细胞工程第七章 植物转化受体系统

特点：
(1) 原生质体被除去了细胞壁这一天然屏障，能够直 接高效地摄取外源DNA或遗传物质，甚至细胞核；
(2) 通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞 克隆，从转化原生质体获得的转基因植株嵌合体少；
(3) 原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定 的同等控制条件下进行准确的转化和鉴定；
选择原则 ：
①同一物种的培养基有雷同性，即同一物种的不同亚种、品种间的基本培养基 类型基本相同；
②同一植物的不同组织器官的基本培养基类型基本相同； ③植物组织培养时所需营养成分与田间栽培有相似性； ④MS培养基是大多数植物的通用培养基； ⑤无机盐的浓度是基本培养基类型的重要因素，应该作为培养基选择的重要参
的抗生素有一定的敏感性；要求抗生素对受体植物 没有严重的毒性；
（5）对农杆菌侵染有敏感性。
第一节 植物基因转化受体系统的类型及其特性
一、愈伤组织再生系统
愈伤组织再生系统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并 通过分化培养获得再生植株的受体系统。
特点：
（1）外植体细胞经历了脱分化和再分化两个过程，具有易 于接受外源基因的能力，转化率较高；
第七章 植物基因转化受体系统
本章所讲内容：
建立植物基因转化受体系统的基本条件； 植物基因转化受体系统的类型及其特性； 建立植物基因转化受体系统的程序及要求； 建立植物基因转化受体系统过程中的常见问
题及解决方案。
概述：
植物基因工程技术：即将目标性状基因分离出来， 构建重组DNA分子导入受体物种中，筛选出获得目 标基因表达后代，培育新品种，这种技术称为转化。
生理上的变化：
结构：茎尖分生细胞较小、结构简单，缺少 具正常功能的输导组织，叶片只有海绵组织， 气孔的保卫细胞功能失调等。
生理生化：细胞含水过多，还原糖、蔗糖、 K2+、Ca2+、Cl–等含量增高，而木质素、叶 绿素、蛋白质、Fe3+、Cu2+的含量降低。
解决措施：
(1) 利用固体培养基，增加琼脂浓度，造成细胞吸水阻遏； (2) 提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，造成水分胁迫； (3) 改变培养基中一些激素浓度和一些元素的含量； (4) 增加自然光照； (5) 控制温度，适当低温处理； (6 ) 改善培养容器内的通风换气条件。
二、培养物的褐化
褐变机理 ：酶促褐变和非酶促褐变
酶促褐变： 酚类氧化物 PPO 醌+水
非酶促聚合
深色物质
毒害
影响因素：
（1） 基因型的影响 ：不同种植物、同种植物不同 类型、不同品种存在很大差异 ；
（2）外植体部位及生理状态的影响：幼龄材料 、 早春或秋季取材 ；
（3）培养基成分及培养条件的影响 ：低盐 、激素、 低pH、低CO2 等；
分离 花粉
特点：
(1) 由于以具有全能性的生殖细胞直接为受体细胞， 因此具有更强的接受外源DNA的潜能；
(2) 由于受体细胞是单倍体细胞，转化的基因无显 隐性的影响，大大缩短了复杂的选育纯化过程；
(3) 利用植物自身的授粉过程操作方便、简单；
(4)利用该受体系统进行转化受到季节的限制，只能 在短暂的开花期内进行，无性繁殖的植物不宜采用。
蝴蝶兰腋芽萌发
特点：
(1) 获得再生植株的周期短，操作简单； (2) 体细胞无性系变异小，能较好地保持受体植物
的遗传稳定性； (3) 更适于无性繁殖的园艺植物，但对茎尖培养困
难的粮食作物有一定局限性； (4) 其转化频率低于愈伤组织再生系统； (5) 直接再生系统同样出现较多的嵌台体。
三、原生质体再生系统
4、 外植体的接种及共培养
外植体的接种是指把农杆菌工程菌株接种到 外植体的侵染转化部位。
共培养即指农杆菌与外植体共同培养的过程： 一般共培养时间为3d；采用低盐培养基，多 数共培养基中能够加入AS和单糖类化学诱导 物，并加入较高含量的生长素类（如2，4-D） 激素。
接种时间为1～30min，接种菌液浓度为0.3～1.5 OD
第四类：低无机盐含量的培养基：怀特（White 1943)培养基、WS培养基(Wolter and Skoog， 1966)、HE培养基（Hel1er，1953)、改良 Nitsch(1951)培养基及HB培养基(Holly and Baker， 1963)等。
(2)基本培养基的选择
1)植物的营养特性 2)选择原则 3)激素的选择原则
第二类：硝酸钾含量较高的培养基：B5培养基(Gamborg et al，1968)、N6培养基(朱至清等，1975)、SH培养基 (SckenkandHildebrandt，1972)等 ；
第三类：中等无机盐含量的培养基：H培养基 (Bourgin and Nitsch，1967)、Nitseh(1969)培养 基、Miller(1963)培养基和Blaydes(1966)培养基 等；
（5）外植体的选择与受体系统类型的 匹配。
2、培养基的选择
(1)基本培养基类型及其特点：
第一类：含盐量较高的培养基：MLS培养基(Linsmaier and Skoog，1965)、BL培养基(Brown and Lawrence， 1968)、BM培养基(Button，1975)及ER培养基(Eriksson， 1965)等。S培养基(Murashige and Skoog，1962) ；
(3) 胚状体具有两极性，减少了不定芽发育途径中比较困难 的一个环节——生根培养；
(4) 利用转基因的胚状体可以生产人工种子；
(5) 体细胞胚具有个体间遗传背景一致、无性系变异小、胚 的结构完整、成苗快、数量大等许多优点，有利于转基因植 株的生产和推广。
五、生殖细胞受体系统
利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花粉粒、卵细胞为 受体细胞进行基因转化的系统称之为生殖细胞受体系统，也 称之为种质系统。
第二节 植物基因转化受体系统建立的程序
外植体的选择制备 高频再生系统的建立 抗菌素的敏感性试验 农杆菌的敏感性试验(以农杆菌介导转化的植
物)
一、高频再生系统的建立
高频再生系统必须具有四个条件： ①外植体的组织细胞具有再生愈伤组织和完整植株
的能力，而且最好是外植体能直接分化芽； ②芽的分化率高，能达到90％以上； ③易于离体培养，具有高度可重复性； ④体细胞无性系变异小。
(4) 该受体系统可适用于各种转化系统；
(5) 细胞无性系的变异更为强烈，即遗传稳定性更 差；
(6) 原生质体培养周期长、难度大、再生频率低， 育
特点：
(1) 胚状体是由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来，转化 率和转化效率都很高；
(2) 胚状体的发生多数是单细胞起源，因此转化获得的转基 因植株嵌合体少；
数； ⑥有机成分主要是种类的变化，每种成分含量的变化不大； ⑦蔗糖浓度不可忽视，应该在确定基本培养基类型后研究最适的蔗糖浓度； ⑧提高磷酸根的水平可以抵消IAA对芽的抑制作用，促进芽的分化； ⑨水解酪蛋白能加强激动素诱导分化作用，特别当有高水平的IAA时更为显著，
酪氨酸可以相当有效地代替水解酪蛋白的作用。
改为9%蔗糖+2%麦芽糖； （6）出愈后提早进行转分化培养。
四、试管苗的移栽成活率
保持90％～100％的湿度； 利于气体交换的进行； 移栽时剪掉少量叶片； 移栽时的基质：珍珠岩和草木灰2：1； 介质、盆钵应预先消毒 。
五、影响受体系统转化效率的因素
1、农杆菌菌株 （1）农杆菌菌株类型 农杆碱型（琥珀碱型）菌株（如A281）＞胭脂碱型
1、外植体的选择
(1) 选择幼年型的外植体；
(2) 选择增殖能力强的外植体和萌动期的外植 体：如复壮的性细胞、花粉管的二倍体细胞 ；
(3) 选择具有强再生能力基因型的外植体：选 择未分化或分化程度较轻的组织作为外植体 使用 ，外植体的再生能力是受染色体上的基 因所调控 ；
(4) 选择遗传稳定性好的外植体：顶端分生组织 和形成层中的初生形成层细胞、胚细胞等；
植物基因转化受体系统，是指用于转化的外植体通 过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、 稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转 化选择抗生素敏感的再生系统。
植物基因转化受体系统应具备的条件：
（1）高效稳定的再生能力：高频率、高稳定性和 重复性；
（2）较高的遗传稳定性； （3）具有稳定的外植体来源：无菌实生苗； （4）对选择性抗生素敏感：植物受体材料对所选
（2）扩繁量大，可获得较多的转化植株； （3）外植体试材广泛； （4）该再生系统获得的再生植株无性系变异较大； （5）该再生系统几乎适用于每一种通过离体培养途径能再
生植株的植物； （6）嵌合体多。
二、直接分化再生系统
直接分化再生系统是指外植体细胞越过脱分化产生 愈伤组织阶段而直接分化出不定芽获得再生植株。
解决措施：以小麦花药培养为例
（1）采穗时主要取主茎和大分蘖穗，取花粉发育时期处于 单核中晚期的幼穗；
（2）幼穗4℃低温离体预处理24h； （3）脱分化培养一般在暗室进行，29℃培养 （4）脱分化培养基用2.0mg/L的2，4-D与0.5mg/L的KT或
6-BA配合使用； （5）诱导愈伤组织分化阶段，把培养基的碳源由11%蔗糖
（4） 选择最佳培养基和培养条件：无机盐成分、 蔗糖浓度、激素水平、pH值及培养基状态、类型、 光照、温度；
（5）多次连续转移培养 。
三、白化苗的产生
产生原因：
内部因素：供体植株的基因型、花药和花粉 本身的状态；
外部因素：低温预处理、培养基成分、生长 激素水平和种类、培养条件和方法、愈伤组 织转分化时间等，
菌株（C58）＞章鱼碱型菌株(Ach5，LBA4404)。 （2）农杆菌菌株的侵染活力 对数生长期的菌株，即0.3～1.8OD范围（1.0
OD≈1×109cells/ml）
2、外植体的类型和生理状态：发育早期（幼 年期）的组织细胞 ；