分子荧光与分子磷光光谱法
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分子发光光谱法
内转换
内转换：同多重度电子能级中，等能级间的无辐 射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子 跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换 外转换：激发分子与溶剂或其他 分子之间产生相互作用而转移能 量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“ 猝灭”。
系间跨越 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非 辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道 耦合进行。
荧光强度对温度变化敏感。
一般地，随温度降低，溶液中荧光物质的量子效率和荧光强
度将增大，并伴随光谱的蓝移。温度增加，碰撞频率增加， 使外转换的去激发几率增加。
(3) pH的影响
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 如苯胺：在pH 5-12溶液中，以分子形式存在，有荧光。
pH< 5时以苯胺阳离子形式存在，无荧光
ex em
（3）可变波长同步扫描荧光法：使两单色器在扫描过程中以 不同的速率同时进行扫描，即波长可变。
同步扫描荧光法的特点：
优点：
（1）使光谱简化； （2）使谱带窄化；
（3）减小光谱的重叠现象；
（4）减小散射光的影响。
例如：采用同步扫描技 术检测如图萘、蒽、菲 、芘混合物，可简化光 谱，减少光谱重叠，提 高分辨率。 缺点： 因为同步扫描荧光损失了 其它光谱带所含的信息， 对光谱学的研究不利。
比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，直接
比较。
三、荧光分析法的应用
可采用直接测定法或间接测定（荧光猝灭）法
1、无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
分子荧光和磷光光谱分析法讲解
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
2、荧光、磷光的寿命和量子产率
荧光寿命τf ：荧光分子处于S1激发态的平均寿命
f
1 (kf
K)
k f ：荧光发射过程的速率常数
K ：各种分子的非辐射衰变过程的速率常
数的总和。
典型分子的荧光和磷i 在光 10-8~ 10-10s
光谱分析法讲解
➢ 磷光寿命τp ：磷光分子处于T1激发态的平均寿命。
f kf (kf K)
➢ 荧光量子产率的大小取决于荧光发射与非辐射 跃迁过程的竞争结果。
K << k f
f 1
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 磷光量子产率（p）
p
S
TKp
Kp
Kj
K p ：磷光发射的速率常数
ST ：S1 T1系间窜越的量子产率
Kj ：与磷光发射过程相竞争的从T1态发生 的所有非辐射跃迁过程的速率常数的
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
振动弛豫：分子将多余的振动能量传递给介质而 衰变到同一电子能级的最低振动能级 的过程。
内转化：相同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁过程。
例如： S1 S0
T2 T1
系间窜越：不同多重态的两个电子态间的非辐射 跃迁过程。
2、荧光、磷光的寿命和量子产率
荧光寿命τf ：荧光分子处于S1激发态的平均寿命
f
1 (kf
K)
k f ：荧光发射过程的速率常数
K ：各种分子的非辐射衰变过程的速率常
数的总和。
典型分子的荧光和磷i 在光 10-8~ 10-10s
光谱分析法讲解
➢ 磷光寿命τp ：磷光分子处于T1激发态的平均寿命。
f kf (kf K)
➢ 荧光量子产率的大小取决于荧光发射与非辐射 跃迁过程的竞争结果。
K << k f
f 1
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 磷光量子产率（p）
p
S
TKp
Kp
Kj
K p ：磷光发射的速率常数
ST ：S1 T1系间窜越的量子产率
Kj ：与磷光发射过程相竞争的从T1态发生 的所有非辐射跃迁过程的速率常数的
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
振动弛豫：分子将多余的振动能量传递给介质而 衰变到同一电子能级的最低振动能级 的过程。
内转化：相同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁过程。
例如： S1 S0
T2 T1
系间窜越：不同多重态的两个电子态间的非辐射 跃迁过程。
荧光和磷光解析
一、基本原理
（1）螯合物中配位体的发光
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构， 分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金 属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大， 常会发生荧光。
如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但 其金属螯合物具有很强的荧光
一、基本原理
（2）螯合物中金属离子的特征荧光 这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发， 接着配位体把能量转给金属离子，导致dd 跃迁和ff 跃迁， 最终发射的是d*d跃迁和f *f 跃迁光谱。
一、基本原理
单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s， 而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s 以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。
一、基本原理
1.2 激发态分子退激 辐射跃迁方式 无辐射跃迁方式
辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射
无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛 豫（VR）、内部转移（IR）、系间窜跃（IX）及外部转移 （EC）等
一、基本原理
（3）镜像规则
通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。
S2
S1 T1
S0
吸光1
吸光2
荧光3
一、基本原理
（3）镜像规则 通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。 吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能 级形成的。其形状决定于第一电子激发态中各 振动能级的分布 情况。
激发波长的选择与发射波长的判断
一、基本原理
2.3 荧光发射光谱的普遍特性： （1）Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长， 称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去能 量，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量 的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。
第十一章 分子发光―荧光、 磷光和化学发光光谱法Molecular .
已逐步形成一支在这个研究领域中的工作队伍，研究内
容2已020从/6/15经典的荧光分析方扩展到新近发展起来的新技术。
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§11－1 分子荧光和磷光光谱法
1．产生机理
在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动 能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化 学能或光能等到)后天激发为激发态。激发态是很 不稳定的，它得很快地释放出能量又重新跃迁回 基态。若分子返回基态时以发射的电磁辐射(即光) 的形式释放能量，就称为“发光”；如果物质的 分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的 电磁辐射，称为荧光和磷光。现从分子结构理论 来讨论荧光和磷光的产生机理。
进入二十世纪以后，荧光现象被研究得更多了，在理论 或实验技术上都得到极大的发展。特别是随着激光、计 算机和电子学的新成就及技术的引入，大大推动了荧光 分析法在理论上及实验技术的发展，出现了许多新的理 论和新的方法。
在我国，二十世纪五十年代初期仅有极少数的分析工作
者从事荧光分析方面的研究工作。到了 下一张幻灯片
磷光也是某些物质受紫外光照射后产生的光。1944年 Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念，指出磷光 是分子从亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光， 它有别于从激发单态跃迁回基态所发射的荧光。磷光分 析法由于其有某些特点，几十年来的理论研究及应用也 不断得到发展。
2020/6/15
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处于分子基态单重态的分子轨道上的电子，激发 时不能直接跃迁至第一激发三重态轨道上（不符 合光谱选择定则），但处于单重激发态的轨道上 的电子，可以通过体系跨越（系间窜跃），转移 到三重态轨道上；在这个过程中，处于激发态的 电子自旋发生变化，这个过程需要时间较长，故 处于三重激发态的寿命为10－4~1s；当其由三重激 发态的最低振动能级跃迁回基态时产生磷光。
第七章 分子发光-荧光与磷光解读
激发光谱
发射光谱
l
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
蒽的激发光谱和荧光光谱
500 nm
三、荧光光谱的特征—激发光谱与发射光谱的关系
1、Stokes位移 在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的吸收(或激 发)光谱的波长长，荧光发射这种波长位移的现象称为Stokes 位移。 处于激发态的分子一方面由于振动弛豫等损失了部分能量，
T1
紫 外 可 见 吸 收 光 谱
紫 外 可 见 共 振 荧 光 S0 光 谱
S1
迟 滞 荧 光
振动弛豫: Vr 10-12sec 外 转 移:无辐射跃迁 回到基态 内 转 移:S2~S1能级 之间有重叠 系间窜跃: S2~T1能级 之间有重叠 反系间窜跃:由外部获 取能量后 T1 ~ S2
磷 光
外转移
蒽的发射光谱
蒽的三维等高线光谱图
蒽的三维等荧光强度光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3.三维共振光散射光谱
ADS ATS ADS ATS RLS DS TS
RLS
DS
TS 散射片三维共振光散射光谱
固定lex=270nm
共振光散射 瑞利散射 拉曼光 二级共振光散射 三级共振光散射
500 550 600 650 700 750 800 850 900
2.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单 重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
S0→T1 禁阻跃迁；
通过其他途径进入
分子荧光和磷光光谱ppt
荧光分析方法与应用
1. 特点
（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1～0.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。
（2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；
（3）试样量少 缺点：应用范围小。
定量依据与方法
吡啶硫胺荧浓度
42
荧光分析法的应用
(1)无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
维生素B2
• ——又称核黄素，是一种生 长促进剂，常存在于动物肝 脏、肉类、蛋黄、豆类、花 生、蘑菇和海藻中， VB2易 溶于强酸或强碱性溶液。
§-R、-SO3H、-NH3+→对f 无影响
影响荧光的外部效应
1.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形 成都将使化合物的荧光发生变化；
§极性↑→f↑→F↑→l↑ §粘度↓→分子间碰撞几率↑→F↓ §含重原子(CBr4、CH3CH2I)→F↓ §形成氢键→S1*(V=0) 分子↓→F↓
lex =385nm
吡啶硫胺荧CP lex =410nm
lem=435nm lem=480nm
n在385nm下激发，在435和 480nm下分别测荧光强度,
n或410nm下激发在435和 480nm下分别测荧光强度,
相互干扰荧 光光谱重叠
n 在385nm下激发，在435和480nm下分别测荧光强度 If 435/385=26339104cT+210 104cP
第二章第二节分子荧光和磷光分析法
带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基 丙氨酸，可以直借用荧光法测定。
芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多 能发荧光。此外，胺类、蛋白质、酶与辅酶 、维生素等均可用荧光法进行分析。
见表.
11:04:30
11:04:30
磷光分析法基本原理
一、磷光的产生和磷光强度 磷光是由处于第一激发三重态的最低振动能级的
3.室温磷光 (1)固体磷光法：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子 刚性,减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率 。 滤纸、纤维素色层纸、氧化铝、硅胶等
11:04:30
(2)胶束增稳： 利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变
磷光体的微环境，增加定向约束力，使其刚性增强。从而减 小碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性．
对于较浓溶液， 由于猝灭 现象和自吸收等原因，使荧光强 度与浓度不成线性关系。
问:为什么荧光分析法的灵敏度比相应的吸收光度法高?
①荧光强度叠加在很小的背景值上，提高荧光讯号的放大 倍数;
② I0↑
A= lg(I0/It)
11:04:30
（2）定量方法
1. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)；
2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(If), 根据工作曲线计算荧光
如：pH=8.50,Cu2+能催化过氧化氢氧化罗丹明6G,使其发 生荧光猝灭,建立了测定微量Cu2+的催化荧光分析法.
如:铀的测定:将80gNaF压制成片,取含铀溶液滴在片上,在 1000℃烧成熔珠后测量.
11:04:30
11:04:30
(2)生物与有机化合物的分析
脂肪族有机化合物—般需要与某些试剂反 应后才能进行荧光分析。
芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多 能发荧光。此外，胺类、蛋白质、酶与辅酶 、维生素等均可用荧光法进行分析。
见表.
11:04:30
11:04:30
磷光分析法基本原理
一、磷光的产生和磷光强度 磷光是由处于第一激发三重态的最低振动能级的
3.室温磷光 (1)固体磷光法：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子 刚性,减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率 。 滤纸、纤维素色层纸、氧化铝、硅胶等
11:04:30
(2)胶束增稳： 利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变
磷光体的微环境，增加定向约束力，使其刚性增强。从而减 小碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性．
对于较浓溶液， 由于猝灭 现象和自吸收等原因，使荧光强 度与浓度不成线性关系。
问:为什么荧光分析法的灵敏度比相应的吸收光度法高?
①荧光强度叠加在很小的背景值上，提高荧光讯号的放大 倍数;
② I0↑
A= lg(I0/It)
11:04:30
（2）定量方法
1. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)；
2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(If), 根据工作曲线计算荧光
如：pH=8.50,Cu2+能催化过氧化氢氧化罗丹明6G,使其发 生荧光猝灭,建立了测定微量Cu2+的催化荧光分析法.
如:铀的测定:将80gNaF压制成片,取含铀溶液滴在片上,在 1000℃烧成熔珠后测量.
11:04:30
11:04:30
(2)生物与有机化合物的分析
脂肪族有机化合物—般需要与某些试剂反 应后才能进行荧光分析。
分子荧光与分子磷光
光与物质作用产生激发态分子，其返回基态时的发光现象称为光致发光，荧光和磷光都是光致发光。
多环芳烃和某些金属配合物分子结构中含有大平面丌电子共轭体系，是常见的荧光分子，可以直接进行荧光分析。
对于那些无荧光或荧光较弱的分子，通过与荧光试剂反应后可进行间接荧光分析。
分子荧光光谱法某些物质被紫外光照射激发后，在回到基态的过程中发射出比原激发波长更长的荧光，通过测量荧光强度进行定量分析的方法。
测定原理：由光源发射的光经第一单色器得到所需的激发光波长，通过样品池后，一部分光能被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发射荧光。
为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行。
为消除可能共存的其它光线的干扰，如由激发所产生的反射光、Raman光以及为将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，在样品池和检测器之间设置了第二单色器。
荧光作用于检测器上，得到响应的电信号。
（1）激发光源在紫外-可见区范围，通常的光源是氙灯和高压汞灯。
（2）样品池荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英，形状以方形和长方形为宜。
（3）单色器光栅（4）检测器由光电管和光电倍曾管作检测器，并与激发光成直角。
荧光分析方法的特点：（1）灵敏度高（2）选择性强（3）试样量少和方法简单（4）提供比较多的物理参数荧光分析法的弱点是它的应用范围小。
因为本身能发荧光的物质相对较少，用加入某种试剂的方法将非荧光物质转化为荧光物质进行分析，其数量也不多；另一方面，由于荧光分析的灵敏度高，测定对环境因素敏感，干扰因素较多。
分子磷光光谱法处于第一最低单重激发态分子以无辐射弛豫方式进入第三重激发态，再跃迁返回基态发出磷光。
测定磷光强度进行定量分析的方法。
分子磷光与分子荧光光谱的主要差别是磷光是第一激发单重态的最低能层，经系间跨越跃迁到第一激发三重态，并经振动弛豫至最低振动能层，然后跃迁回到基态发生的。
与荧光相比，磷光具有如下三个特点：（1）磷光辐射的波长比荧光长，分子的T1态能量比S1态低。
第七章 分子发光分析
22:50
如8-巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况
溶剂 介电常数 四氯化碳 2.24 氯仿 5.2 丙酮 21.5 乙腈 38.8
荧光峰λ/nm 荧光效率
390
0.002
398
0.041
405
0.055
410
0.064
22:50
③ 溶液pH值对荧光强度的影响 不同的pH值，化合物所处状态不同，不同的 化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有 所不同。 对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物， 一方面pH会影响鏊合物的形成，另一方面还会 影响鏊合物的组成，因而影响它们的荧光性质。 如：苯酚在酸性溶液中呈现荧光，但在碱性 溶液中，无荧光。
浓度范围为：10-5μg/ml～100μg/ml 。对于较 浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光 强度和浓度不呈线性关系,将向浓度轴偏离。
22:50
（2）影响荧光强度的因素 ① 溶剂对荧光强度的影响 一般来说，随着溶剂介电常数的增大，荧光 峰的波长越大，荧光效率也越大。 ② 温度对荧光强度的影响 温度上升使荧光强度下降。
22:50
① 碰撞猝灭 处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰 撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方 式回到基态，产生猝灭作用。 。
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧 光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液 吸收光谱的改变。
22:50
③ 氧的猝灭作用 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三 重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们 在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭 效应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的 荧光物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子 和三重态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
如8-巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况
溶剂 介电常数 四氯化碳 2.24 氯仿 5.2 丙酮 21.5 乙腈 38.8
荧光峰λ/nm 荧光效率
390
0.002
398
0.041
405
0.055
410
0.064
22:50
③ 溶液pH值对荧光强度的影响 不同的pH值，化合物所处状态不同，不同的 化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有 所不同。 对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物， 一方面pH会影响鏊合物的形成，另一方面还会 影响鏊合物的组成，因而影响它们的荧光性质。 如：苯酚在酸性溶液中呈现荧光，但在碱性 溶液中，无荧光。
浓度范围为：10-5μg/ml～100μg/ml 。对于较 浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光 强度和浓度不呈线性关系,将向浓度轴偏离。
22:50
（2）影响荧光强度的因素 ① 溶剂对荧光强度的影响 一般来说，随着溶剂介电常数的增大，荧光 峰的波长越大，荧光效率也越大。 ② 温度对荧光强度的影响 温度上升使荧光强度下降。
22:50
① 碰撞猝灭 处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰 撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方 式回到基态，产生猝灭作用。 。
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧 光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液 吸收光谱的改变。
22:50
③ 氧的猝灭作用 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三 重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们 在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭 效应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的 荧光物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子 和三重态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
医学：分子荧光与分子磷光分析法
在疾病诊断和治疗中的应用
肿瘤诊断
荧光与磷光分析法可用于肿瘤的早期 诊断和监测，通过检测肿瘤标志物或 特定基因的表达水平，为肿瘤治疗提 供依据。
感染性疾病诊断
药物疗效评估
荧光与磷光分析法可用于评估药物治 疗的效果，通过监测疾病标志物的变 化，了解药物治疗对疾病的影响。
荧光与磷光分析法可用于检测病原体 和抗体，快速准确地诊断感染性疾病， 如细菌、病毒和寄生虫感染。
06
未来展望
分析技术的发展趋势
智能化
01
随着人工智能和机器学习技术的快速发展，分析方法将更加智
能化，提高检测的准确性和效率。
高灵敏度
02
通过改进荧光和磷光的发光机制，提高检测的灵敏度，实现对
低浓度生物分子的快速检测。
多组分同时检测
03
发展多组分同时检测技术，实现对复杂生物样本中多种生物分
子的快速、准确检测。
在医学领域的应用前景
01
02
03
疾病诊断
利用荧光和磷光分析法对 生物分子进行高灵敏度检 测，为疾病诊断提供准确 依据。
药物研发
通过荧光和磷光分析法对 药物与生物分子相互作用 进行研究，为新药研发提 供有力支持。
个体化医疗
根据个体基因组、蛋白质 组等信息的检测结果，制 定针对性的治疗方案，实 现个体化医疗。
在生物分子检测中的应用
蛋白质检测
荧光与磷光分析法可用于检测蛋白质的含量和性质，有助于研究蛋 白质的功能和相互作用。
核酸检测
通过荧光与磷光分析法，可以检测DNA和RNA的含量和序列，用 于基因诊断、基因表达研究和疾病诊断。
生物标记物检测
荧光与磷光分析法可用于检测生物体内的生物标记物，如肿瘤标志物、 炎症标志物等，有助于疾病的早期发现和治疗监测。
chapter 3 分子发光光谱-荧光与磷光
I F ( I 0 I t ) I 0 ( 1 e
按照级数展开式：
2 .303ε bC
)
2 3 4 n x x x x x ex 1 1! 2! 3! 4! n!
(2.303εbC ) 2 (2.303εbC ) 3 (2.303εbC ) 4 I F I 0 (2.303ε bC ) 2! 3! 4!
P/F
λ Fmax(nm) λ Pmax (nm)
6.溶剂效应
无溶剂化作用
在极性溶剂中： 红移: 蓝移: △ Eπ→π* △ E n →π* ＞ ＜
有溶剂化作用 △ Eπ→π* △ E n →π*
三. 荧光的熄灭
荧 光 熄 灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起 荧光强度降低或消失的现象。 荧光熄灭剂：这些引起荧光强度降低的物质称为荧光熄灭剂。 1. 碰撞熄灭 激发 与分子的直径、粘度、温 发射 度等因素有关。 熄灭
F
发射荧光的分子数 激发分子总数
发射磷光的分子数 P 激发分子总数
F
kF kF ki
i 1 n
P st
kP k P ki
i 1 n
kF、 kp主要取决于荧光物质的分子结构； st系间跨越效率。
ki主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。
固定em=620nm(MAX)
A. 激发光谱
固定发射波长 扫描激发波长
ex =290nm (MAX)
2400 2000 1600 1200 800 400 0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
比较吸收谱峰荧光谱峰磷光谱峰
比较吸收谱峰荧光谱峰磷光谱峰
吸收谱峰、荧光谱峰和磷光谱峰都是描述分子在特定能量区域中吸收、发射和荧光发射的区域。
它们的区别在于分子在特定能级状态下的不同行为。
吸收谱峰是描述分子能量吸收的峰值，通常在紫外线或可见光区域。
分子吸收光的能量可以用于激发电子和分子振动、转动和其他内部运动。
吸收谱峰的位置和强度取决于分子结构和能级状态。
荧光谱峰是描述分子发射荧光的峰值，通常在可见光或近红外区域。
荧光发射是当分子从激发态退回到基态时，放射出发光的过程。
荧光发射峰的位置和强度也取决于分子结构和能级状态。
磷光谱峰是描述分子磷光发射的峰值，通常在可见光或近红外区域。
磷光发射是当分子从翻转自旋态到正常自旋态时，放射出发光的过程。
磷光发射峰的位置和强度也取决于分子结构和能级状态。
总的来说，吸收、荧光和磷光谱峰都是描述分子在吸收和发射能量时的行为，但具体的行为略有不同，取决于分子的结构和能级状态。
90350-仪器分析-第八章 分子发光分析法
禁阻跃迁． • 磷光发射过程：由第一激发单重态的最低振动能级，
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫 转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。
3、荧光/磷光光谱曲线
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
• 激发光谱曲线-荧光强度与激
发光波长的关系
• 固定测量波长为荧光/磷光的最 大发射波长，改变激发波长， 测量荧光或磷光强度；
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
• 荧光或磷光光谱曲线-荧光
或磷光强度与发射光波长的关 系
• 固定激发光波长为其最大激发 波长，测量发射不同波长的荧 光或磷光强度．
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
4. 荧光、磷光与分子结构的关系
荧光激发光谱荧光发射光谱
200 蒽25的0 激30发0光3谱50和4荧00光4光50n谱m500
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量
子产率( f）的关系 ：
If = Ia
由朗伯-比耳定律：
A=lg（I0/ It）， Ia= I0- It
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
9. 影响分子发光的环境因素
a.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
b.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
c. 溶液pH
酸碱化合物受溶液pH的影响较大，需要严格控制.
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫 转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。
3、荧光/磷光光谱曲线
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
• 激发光谱曲线-荧光强度与激
发光波长的关系
• 固定测量波长为荧光/磷光的最 大发射波长，改变激发波长， 测量荧光或磷光强度；
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
• 荧光或磷光光谱曲线-荧光
或磷光强度与发射光波长的关 系
• 固定激发光波长为其最大激发 波长，测量发射不同波长的荧 光或磷光强度．
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
4. 荧光、磷光与分子结构的关系
荧光激发光谱荧光发射光谱
200 蒽25的0 激30发0光3谱50和4荧00光4光50n谱m500
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量
子产率( f）的关系 ：
If = Ia
由朗伯-比耳定律：
A=lg（I0/ It）， Ia= I0- It
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
9. 影响分子发光的环境因素
a.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
b.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
c. 溶液pH
酸碱化合物受溶液pH的影响较大，需要严格控制.
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
分子荧光与分子磷光光谱法
11
（二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线 荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根 据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，固定测量波 长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测 得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制 激发光谱 曲线。
激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三 重态，以T1，T2….表示。
基态：电子自旋配对， 多重度=2s+1=1，为单 重态，以S0表示。
三重态能级低于单重态 （Hund规则）
3
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁 性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性， 其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重 态和三重态）。
当两个电子能级非常靠近以至其振
动能级有重叠时，常发生电子由高
S2
能级以无辐射跃迁方式转移至低能
级。右图中指出，处于高激发单重
态的电子，通过内转移及振动弛豫，
均跃回到第一激发单重态的最低振
动能级。
S0
内转移
S1 T1
吸光1 吸光2
荧光、磷光 能级图
6
荧光发射
处于第一激发单重态中的电子跃回至
基态各振动能级时，将得到最大波长
指不同多重态间的无辐射跃迁，例如
S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发
生系间窜跃时，电子由S1的较低振动
能级转移至T1的较高振动能级处。有
S2
时，通过热激发，有可能发生T1→S1，
然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧
光的机理。
系间窜跃
S1 T1
S0 吸光1
吸光2 荧光3
（二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线 荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根 据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，固定测量波 长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测 得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制 激发光谱 曲线。
激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三 重态，以T1，T2….表示。
基态：电子自旋配对， 多重度=2s+1=1，为单 重态，以S0表示。
三重态能级低于单重态 （Hund规则）
3
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁 性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性， 其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重 态和三重态）。
当两个电子能级非常靠近以至其振
动能级有重叠时，常发生电子由高
S2
能级以无辐射跃迁方式转移至低能
级。右图中指出，处于高激发单重
态的电子，通过内转移及振动弛豫，
均跃回到第一激发单重态的最低振
动能级。
S0
内转移
S1 T1
吸光1 吸光2
荧光、磷光 能级图
6
荧光发射
处于第一激发单重态中的电子跃回至
基态各振动能级时，将得到最大波长
指不同多重态间的无辐射跃迁，例如
S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发
生系间窜跃时，电子由S1的较低振动
能级转移至T1的较高振动能级处。有
S2
时，通过热激发，有可能发生T1→S1，
然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧
光的机理。
系间窜跃
S1 T1
S0 吸光1
吸光2 荧光3
分子发光分析法
分子发光分析法基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(Molecular Luminescence)。
依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。
光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。
本章讨论分子荧光(Molecular Fluorescence)、分子磷光(Molecular Phosphorescence)和化学发光(Chemiluminescence)分析法。
第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。
这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。
到1852年才由斯托克斯(Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。
斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。
1867年Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。
进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。
荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。
虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。
使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。
二、基本原理(一)分子荧光的产生大多数分子含有偶数电子。
根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态(2S+1=1)，基态单重态以S0表示。
当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以S1、S2表示。
第七章 分子发光-荧光与磷光
x x2 x3 x4 xn ex 1 1! 2! 3! 4! n!
( 2.30 ε bC )2 ( 2.30 ε bC )3 ( 2.30 ε bC )4 I F I 0 ( 2.30 ε bC ) 2! 3! 4!
荧光
斯托克斯荧光(Stokes)： λex < λem 反斯托克斯荧光 (Antistokes)：λex > λem 共振荧光(Resonance)： λex = λem
分子的活化与去活化
振动弛豫
S2
内转移 荧光
反系间 窜跃
系间 窜跃
１. 辐射跃迁的类型 共振荧光：10-12 sec 荧 光：10-8 sec 磷 光：1~10-4 sec 迟滞荧光:102~10-4 sec ２. 无辐射跃迁的类型
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量； 传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛预
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率 的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激 发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
第七章分子发光荧光与磷光
共振光散射
瑞利散射
二级共振光散射
拉曼光
三级共振光散射
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
l
三. 分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系
1. 荧光强度(磷光)与浓度的关系
光吸收定律（Lambert – Beer Law）
电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多为 S1→ S0
跃迁），发射波长为 l’2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长
长； l’2 > l 2 > l 1 ；
磷光发射：激发态分子经过系间跨跃达到激发三重态后，并经 过迅速的振动弛豫达到第一激发三重态(T1)的最低振动能级上， 从T1态分子经发射光子返回基态。此过程称为磷光发射。
❖ 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由 Jette和West提出了第一台荧光计。
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。
如S1到T1跃迁就是系间跃迁的例子，即单重态到三重态的 跃迁。即较低单重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠。 这种跃迁是“禁阻”的。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
辐射能量传递过程
荧光发射：当分子处于第一激发单重态S1的最低能级时，分 子返回基态的过程比振动弛豫和内转化过程慢得多。分子可 能通过发射光子跃迁回到基态S0的各振动能级上，这个过程 称为荧光发射。
荧光磷光基本原理
荧光量子产率（）：
发射的光量子数 吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关 ，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
产生不同吸收带但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态产生波长一定的荧光如l通常荧光发射光谱与它的吸收光谱与激发光谱形状一样成镜像对称关系
第一节 分子荧光与磷光
molecular fluorescence and phosphorescence
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
四、影响荧光强度的因素
relation between fluorescence and molecular structure
影响荧光强度的外部因素
1.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
2.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几
第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
2.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应 单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态； S0→T1 禁阻跃迁； 通过其他途径进入 (见能级图)；进入的 几率小；
分子荧光光谱法(原理和方法)
Molecular fluorescence spectroscopy
概述
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称
为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度 与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析．
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
化合物
C6H5OH C6H5O— C6H5NH2
+ C6H5NH3
相对荧光 强度 18 10 20
0
荧光分光光度计
荧光分光光度计既可用于定量分析， 也可用于测绘激发光谱和荧光光谱
。荧光分光光度计既可用于定 量分析，也可用于测绘激发光谱 和荧光光谱。第一单色器选择激 发光波长（＞250nm的 紫外光）故称为激发单色器 第二单色器（荧光单色器） 与激发光入射方向垂直， 并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。
1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
概述
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称
为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度 与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析．
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
化合物
C6H5OH C6H5O— C6H5NH2
+ C6H5NH3
相对荧光 强度 18 10 20
0
荧光分光光度计
荧光分光光度计既可用于定量分析， 也可用于测绘激发光谱和荧光光谱
。荧光分光光度计既可用于定 量分析，也可用于测绘激发光谱 和荧光光谱。第一单色器选择激 发光波长（＞250nm的 紫外光）故称为激发单色器 第二单色器（荧光单色器） 与激发光入射方向垂直， 并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。
1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
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重态，以 S1，S 2…表示
激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三
重态，以 T1，T2….表示。
基态：电子自旋配对， 多重度 =2s+1=1，为单 重态，以 S0表示。
三重态能级低于单重态 （Hund 规则）
3
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁 性，其激发态的平均寿命大约为 10-8s，而三重态分子具有顺磁性， 其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重 态和三重态）。
8
磷光发射
电子由基态单重态激发至第一激发三重
态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但
是，由第一激发单重态的最低振动能级， S2
有可能以系间窜跃方式转至第一激发三
重态，再经过振动驰豫，转至其最低振
动能级，由此激发态跃回至基态时，便
发射磷光，这个跃迁过程（ T1→S0）也 是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为
指不同多重态间的无辐射跃迁，例如
S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发
生系间窜跃时，电子由S1的较低振动
能级转移至T1的较高振动能级处。有
S2
时，通过热激发，有可能发生 T 1→S1，
然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧
光的机理。
系间窜跃
S1 T1
S0 吸光 ? 1
吸光? 2 荧光 ? 3
荧光、磷光 能级图
振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR）它是指 在同一电子能
级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以
热的形式发出。发生振动弛豫的时间为 10-12s数量级。
S2
S1
振动弛豫
T1
S0 吸光 ? 1
吸光? 2
荧光、磷光 能级图
→ 振动弛豫
5
内转换（Internal Conversion ，IC）
第十一章 分子荧光与分子磷光光谱法 分子发光分析Molecular Luminescence Analysis 分子发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光和散射光谱 等。 一、基本原理 分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等） 被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光 子，此种现象称为发光。发光分析包括荧光、磷光、化学发光、 生物发光等。
当两个电子能级非常靠近以至其振
动能级有重叠时，常发生电子由高
S2
能级以无辐射跃迁方式转移至低能
级。右图中指出，处于高激发单重
态的电子，通过内转移及振动弛豫，
均跃回到第一激发单重态的最低振
动能级。 S0
吸光 ? 1
内转移
S1 T1
吸光? 2
荧光、磷光 能级图
6
荧光发射
处于第一激发单重态中的电子跃回至
电子通常的情况下分子的电子处于最低的能级状态（大多数有机物的分子 的基态是处于单重态的）。用S0表示。若分子受激发，其电子从基态的电子能 级跃迁到较高的电子能级，即激发态，用S1, S2……表示。
（一）荧光和磷光的产生
处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当分子吸收能量，若 电子在跃迁过程中不发生自旋方向的改变，通常跃迁至第一激发态单重态轨道 上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选律的。
如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，即跃迁至第一或更高的 激发三重态轨道上，这属于禁阻跃迁。
单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级 （处于分立轨道上的非成对电子，平行自旋要比成对自旋更稳定些－洪特规 则） 。
2
激发单重态：分子吸收能 量，电子自旋仍然配对， 为单重态，称为激发单
物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光
1
单重态和三重态：
分子中的电子运动包括电子轨道的运动和电子的自旋运动。分子中电子的自旋 状态可用多重态 2S+1 描述（电子激发态的多重度用M＝2S+1表示），S 为总自 旋量子数（其数值为0和1）。若分子中没有未配对的电子，即S=0, 则2S+1=1 称为单重态（Pauli)；若分子中有两个自旋平行的未配对电子，即S=1，则 2S+1=3称为三重态，用T表示。
10
激发单重态：分子吸收能 量，电子自旋仍然配对， 为单重态，称为激发单
重态，以 S1，S 2…表示
激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三
重态，以 T1，T2….表示。
基态：电子自旋配对， 多重度 =2s+1=1，为单 重态，以 S0表示。
三重态能级低于单重态 （Hund 规则）
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式 再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射； 无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫 （VR）、内部转移（IR ）、系间窜跃（IX）及外部转移（EC ） 等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构 及激发时的物理和化学环境等因素有关。
下面结合荧光和磷光的产生过程，进一步说明各种能量传递 方式在其中所起的作用。
设处于基态单重态中的电子吸收波长为 λ1和λ2的辐射光之后， 分别激发至第二单重态S2及第一单重态S1。
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去活化过程（Deactivation ）
处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程
返回至基态 。这些过程包括：
基态各振动能级时，将得到最大波长
为λ3的荧光。注意：基态中也有振 动驰豫跃迁。很明显，λ3的波长较 激发波长λ1或λ2都长，而且不论电 子开始被激发至什么高能级，最终将 S0 只发射出波长λ3为的荧光。荧光的 产生在10-7-10-9s内完成。
S2
S1
T1
吸光 ? 1
吸光? 2 荧光 ? 3
荧光
7
系间窜跃（Intersystem Conversion ， ISC ）系间跨跃
S0
吸光 ? 1
10-4-10s。因此，这种跃迁所发射的光，
在光照停止后，仍可持续一段时间。
S1 T1
吸光 ? 2
磷光
荧光 ? 3
磷光
荧光、磷光 能级图
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外转移（External Conversion ，EC）外转换
指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移， 使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或 “猝灭”。 荧光与磷光的根本区别： 荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产 生的；而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能 层间跃迁产生的。
激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三
重态，以 T1，T2….表示。
基态：电子自旋配对， 多重度 =2s+1=1，为单 重态，以 S0表示。
三重态能级低于单重态 （Hund 规则）
3
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁 性，其激发态的平均寿命大约为 10-8s，而三重态分子具有顺磁性， 其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重 态和三重态）。
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磷光发射
电子由基态单重态激发至第一激发三重
态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但
是，由第一激发单重态的最低振动能级， S2
有可能以系间窜跃方式转至第一激发三
重态，再经过振动驰豫，转至其最低振
动能级，由此激发态跃回至基态时，便
发射磷光，这个跃迁过程（ T1→S0）也 是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为
指不同多重态间的无辐射跃迁，例如
S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发
生系间窜跃时，电子由S1的较低振动
能级转移至T1的较高振动能级处。有
S2
时，通过热激发，有可能发生 T 1→S1，
然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧
光的机理。
系间窜跃
S1 T1
S0 吸光 ? 1
吸光? 2 荧光 ? 3
荧光、磷光 能级图
振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR）它是指 在同一电子能
级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以
热的形式发出。发生振动弛豫的时间为 10-12s数量级。
S2
S1
振动弛豫
T1
S0 吸光 ? 1
吸光? 2
荧光、磷光 能级图
→ 振动弛豫
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内转换（Internal Conversion ，IC）
第十一章 分子荧光与分子磷光光谱法 分子发光分析Molecular Luminescence Analysis 分子发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光和散射光谱 等。 一、基本原理 分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等） 被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光 子，此种现象称为发光。发光分析包括荧光、磷光、化学发光、 生物发光等。
当两个电子能级非常靠近以至其振
动能级有重叠时，常发生电子由高
S2
能级以无辐射跃迁方式转移至低能
级。右图中指出，处于高激发单重
态的电子，通过内转移及振动弛豫，
均跃回到第一激发单重态的最低振
动能级。 S0
吸光 ? 1
内转移
S1 T1
吸光? 2
荧光、磷光 能级图
6
荧光发射
处于第一激发单重态中的电子跃回至
电子通常的情况下分子的电子处于最低的能级状态（大多数有机物的分子 的基态是处于单重态的）。用S0表示。若分子受激发，其电子从基态的电子能 级跃迁到较高的电子能级，即激发态，用S1, S2……表示。
（一）荧光和磷光的产生
处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当分子吸收能量，若 电子在跃迁过程中不发生自旋方向的改变，通常跃迁至第一激发态单重态轨道 上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选律的。
如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，即跃迁至第一或更高的 激发三重态轨道上，这属于禁阻跃迁。
单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级 （处于分立轨道上的非成对电子，平行自旋要比成对自旋更稳定些－洪特规 则） 。
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激发单重态：分子吸收能 量，电子自旋仍然配对， 为单重态，称为激发单
物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光
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单重态和三重态：
分子中的电子运动包括电子轨道的运动和电子的自旋运动。分子中电子的自旋 状态可用多重态 2S+1 描述（电子激发态的多重度用M＝2S+1表示），S 为总自 旋量子数（其数值为0和1）。若分子中没有未配对的电子，即S=0, 则2S+1=1 称为单重态（Pauli)；若分子中有两个自旋平行的未配对电子，即S=1，则 2S+1=3称为三重态，用T表示。
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激发单重态：分子吸收能 量，电子自旋仍然配对， 为单重态，称为激发单
重态，以 S1，S 2…表示
激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三
重态，以 T1，T2….表示。
基态：电子自旋配对， 多重度 =2s+1=1，为单 重态，以 S0表示。
三重态能级低于单重态 （Hund 规则）
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式 再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射； 无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫 （VR）、内部转移（IR ）、系间窜跃（IX）及外部转移（EC ） 等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构 及激发时的物理和化学环境等因素有关。
下面结合荧光和磷光的产生过程，进一步说明各种能量传递 方式在其中所起的作用。
设处于基态单重态中的电子吸收波长为 λ1和λ2的辐射光之后， 分别激发至第二单重态S2及第一单重态S1。
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去活化过程（Deactivation ）
处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程
返回至基态 。这些过程包括：
基态各振动能级时，将得到最大波长
为λ3的荧光。注意：基态中也有振 动驰豫跃迁。很明显，λ3的波长较 激发波长λ1或λ2都长，而且不论电 子开始被激发至什么高能级，最终将 S0 只发射出波长λ3为的荧光。荧光的 产生在10-7-10-9s内完成。
S2
S1
T1
吸光 ? 1
吸光? 2 荧光 ? 3
荧光
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系间窜跃（Intersystem Conversion ， ISC ）系间跨跃
S0
吸光 ? 1
10-4-10s。因此，这种跃迁所发射的光，
在光照停止后，仍可持续一段时间。
S1 T1
吸光 ? 2
磷光
荧光 ? 3
磷光
荧光、磷光 能级图
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外转移（External Conversion ，EC）外转换
指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移， 使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或 “猝灭”。 荧光与磷光的根本区别： 荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产 生的；而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能 层间跃迁产生的。