌）还有很多用途，同学们课下可以查找一些资料，做一些实验探究。
于是，我就查找了相关资料，了解到大肠杆菌是基因工程研究中最常用的原核表达宿主系统。
国内有研究人员利用这个原核表达体系筛选出了植物的抗旱基因。
那么这个体系除此之外还有哪些作用呢？这个体系与植物表达体系相比较具有哪些特点？带着这些疑问，在老师和家长的帮助鼓励下，我翻阅了相关书籍，从大肠杆菌的胁迫培养条件及体系开始进行了研究。
二、研究背景及目前国内外研究和应用现状大肠杆菌属原核生物。
细胞呈杆状，直径约1微米，长约2微米，两端钝圆，周身具鞭毛，可运动。
革兰氏染色为阴性，不形成芽孢。
在固体培养基生长的菌落为圆形，白色或黄白色，光滑而具闪光，低平或微凸起，边缘整齐。
最适条件下培养20分钟可繁殖1代。
大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。
一般生活在人的大肠中并不致病，但偶尔侵入到阑尾、胆囊、腹腔或泌尿系统时，可发生炎症。
在工业生产中，大肠杆菌可用以制备L-门冬酰胺酶，此酶是治疗白血病效果较好的一种药物。
在水质监测方面，根据其有无及其数量多少，可作为检测水质状况和污染程度的重要指标。
大肠原核表达
大肠原核表达大肠原核表达是一种常用的蛋白质表达系统，广泛应用于生物医学研究和生物工程领域。
大肠杆菌是最常用的宿主细胞，其原核表达系统具有高效、简便、经济的特点，因此被广泛应用于蛋白质的大规模表达和纯化。
大肠原核表达系统的基本原理是将目标基因插入到原核表达载体中，并将该载体转化到宿主细胞中。
在宿主细胞内，目标基因会受到宿主细胞的转录和翻译机制的调控，从而实现目标蛋白质的表达。
大肠原核表达系统的优势之一是宿主细胞的生长速度快，表达量高，适合大规模表达目标蛋白质。
此外，大肠原核表达系统还可以通过调节宿主细胞的生长条件和表达条件来实现蛋白质的高效表达。
大肠原核表达系统的关键步骤包括：选择合适的表达载体、构建重组载体、转化宿主细胞、筛选阳性克隆、培养大肠杆菌、诱导蛋白质表达、纯化目标蛋白质等。
其中，选择合适的表达载体是非常重要的一步。
常用的表达载体包括质粒和噬菌体。
质粒是一种环状DNA分子，可以在细胞内自主复制和表达目标基因。
噬菌体则是一种寄生菌体，可以在宿主细胞内复制和表达目标基因。
根据需要选择合适的表达载体，可以实现不同类型蛋白质的高效表达。
另外，构建重组载体也是大肠原核表达系统中的重要步骤。
在构建重组载体时，需要将目标基因插入到载体的适当位置，并确保其与载体的连接正确。
常用的方法包括限制性内切酶切割、连接酶法和PCR扩增法等。
通过这些方法，可以将目标基因插入到载体中，并确保其正确复制和表达。
转化宿主细胞是大肠原核表达系统中的关键步骤之一。
转化是指将重组载体转入到宿主细胞中，并使其在细胞内复制和表达。
常用的转化方法包括热激转化法、电穿孔法和化学转化法等。
通过这些方法，可以将重组载体转入到大肠杆菌中，并使其在细胞内复制和表达。
筛选阳性克隆是大肠原核表达系统中的另一个重要步骤。
由于转化后的宿主细胞中可能存在非重组或空载体，因此需要进行筛选来寻找阳性克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选法、荧光筛选法和酶活性筛选法等。
实验 7 外源基因在大肠杆菌中的表达(或诱导表达)和检测 (1)
原核（大肠杆菌）表达系统
特点： 表达质粒独立运转表达 基因重组速度快，生产工艺简单， 成本低，表达量较高， 重组蛋白翻译后修饰较差。
1978年，人胰岛素insulin 基因首次表达 目前仍是一个重要的表达系统
应用：活性要求不高的蛋白质 如抗原制备
原核表达系统－E.coli:
transformation
The metal binding domain of the fusion peptide allows simple purification of recombinant proteins by Immobilized Metal Affinity Chromatography with Invitrogen’s ProBond. resin (available in bulk, see page v). The enterokinase cleavage recognition site in the fusion peptide located between the metal binding domain and the recombinant protein allows for subsequent removal of this N-terminal fusion peptide from thepurified recombinant protein.
OD600 = 0.4-0.6
37℃ overnight
IPTG
诱导表达4-6小时，time-course expression
SDS-PAGE分析
Invitrogen
T7 promoter: bases 20-39 Ribosome binding site: bases 84-90 6xHis tag: bases 112-129 T7 gene 10 leader: bases 133-162 Anti-XpressTM epitope: bases 169-192 Multiple cloning site: bases 202-248 pRSET reverse priming site: bases 295-314 T7 transcription terminator: bases 256-385 f1 origin: bases 456-911 bla promoter: bases 943-1047 Ampicillin (bla) resistance gene (ORF): bases 1042-1902 pUC origin: bases 916-2852 (C)
原核表达步骤总结
原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋⽩，然后进⾏蛋⽩纯化。
本实验⽅案的前提是，⽬的基因已克隆到载体，并已转进⼊JM109菌株中。
1．鉴定⽬的蛋⽩是否在⼤肠杆菌JM109或BL21中⼤量表达（1）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加⼊0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。
2. 以1：50⽐例（200ul），将活化的过夜培养物加⼊10mL LB液体培养基中，加⼊10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min 摇床扩⼤培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使⼤肠杆菌处于最适合表达外源蛋⽩的⽣长状态。
(⼀般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第⼀次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩⼤培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空⽩对照（CK），其余7ml菌液加⼊7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。
以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。
4. 以5000r/min离⼼2min收集菌体，倾倒上清，每个离⼼管收集3ml培养物。
5. 加⼊1ml dH2O，将管底沉淀⽤振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离⼼2min，倾倒上清。
6. 重复步骤5。
将离⼼管中的⽔倒⼲净。
（⼆）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加⼊200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，⼀般200ul⽐较合适)。
⽤漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。
2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。
样品凉后，12000r/min离⼼3min，取每管的上清点样。
大肠原核表达
大肠原核表达【实用版】目录1.大肠杆菌原核表达系统简介2.大肠杆菌原核表达的优势3.大肠杆菌原核表达的过程4.大肠杆菌原核表达的应用领域5.大肠杆菌原核表达的展望正文一、大肠杆菌原核表达系统简介大肠杆菌原核表达系统是一种利用大肠杆菌进行蛋白质表达的技术手段。
在这个系统中，外源基因被插入到大肠杆菌的表达载体中，通过诱导剂的作用，使大肠杆菌表达出目标蛋白质。
这种表达方式具有高效、快速、简单等优点，因此在生物技术领域得到了广泛的应用。
二、大肠杆菌原核表达的优势1.高表达水平：大肠杆菌具有较高的表达水平，能够快速产生大量目标蛋白质。
2.表达速度快：大肠杆菌原核表达系统具有较快的表达速度，通常在几小时内即可完成表达。
3.简单易操作：大肠杆菌原核表达系统操作简单，不需要复杂的实验设备和技术，适合实验室和工业生产。
4.低成本：大肠杆菌原核表达系统成本较低，有利于降低生产成本和研究投入。
三、大肠杆菌原核表达的过程大肠杆菌原核表达的过程主要包括以下几个步骤：1.构建表达载体：将目标基因插入表达载体中，形成重组表达载体。
2.转化大肠杆菌：将重组表达载体转化到大肠杆菌中，使大肠杆菌具有表达目标蛋白质的能力。
3.诱导表达：通过添加诱导剂，诱导大肠杆菌表达目标蛋白质。
4.收集和纯化蛋白质：从大肠杆菌中收集和纯化表达的蛋白质。
四、大肠杆菌原核表达的应用领域大肠杆菌原核表达系统在多个领域都有广泛应用，包括生物制药、生物材料、生物能源等。
例如，利用大肠杆菌原核表达系统生产重组蛋白、酶、抗体等生物制品，以及生产生物降解材料、生物燃料等。
五、大肠杆菌原核表达的展望随着科学技术的发展，大肠杆菌原核表达系统在生物技术领域将发挥更大的作用。
未来，该技术将在提高表达水平、缩短表达时间、降低生产成本等方面取得更多突破，以满足不断增长的生物产业需求。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
浅谈原核表达
浅谈原核表达的技巧摘要：原核表达是表达外源基因常用的方法，具有操作简单、快捷，需时较短，表达产量高，适合工业化等优点。
本文作者根据自己的实践经验，总结了原核表达的一些技巧。
关键词：原核表达表达载体限制性内切酶将植物、动物、微生物等的目的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下优点：易于生长和控制；易于培养，实验耗费少；可选择多种大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒。
原核表达是近年来表达外源蛋白常用的方法，本文根据自己的实践经验，着重谈谈对原核表达中的技巧问题。
一、原核表达一般程序表达前准备-获得目的基因-构建含目的片段的表达载体（测序验证）-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析。
二、原核表达中各操作步骤的关键因素及技巧1.表达前的准备要素：原核表达注重表达前对目的片段、表达载体及表达菌株的分析、选择。
正所谓“磨刀不误砍柴功”，经过细致、周全的分析、准备、设计可带来较为顺当的实验，可免去许多不必要的麻烦。
（1）对表达载体的分析载体的选择：同样的载体，同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量起高，但另外一个就是做不出来，所以表达载体的选择非常重要，没有万能的载体。
选择载体通常我们关心质粒上的几个功能组件及所带来的问题：是否为诱导表达型载体，启动子的强弱、多克隆位点、限制性内切酶的位置、终止密码子的有无及位置，融合Tag的有无，筛选报告基因的位置等。
所选载体一定要保持原来的遗传背景（有些载体经过多次交换已变异）。
选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑，如果为了方便纯化，可选择融合表达；如果为了获得天然蛋白，可选择非融合表达。
融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。
翻译的起始位点：要表达目的蛋白，在该基因的5’端必须有一起始位点，现在大部分的表达载体都提供起始位点，起始密码子与核糖体结合位点的距离都已被优化，一般情况下不需要自己再加，实际操作时要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子，如无，还得根据自己的实际情况加上。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项发布时间： 2019-06-03 新闻来源：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点) ；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB 培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR 方法：用TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA ，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
2、PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
植物病毒源dsRNA原核表达条件的研究_胡有燕
文章编号：1674－148X （2011）02－0103－04植物病毒源dsRNA 原核表达条件的研究胡有燕，牛娜，迟胜起收稿日期：2011－04－07基金项目：青岛农业大学高层次人才科研项目（630435）作者简介：胡有燕（1986－），女，山东章丘人，在读硕士，研究方向：植物病理学通讯作者：迟胜起，E －mail ：chishq@163．com（青岛农业大学农学与植保学院，山东青岛266109）摘要：利用PVY N －CP 和PLRV －CP 基因构建了dsRNA 原核表达载体L4440RYl ，转至大肠杆菌HT115（DE3），获得菌株HTRYl 。
绘制了菌株HTRYl 的生长曲线，研究了IPTG 浓度和诱导时间对该菌株dsRNA 表达量的影响。
结果表明，接种3．5h ，菌体浓度OD 600为0．6，加入终浓度为0．3 0．4mmol /L 的IPTG ，诱导4 5h 时，dsRNA 表达量最高。
dsRNA 表达条件的研究，为dsRNA 的应用研究奠定了基础。
关键词：PVY ；PRLV ；dsRNA ；原核表达中图分类号：S432．4+1文献标识码：ADOI ：10．3969/J．ISSN．1674－148X．2011．02．006Study on the Bacterial Expression of dsRNA of Plant VirusHU Youyan ，NIU Na ，CHI Shengqi（College of Agronomy and Plant Protection ，QAU ，Qingdao 266109，China ）Abstract ：An dsRNA prokaryotic expression vector L4440RYl was constructed with the fragments of the cDNA of PVY N －CP and PLRV －CP and transferred into E．coli HT115（DE3）to gain strain HTRYl ，which was used to produce dsRNA．The growth curve of strain HTRYl was studied and the influences of the concentration of inducer IPTG and its induction time on the dsRNA expression level were discussed．The results showed that the OD 600of bacteria density of E．coli was 0．6when the seed bacteria were fermented 3．5h and that the best condition of bacte-rial expression of dsRNA from strain HTRYl was induced at OD 600of 0．6with 0．3to 0．4mmol /L IPTG for 4to 5h．The condition of bacterial expression of dsRNA lays a solid foundation for further study on the applications of dsRNA．Key words ：PVY ；PLRV ；dsRNA ；bacterial expression转录后基因沉默（post －transcriptional gene si-lencing ，PTGS ）是真核生物中体内由双链RNA （double －stranded RNA ，dsRNA ）分子介导的抵御病毒入侵、抑制转座子活动和调控基因表达的一种机制，是同源依赖性基因沉默。
苦荞蔗糖合酶SuSy基因在大肠杆菌中的表达及其纯化
２０２０年６月甘 肃 农 业 大 学 学 报第５５卷第３期７１～７７ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＧＡＮＳＵＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ双月刊苦荞蔗糖合酶犛狌犛狔基因在大肠杆菌中的表达及其纯化李慧婧，魏玉梅，吴慧昊（西北民族大学实验教学部，甘肃兰州 ７３００００）摘要：【目的】探究苦荞蔗糖合酶结构与功能的关系，构建表达载体以实现犛狌犛狔基因在大肠杆菌中的表达，并经亲和层析纯化后得到重组ＳｕＳｙ蛋白，为进一步研究该酶的结构和功能奠定基础．【方法】以苦荞（犉犪犵狅狆狔狉狌犿狋犪狋犪狉犻犮狌犿）ｃＤＮＡ文库中克隆得到的蔗糖合酶基因重组质粒为模板，ＰＣＲ扩增得到犛狌犛狔编码序列，将其与原核生物表达载体ｐＥＴ２８ａ相连接构建了重组表达载体ｐＥＴ２８ａ 犛狌犛狔，经犈犮狅犚Ⅰ和犛犪犾Ⅰ双酶切及测序鉴定正确后将其转入大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）感受态细胞ＢＬ２１，经异丙基 β Ｄ 硫代半乳糖苷诱导表达ＳｕＳｙ重组蛋白，并对其诱导表达条件进行优化．【结果】在３７℃、１．２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导１０ｈ时，ＳｕＳｙ蛋白表达量最高，分子量大小约为５３．４ｋｕ，超声破碎后经ＳＤＳ ＰＡＧＥ检测到该蛋白以包涵体形式存在．【结论】利用Ｃｏ２＋亲和柱层析纯化和Ｈｉｓ ｔａｇ鉴定得到了高纯度的重组ＳｕＳｙ蛋白，为该酶结构与功能的研究及多克隆抗体制备奠定了基础．关键词：苦荞；蔗糖合酶；原核表达载体；纯化中图分类号：Ｑ７８１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００３ ４３１５（２０２０）０３ ００７１ ０７犇犗犐：１０．１３４３２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｇｓａｕ．２０２０．０３．０１０第一作者：李慧婧，实验师，硕士．Ｅ ｍａｉｌ：４１９５０７０７０＠ｑｑ．ｃｏｍ通信作者：魏玉梅，高级实验师，研究方向为食品开发与安全监测．Ｅ ｍａｉｌ：６４９１１８０４６＠ｑｑ．ｃｏｍ基金项目：中央高校基本科研业务费专项（３１９２０１６００５６）．收稿日期：２０１９ １１ １５；修回日期：２０２０ ０１ １９犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳狊狌犮狉狅狊犲狊狔狀狋犺犪狊犲犵犲狀犲犳狉狅犿犫狌犮犽狑犺犲犪狋（犉犪犵狅狆狔狉狌犿狋犪狋犪狉犻犮狌犿）犻狀犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻犪狀犱犻狋狊狆狌狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀ＬＩＨｕｉ ｊｉｎｇ，ＷＥＩＹｕ ｍｅｉ，ＷＵＨｕｉ ｈａｏ（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｅａｃｈｉｎｇＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＭｉｎｚｕＵｉｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００００，Ｃｈｉｎａ）犃犫狊狋狉犪犮狋：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏｒｅａｌｉｚｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犛狌犛狔ｇｅｎｅｉｎ犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻ｂｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ，ａｎｄｐｕｒｉｆｙｉｔｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｂｙａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｉｎｏｒｄｅｒｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅ ｔｗｅｅｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｓｙｎｔｈａｓｅｓｕｃｒｏｓｅｏｆｂｕｃｋｗｈｅａｔ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳｕＳｙ）ｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｏｆｂｕｃｋｗｈｅａｔｂｙＰＣＲａｎｄｆｕｓｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ２８ａ．Ａｆｔｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒｐＥＴ２８ａ 犛狌犛狔ｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏ犈．犮狅 犾犻ＢＬ２１ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆＩＰＴＧ．【Ｒｅｓｕｌｔ】ＳＤＳ ＰＡＧＥｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｍｏｒｅｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｔ３７℃ｆｏｒ１０ｈｗｉｔｈ１．２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ．Ｉｔｅｘｉｓｔｅｄａｓｉｎｃｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓａｆｔｅｒｕｌ ｔｒａｓｏｕｎｄｔｒｅａｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｗａｓ５３．４ｋｕ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｓｕｃ ｃｅｓｓｆｕｌｌｙｐｕｒｉｆｉｅｄｗｉｔｈＣｏ２＋ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄＨｉｓ ｔａｇｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｕｌｄｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｓｔｕｄｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｓｙｎｔｈａｓｅｓｕｃｒｏｓｅａｎｄｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｐｏｌｙｃｌｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．犓犲狔狑狅狉犱狊：犉犪犵狅狆狔狉狌犿狋犪狋犪狉犻狌犿；ｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ甘肃农业大学学报２０２０年 蔗糖合酶（ｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳｕＳｙ）是与蔗糖代谢密切相关的一类关键酶，通常以四聚体形式广泛存在于高等植物中［１］，催化可逆反应蔗糖＋ＵＤＰ 果糖＋ＵＤＰＧ，即在ＵＤＰ存在时，将蔗糖分解成ＵＤＰ 葡萄糖和果糖［２］，通常认为该酶偏向蔗糖的裂解反应［３］．由于ＵＤＰＧ可以作为合成糖苷等糖基化合物的供体，因此该酶是一种糖基转移酶［４］．在细胞中，ＳｕＳｙ因存在形式不同而功能不同，如在细胞质中以可溶性形式存在时，主要为淀粉的合成提供产物［５］，而结合在质膜上时，为纤维素的合成提供前提物质ＵＤＰＧ［６］．此外，该酶在提升植物固氮能力［７］和提高植株抗逆性方面也有着重要意义［８］．已有研究表明，玉米中缺失犛狌犛狔基因会导致种子淀粉含量明显减少［９］，而当其大量表达时，淀粉和葡萄糖含量又显著升高［１０］，当玉米狊犺１基因发生突变时，种子胚乳中的ＳｕＳｙ活性明显降低，淀粉含量也会下降［１１］；西瓜‘０４ １２’（自交系）在幼果期时，蔗糖的快速积累与ＳｕＳｙ的活性上升关系紧密［１２］．与其他作物相比，苦荞淀粉具有低消化性、可溶性糖含量明显较低［１３ １４］，因而被作为糖尿病人首选食疗作物．可以推测，ＳｕＳｙ在苦荞种子淀粉合成、糖代谢调控过程中也发挥着重要作用．燕雪芬等［１５］已从苦荞中克隆了犛狌犛狔基因，并分析了基因序列．为了进一步探讨ＳｕＳｙ在苦荞中的生物学功能，首先要获得纯化的蛋白，但目前通过原核表达系统表达ＳｕＳｙ重组蛋白方面的报道较少．因此，本研究拟构建苦荞重组表达载体ｐＥＴ２８ａ 犛狌犛狔，诱导其在大肠杆菌ＢＬ２１中表达，亲和层析纯化重组蛋白，为进一步研究该酶的结构和功能及多克隆抗体制备奠定基础［１６］．１ 材料与方法１．１ 试验材料苦荞ｃＤＮＡ文库中克隆得到的重组质粒、犈．犮狅犾犻Ｔｏｐ１０由西北农林科技大学生科院酶学实验室保存并馈赠．原核表达载体ｐＥＴ２８ａ、犈．犮狅犾犻ＢＬ２１、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＰＣＲ产物回收试剂盒、质粒ＤＮＡ小量抽提试剂盒购自ＴａＫａＲａ公司．犈犮狅犚Ⅰ、犛犪犾Ⅰ购自Ｆｅｎｍｅｎｔａｌ公司；犘犳狌ＴｕｒｂｏＤＮＡ聚合酶购自Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公司；Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ购自上海生工公司．钴离子螯合层析介质Ｔａｌｏｎｒｅｓｉｎ购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司．Ｈｉｓ ｔａｇ鉴定相关试剂购自Ｐｉｅｒｃｅ公司．１．２ 引物设计与目的基因的扩增以苦荞ｃＤＮＡ文库中克隆得到的重组质粒为模板，选择完整ＯＲＦ（１４７３ｂｐ）中去除编码信号肽后的序列设计引物，上游引物Ｐ１：５′ ＣＧＧＣＣＧ ＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣ ３′（下划线处为ＥｃｏＲⅠ酶切位点），下游引物Ｐ２：５′ ＧＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＡＣＴＣＣＴＣＡＡＴＡＧＣＣＡＡＴＧＧＡＡＣＡ ３′（下划线处为犛犪犾Ⅰ酶切位点）．ＰＣＲ扩增反应体系为２５μＬ，包括模板１μＬ，１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，上游引物Ｐ１（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）和下游引物Ｐ２（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）各０．５μＬ，ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ，ＭｇＳＯ４（３５ｍｍｏｌ／Ｌ）１．５μＬ，狆犳狌犜狌狉犫狅ＤＮＡ聚合酶０．５μＬ，超纯水补加至２５μＬ．ＰＣＲ扩增程序为：９５℃预变性２ｍｉｎ；９５℃变性１５ｓ，５０℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ．琼脂糖凝胶电泳检测，ＰＣＲ产物回收试剂盒回收产物．１．３ 原核表达载体的构建用犈犮狅犚Ⅰ和犛犪犾Ⅰ分别对ＰＣＲ产物和载体ｐＥＴ２８ａ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收后，用Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ于１６℃连接过夜，将连接产物转入Ｔｏｐ１０感受态细胞，涂布在有卡那霉素（终浓度为１００μｇ／ｍＬ）的ＬＢ平板上．经菌落ＰＣＲ验证为阳性的克隆，提取其质粒进行双酶切和测序鉴定，将其命名为ｐＥＴ２８ａ 犛狌犛狔．１．４ 不同条件下重组蛋白犛狌犛狔的表达及表达形式分析将阳性克隆质粒ｐＥＴ２８ａ 犛狌犛狔转入ＢＬ２１感受态细胞，涂布在ＬＢ平板上过夜培养，挑取单菌落接种于５ｍＬ含卡那霉素的ＬＢ液体培养基中（终浓度为５０μｇ／ｍＬ），３７℃培养，待犗犇６００为０．８时取出备用．将备用菌液按１∶１００接种于ＬＢ液体培养基中．１．４．１ 不同诱导温度和不同ＩＰＴＧ浓度下的表达 分别置于２５、２８、３７℃培养，检测犗犇６００为０．８时，分别向菌液中加入终浓度为１．０ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，诱导６ｈ．３７℃培养时分别加入终浓度为０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，诱导６ｈ后，ＳＤＳ ＰＡＧＥ检测，分离胶浓度为１２．５％．２７第３期李慧婧等：苦荞蔗糖合酶ＳｕＳｙ基因在大肠杆菌中的表达及其纯化１．４．２ 不同诱导时间下的表达 ２５℃培养，检测犗犇６００为０．８时，加入终浓度为１．２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，诱导２、４、６、８、１０ｈ后，ＳＤＳ ＰＡＧＥ检测．１．４．３ 表达形式的分析 将备用菌液按１∶１００接种于２０ｍｌＬＢ液体培养基中，加入终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，诱导６ｈ，１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ收集菌体，加入１／１０体积的超声裂解液（ｐＨ８．０，５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ，５０ｍｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）２０℃过夜，超声波破碎１０ｍｉｎ，功率３０ｗ，间隔时间１０ｓ，破碎后将菌液１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清和沉淀进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ检测．１．５ 目的蛋白的纯化及犎犻狊 狋犪犵鉴定１．５．１ 亲和层析纯化 向上述沉淀中加入适量洗涤缓冲液Ｉ［１７］（１．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，２％ＴｒｉｔｏｎＸ １００，２０ｍＭＥＤＴＡ）充分悬浮后再次离心，向沉淀中加入适量缓冲液ＩＩ（１×ＰＢＳ，４ｍｏｌ／Ｌ尿素）、涤缓冲液ＩＩＩ（ｐＨ８．０，５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ，５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１％ＴｒｉｏｎＸ １００，２ｍｏｌ／Ｌ尿素）洗涤重悬，共洗涤５次，最后收集沉淀．４℃，８ｍｏｌ／Ｌ尿素［１７］将其充分溶解，缓慢上样于钴离子亲和层析柱，平衡缓冲液（１×ＰＢＳ，８ｍｏｌ／Ｌ尿素）洗脱杂蛋白，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脱目的蛋白，４℃过夜透析，透析液ｐＨ８．０，２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ，５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ．１．５．２ Ｈｉｓ ｔａｇ鉴定 取透析后样品进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ，取出凝胶，脱色液固定１ｈ后用超纯水洗涤两次，弃超纯水．５０ｍＬ特殊染色液染色６ｍｉｎ后用超纯水洗涤，每次１０ｍｉｎ．弃超纯水，向凝胶中加入５０ｍＬ组氨酸标签显色试剂，温和振荡１５ｍｉｎ，再用超纯水洗涤凝胶２次，紫外凝胶成像系统拍照．１．５．３ 重组蛋白的复性 用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解洗涤后的包涵体，分别用３种方法尝试复性［１８］．方法１：溶液Ⅰ（ｐＨ９．０，２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ，５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，６ｍｏｌ／Ｌ尿素）透析，每１２ｈ分别更换１次尿素浓度为４、２ｍｏｌ／Ｌ的溶液；方法２：用溶液Ⅱ（ｐＨ８．０，２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ，５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，４ｍｏｌ／Ｌ尿素，１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，２０ｍｍｏｌ／Ｌβ 巯基乙醇）透析，２４ｈ后尿素浓度换为２ｍｏｌ／Ｌ；方法３：用溶液Ⅲ（ｐＨ８．０，２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ １００，１０％甘油）复性，１０ｈ后更换为ｐＨ８．０，２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ甘氨酸，１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ的溶液．分别取１ｍＬ透析后样品，１２０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心２０ｍｉｎ，取上清，丙酮沉淀３ｈ后，用８０％丙酮洗涤５次后加入适量上样ｂｕｆｆｅｒ，进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析．２ 结果与分析２．１ 苦荞犛狌犛狔基因的扩增电泳结果如图１所示，在１０００～２０００ｂｐ之间有１条特异ＤＮＡ条带（图１），大小与预期结果一致． Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｋｅｒ；１：犛狌犛狔基因的ＰＣＲ产物．Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｋｅｒ；１：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ犛狌犛狔ｇｅｎｅ．图１ 苦荞犛狌犛狔基因的犘犆犚扩增Ｆｉｇｕｒｅ１ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ犛狌犛狔ｇｅｎｅｓ Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｋｅｒ；１：重组质粒犈犮狅犚Ⅰ和犛犪犾Ⅰ的双酶切鉴定；２：重组质粒的ＰＣＲ产物．Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｋｅｒ；１：ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＥＴ２８ａ 犛狌犛狔ｂｙ犈犮狅犚Ⅰ和犛犪犾Ⅰ；２：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｐＥＴ ２８ａ 犛狌犛狔．图２ 重组质粒狆犈犜 ２８犪 犛狌犛狔的犘犆犚和双酶切鉴定Ｆｉｇｕｒｅ２ ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｅｇｅｓｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒｐＥＴ ２８ａ 犛狌犛狔２．２ 原核表达载体的构建重组质粒ｐＥＴ２８ａ 犛狌犛狔进行ＰＣＲ扩增和双酶切的结果如图２所示，大小与预期相符，且测序结果３７甘肃农业大学学报２０２０年证实成功构建了重组表达载体．２．３ 苦荞犛狌犛狔的表达及表达形式的分析如图３Ａ所示，经ＩＰＴＧ诱导后，只有含重组质粒的菌液在约５３．４ｋｕ处表达了目的蛋白，结果与预期大小相符；未表达目的蛋白的有：只转入ｐＥＴ２８ａ的菌液、转入ｐＥＴ２８ａ ＳｕＳｙ但未经诱导的菌液、未转入质粒的菌液．目的蛋白ＳｕＳｙ诱导表达成功．如图３Ｂ所示，经超声裂解后的重组表达菌液，上清（２号泳道）中无蛋白表达，而在沉淀中（３号泳道）５３．４ｋｕ处有明显的条带，这说明苦荞蔗糖合酶在犈．犮狅犾犻．ＢＬ２１中以包涵体形式存在．２．３．１ 不同诱导温度和不同ＩＰＴＧ浓度对犛狌犛狔表达量的影响 如图４Ａ所示，当ＩＰＴＧ浓度相同时，目的蛋白在２５、２８℃的表达量前者高于后者，但在３７℃时表达量较２５℃明显升高，由此可见，３７℃的表达量最高．如图４Ｂ所示，温度相同时，目的蛋白表达量在０．２ｍｍｏｌ／Ｌ时最低，０．４、０．６、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ时变化不明显，１．０ｍｍｏｌ／Ｌ时略微升高，随着ＩＰＴＧ浓度的继续增大至１．２ｍｍｏｌ／Ｌ时表达量最高． Ａ：ＳｕＳｙ的诱导表达，Ｍ：蛋白质ｍａｒｋｅｒ；１：重组对照；２：重组诱导；３：空质粒对照；４：空质粒诱导；５：未诱导菌；６：诱导空菌．Ｂ：ＳｕＳｙ表达形式的分析，Ｍ：蛋白质ｍａｒｋｅｒ；１：未诱导菌裂解液；２：超声破碎后上清；３：超声破碎后沉淀；４：全菌体蛋白．Ａ：ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｕＳｙ，Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；１：Ｎｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄｐＥＴ２８ａ 犛狌犛狔；２：ＩｎｄｕｃｅｄｐＥＴ２８ａ 犛狌犛狔；３：Ｎｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄｐＥＴ２８ａ；４：ＩｎｄｕｃｅｄｐＥＴ２８ａ；５：Ｎｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄｃｏｎｔｒｏｌ；６：Ｉｎｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａ．Ｂ：ＦｏｒｍｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｕＳｙ，Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；１：Ｌｙｓａｔｅｓｏｆｎｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａ；２：Ｓｕｐｅｒ ｎａｔａｎｔｆｒｏｍｉｎｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａ；３：Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｆｒｏｍｉｎｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａ；４：Ｔｏｔａｌｌｙｓａｔｅｓｆｒｏｍｉｎｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａ．图３ 重组蛋白犛狌犛狔的表达及表达形式鉴定Ｆｉｇｕｒｅ３ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｏｒｍｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｕＳｙ Ａ：不同温度下的表达，Ｍ：蛋白ｍａｒｋｅｒ；１：未诱导菌；２：１～４分别为２５、２８、３７℃诱导菌．Ｂ：不同ＩＰＴＧ浓度下的表达，Ｍ：蛋白ｍａｒｋｅｒ；１：未诱导菌；２～７：分别经０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导菌．Ａ：ＳｕＳｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅ，Ｍ：ＰｒｏｔｅｉｎＭａｒｋｅｒ；１：Ｎｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａ；２：１～４：ｉｎｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａｗｉｔｈ２５，２８，３７℃，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｂ：ＳｕｓｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔＩＰＴＧｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；１：Ｎｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａ；２～７：Ｉｎｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａｗｉｔｈ０．２，０．４，０．６，０．８，１．０，１．２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．图４ 犛狌犛狔在不同温度和不同犐犘犜犌浓度下的表达Ｆｉｇｕｒｅ４ ＳｕＳｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅａｎｄＩＰＴＧｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ４７第３期李慧婧等：苦荞蔗糖合酶ＳｕＳｙ基因在大肠杆菌中的表达及其纯化２．３．２ 不同时间对ＳｕＳｙ表达量的影响 如图５所示，３７℃、ＩＰＴＧ终浓度为１．２ｍｍｏｌ／Ｌ诱导至２ｈ时，目的蛋白的表达量最低，随着时间的增加，其表达量也在逐渐增加，１０ｈ时表达量最大．２．４ 融合蛋白的纯化２．４．１ 包涵体的洗涤和亲和层析 如图６Ａ所示，与洗涤前（泳道１）比较而言，多次洗涤和溶解后的重组蛋白包涵体（泳道２ ４）已被除去大量杂蛋白，亲和层析柱纯化后结果如图６Ｂ所示，纯化的单一条带与预期相符，说明目的蛋白ＳｕＳｙ纯化成功．２．４．２ 目的蛋白的Ｈｉｓ ｔａｇ鉴定 将纯化的目的蛋白进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ，考马斯亮蓝Ｒ ２５０染色（图７ Ｂ）与Ｈｉｓ ｔａｇ试剂鉴定（图７ Ａ）的结果相比较可 Ｍ：蛋白Ｍａｒｋｅｒ；１：未诱导菌；２～６：诱导２、４、６、８、１０ｈ的菌液．Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；１：Ｎｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａ；２～６：Ｉｎｄｕｃｅｄｂａｃ ｔｅｒｉａａｔ２，４，６，８，１０ｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．图５ 犛狌犛狔在不同诱导时间的表达Ｆｉｇｕｒｅ５ ＳｕＳｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｉｍｅ Ａ：包涵体电泳检测，Ｍ：蛋白ｍａｒｋｅｒ；１：未洗涤包涵体；２～４：洗涤后包涵体．Ｂ：亲和层析纯化后蛋白，Ｍ：蛋白ｍａｒｋｅｒ；１：纯化后的蛋白．Ａ：ＳＤＳ ＰＡＧＥｏｆｉｎｃｌｕｓｉｎｂｏｄｉｅｄ，Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；１：Ｕｎｗａｓｈｅｄｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ；２～４：Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓａｆｔｅｒｗａｓｈｉｎｇ．Ｂ：ＰｕｒｉｆｉｅｄＳｕＳｙｐｒｏｔｅｉｎｂｙａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；１：Ｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎ．图６ 纯化犛狌犛狔的犛犇犛 犘犃犌犈Ｆｉｇｕｒｅ６ ＳＤＳ ＰＡＧＥｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄＳｕＳｙ以看出，试验纯化所得蛋白即带有Ｈｉｓ标签的重组蛋白．由于图７ Ｂ所用蛋白Ｍａｒｋｅｒ带Ｈｉｓ标签，所以在紫外成像时也显色．２．４．３ 复性蛋白检测 将尝试复性后的蛋白进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析，结果如图８所示，透析后目的蛋白都在沉淀里，而上清中无目的蛋白，说明透析后没有得到复性的蛋白．３ 讨论保守结构域分析表明，苦荞ＳｕＳｙ含有１个ＧＴ１糖基化酶功能结构域和４个ＡＤＰ结合位点，能够催化果糖 ６ 磷酸和尿苷 ５′二磷酸葡萄糖形成蔗糖 ６ 磷酸［１５］．而ＳｕＳｙ在苦荞中发挥的生理功能还有待进一步证实．本试验构建了原核表达载体ｐＥＴ２８ａ 犛狌犛狔，实现了重组蛋白在大肠杆菌ＢＬ２１中的高效表达，在３７℃、１．２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导１０ｈ时表达量最高，最终以包涵体形式存在．外源基因利用大肠杆菌系统表达蛋白，有时易形成包涵体［１９］，原因复杂，可能由于苦荞ＳｕＳｙ的二级结构［１５］的组成，使得变性二硫键的正常形成、肽链正确折叠恢复到原来的构象比较困难．怎样才能获得可溶性表达的蛋白是后续需要解决的问题．已有研究表明，通过优化培养基和降低温度［２０］，或是利用共表达热激分子伴侣（如ＧｒｏＥＬ等）的方法，可以促进外源蛋白正确折叠和高水平可溶性表达［２１］．在体外大量表达蛋白质时，常通过分子克隆的５７甘肃农业大学学报２０２０年 Ａ：Ｈｉｓ ｔａｇ鉴定，Ｍ：蛋白Ｍａｒｋｅｒ；１～２：Ｈｉｓ ｔａｇ鉴定后的目的蛋白．Ｂ：考马斯亮蓝Ｒ ２５０染色，Ｍ：蛋白Ｍａｒｋｅｒ；１～２：考马斯亮蓝Ｒ ２５０染色后的目的蛋白．Ａ：Ｈｉｓ ｔａｇｏｆＳｕＳｙ，Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅ；１～２：Ｈｉｓ ｔａｇｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂ：ＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅＲ ２５０ｓｔａｉｎｉｎｇ，Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；１～２：ＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅＲ ２５０ｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎ．图７ 纯化后犛狌犛狔的犎犻狊 狋犪犵检测Ｆｉｇｕｒｅ７ Ｈｉｓ ｔａｇｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄＳｕＳｙ Ｍ：蛋白ｍａｒｋｅ；１～３：复性后沉淀；４～６：复性后上清．Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；１～３：Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；４～６：Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎａｆｔｅｒｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．图８ 包涵体复性结果分析Ｆｉｇｕｒｅ８ ＴｈｅＳＤＳ ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｎｃｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓｒｅｆｏｌｄｉｎｇ方法，在目的蛋白的Ｎ端加入表达标签以构建重组融合蛋白，该标签能够与亲和层析柱可逆性、特异性地结合，从而有效分离含有目的蛋白质的重组蛋白，常见的表达标签有Ｈｉｓ ｔａｇ．１９７５年，金属螯合亲和层析第１次被用于纯化蛋白［２２］，因其分离过程简单、快速、分辨率高，已在生物分离中广泛应用．本试验选用原核表达载体ｐＥＴ２８ａ，具有蛋白表达量高、自身带有Ｈｉｓ ｔａｇ的优点，在ＳｕＳｙ蛋白的Ｎ端引入ｐＥＴ２８ａ所带标签，其中的组氨酸能够与金属离子Ｃｏ２＋发生相互作用而紧密结合，在洗脱过程中，凝胶介质与目的蛋白牢固结合，从而达到分离纯化的目的．纯化出的重组蛋白可以不用事先切掉６×Ｈｉｓ ｔａｇ便用做抗原产生抗体［２２］，为制备苦荞蔗糖合酶的多克隆抗体奠定基础．４ 结论本研究构建了重组表达载体ｐＥＴ２８ａ 犛狌犛狔，诱导其在大肠杆菌中成功表达了苦荞ＳｕＳｙ重组蛋白，并采用Ｃｏ２＋亲和柱层析纯化和Ｈｉｓ ｔａｇ鉴定得到了高纯度的重组ＳｕＳｙ蛋白，为进一步研究该酶的结构与功能及多克隆抗体的制备奠定了基础．参考文献［１］ ＨａｒｄｉｎＳＣ，ＨｕｂｅｒＳＣ．Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｈｅｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｎｍａｉｚｅｌｅａｖｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，２００４，４２（３）：１９７ ２０８．［２］ ＰｅｒｓｉａＤ，ＣａｉＧ，ＤｅｌＣＣ，ｅｔａｌ．Ｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｅｌｌｗａｌｌｏｆｔｏｂａｃｃｏｐｏｌｌｅｎｔｕｂｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｓｉｏｌ，２００８，１４７（４）：６０３ ６１８．［３］ ＥｌｌｉｎｇＬ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｍｅｔａｌｉｏｎｓｏｎｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅｆｒｏｍｒｉｃｅｇｒａｉｎｓ ａｓｔｕｄｙｏｎｅｎｚｙｍｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍｅｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，５（２）：２０１ ２０６．［４］ 李丽娜，孔建强．植物蔗糖合酶的结构、功能及应用［Ｊ］．中国生物化学与分子生物学报，２０１５，３１（９）：９０４９１３．［５］ 房经贵，朱旭东，贾海锋，等．植物蔗糖合酶生理功能研究进展［Ｊ］．南京农业大学学报，２０１７，４０（５）：７５９ ７６８．［６］ ＲｕａｎＹＬ，ＬｌｅｗｅｌｌｙｎＤＪ，ＦｕｎｒｂａｎｋＲＴ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｐｒｅｓｓｅｓｃｏｔｔｏｎｆｉｂｅｒｃｅｌｌｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ，ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ，ａｎｄｓｅｅｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２００３，１５（４）：９５２ ９６４．［７］ ＧｏｒｄｏｎＡＪ，ＭｉｎｃｈｉｎＦＲ，ＪａｍｅｓＣＬ，ｅｔａｌ．Ｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅｉｎｌｅｇｕｍｅｎｏｄｕｌｅｓｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，１９９９（１２０）：８６７ ８７７．［８］ 柴静，张会，姚丽丽，等．蔗糖合酶在植物生长发育中的作用研究［Ｊ］．生命科学，２０１２，２４（１）：８１ ８８．［９］ ＤｕｎｃａｎＫＡ，ＨａｒｄｉｎＳＣ，ＨｕｂｅｒＳＣ．Ｔｈｅｔｈｒｅｅｍａｉｚｅｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅｉｓｏｆｏｒｍｓｄｉｆｆｅｒｉｎｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６，４７（７）：９５９ ９７１．［１０］ ＬｉＪ，ＢａｒｏｊｉａＦ，ＢａｈａｊｉＡ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｓｕｌｔｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｌｅｖｅｌｓｏｆｓｔａｒｃｈａｎｄ６７第３期李慧婧等：苦荞蔗糖合酶ＳｕＳｙ基因在大肠杆菌中的表达及其纯化ＡＤＰ ｇｌｕｃｏｓｅｉｎｍａｉｚｅ（犣犲犪犿犪狔狊Ｌ．）ｓｅｅｄｅｎｄｏｓｐｅｒｍｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１３，５４（２）：２８２ ２９４．［１１］ ＣｈｏｕｒｅｙＰＳ，ＮｅｌｓｏｎＯＥ．Ｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｂｙｔｈｅｓｈｒｕｎｋｅｎ １ｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＧｅｎｅｔ，１９７６，１４（１１）：１０４１ ５５．［１２］ 荆丹，张莉，张建农．三个西瓜品系果实发育期间糖积累域糖代谢相关酶活性之间的关系［Ｊ］．甘肃农业大学学报，２０１７，５２（５）：２８ ３３．［１３］ ＨｕａｎｇＫＦ，ＳｈｉＺ，ＳｏｎｇＹＸ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｖａｒｉａ ｔｉｏｎｉｎｓｕｃｒｏｓｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆａｍｏｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔＴａｒｔａｒｙＢｕｃｋｗｈｅａｔｇｅｎｏｔｙｐｅｓ［Ｊ］．ＥｃｏｎｏｍｉｃＧｒｏｐｓＭｅｄｉｃｉｎａｌＰｌａｎｔｓａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，１２（２）：２１１ ２１３．［１４］ ＳｈｉＺ，ＳｏｎｇＹ，ＨａｎＣＨ，ｅｔａｌ．ＶａｒｉａｔｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｅｃｏｎｔｅｎｔｉｎＴａｒｔａｒｙＢｕｃｋｗｈｅａｔｓｅｅｄｓ［Ｊ］．ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２０１１，１２（２）：２１４ ２１６．［１５］ 燕雪芬，李玉萍，张海纳，等．苦荞蔗糖合酶基因克隆及序列分析［Ｊ］．西北农业学报，２０１５，２４（１１）：８０ ８６．［１６］ 张涛，罗维玉，姜水涛，等．蛋白激酶Ｒ的原核表达、纯化及多克隆抗体制备［Ｊ］．甘肃农业大学学报，２０１６，５１（１）：７ １２．［１７］ 李新宇．一种利用原核表达系统高效制备蛋白质标准的方法［Ｄ］．杨凌：西北农林科技大学，２０１１．［１８］ ＸｕｅＸＣ，ＷａｎｇＺＬ，ＹａｎＺ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒ ｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＢｌｙＳｍｕｔａｎｔｆｒｏｍｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２００５：４２（１）：１９４ １９９．［１９］ 汪家政，范明．蛋白质技术手册［Ｍ］．北京：科学出版社，２００５．［２０］ 乐易林．大肠杆菌热激反应研究及其在重组蛋白表达中的应用［Ｊ］．微生物学通报，２０１３，４０（１１）：２０９０２０９６．［２１］ ＹａｎＸ，ＨｕＳ，ＧｕａｎＹＸ，ｅｔａｌ．Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｈａｐ ｅｒｏｎｉｎＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳｍａｒｋｅｄｌｙｅｎｈａｎｃｅｄｓｏｌｕｂｌｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａｉｎ犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，９３（３）：１０６５ １０７４．［２２］ 余冰宾．生物化学实验指导［Ｍ］．２版．北京：清华大学出版社，２０１０．（责任编辑 汪丹丹）（上接第７０页）［１７］ 王君杰，陈凌，曹晓宁，等．密度与氮肥互作对糜子产量及氮素利用效率的影响［Ｊ］．山西农业科学，２０１５，４３（１０）：１２７９ １２８４，１２８９．［１８］ 张美俊，乔志军，等．不同糜子品种对低氮胁迫的生物学响应［Ｊ］．植物营养与肥料学报，２０１４，２０（３）：６６１６６９．［１９］ 张美俊，乔志军，等．糜子氮、磷、钾肥的效应及优化研究［Ｊ］．植物营养与肥料学报，２０１３，１９（２）：３４７ ３５３．［２０］ 鲍士旦．土壤农化分析［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２０００：２６８ ２７０．［２１］ 党红凯，李瑞奇，李雁鸣，等．超高产栽培条件下冬小麦对磷的吸收、积累和分配［Ｊ］．植物营养与肥料学报，２０１２，１８（３）：５３１ ５４１．［２２］ 赵俊晔，于振文，等．施氮量对小麦氮磷钾养分吸收利用和产量的影响［Ｊ］．西北植物学报，２００６，２６（１）：９８１０３．［２３］ 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植物基因在大肠杆菌中的原核表达
通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。
植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。
当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。
不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。
以pET-32a(+)为例，介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组蛋白的过程，从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程。
1.准备工作（试剂配置和器材准备）
1)操作流程示意图
主要步骤操作
①制备pET-32a(+)载体用限制性酶消化，去磷酸化后胶纯化回收
②制备插入DNA PCR装入质粒后进行限制性消化，再回收
③插入片段克隆到pET-32a(+)载体插入片段与pET连接，转化
④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株
⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印迹、定量分析确定目的蛋白
⑥放大试验纯化目的蛋白放大试验，制备粗提物，亲和纯化，切除融合标签
2)配制生长培养基如LB，和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液。
3)宿主菌的保存。
长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中。
4)感受态细胞的制备，参照其它试验手册。
2.操作步骤
[1] 制备载体
1）载体消化和胶纯化
3μg pET载体
3μl 10×限制性内切酶buffer
10-20U 两种酶（是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%）
3μl 1mg/ml乙酰BSA（根据需要
补足水到30μl
2)37℃温浴2-4h
3)取3μl样品进行电泳检测消化反应进行的程度
4)消化完全后，加入0.05U小牛碱性磷酸酶，37℃ 30min
5)全部样品在1%琼脂糖胶上电泳，切带按照胶回收试剂盒说明回收目标片段。
6)-20℃保存备用。
[2]制备插入片段
限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。
一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因，克隆进T－载体，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。
但在PCR过程中，需要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。
[3]在pET32a载体中插入片段
连接反应
2μl 10×连接buffer
2-5μl 50ng/μl 预制的pET32a载体
1μl T4连接酶
5-7μl 预制目标基因插入片段
加水到20μl，枪头混匀，16℃反应2h－过夜
[4]转化
转化方法同T－载体转化大肠杆菌DH5α一样，既可转化BL21也可转化DH5α，若转化DH5α，需要重新抽提质粒，再转化BL21。
筛选LB平板需含50μg/μl 卡那霉素。
[5]pET重组子鉴定
如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落。
检验转化子的方法很多，包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序，体外转录和翻译。
[6]DE3溶原菌的诱导表达
（1）、从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50μg/μl 卡那霉素的液体培养基中，37℃培养至OD600为0.4-1。
（2）、培养基中加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM（T7启动子）或1 mM（T7lac启动子），继续培养2-3小时。
（3）、将摇瓶置于冰上5min，5000g 4℃离心5min收集菌体。
（4）、重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mMTris-HCl （pH8.0）中，离心。
（5）、除去上清，菌体保存于-70℃或继续纯化。
[7]SDS-PAGE进行目标蛋白质分析
（1）、机械破碎细胞。
一般用弗氏压碎法或超声波处理。
（2）、裂解液14000g离心10min，分离可溶和不溶部分。
（3）100μl可溶上清中加入100μl 4×SDS上样buffer和水。
85℃迅速加热3min使蛋白变性，然后上样进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达。
（4）若目标蛋白在不溶部分中，需进行包涵体纯化。
750μl20mMTris-HCl,pH7.5重悬沉淀，离心10000g5min,除去上清重复洗涤。
然后1.5ml 1%SDS上样buffer中重悬沉淀，重复（3）的步骤进行SDS-PAGE分析。
3.总结（注意事项）
(1)所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性；
(2)根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。
(3)构建好的载体最好进行测序验证，保证读码框正确，即没有移码。
(4)长期保存的pET重组子在高浓度甘油（19%）中会导致质粒不稳定。
(5)T7lac启动子是严谨启动子，IPTG诱导时可以优化最佳浓度（25uM-1mM之间）使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。
(6)37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。
在某些情况下，低温（15－20℃）延长诱导时间（过夜）可以使溶解性蛋白的产量达到最大。
(7)进行SDS-PAGE分析时，需优化电泳上样体积。