蛋白质印迹法

蛋白印迹法（Western-blot）

一、基本原理

细胞色素P450是一组含亚铁血红素，结构与功能相关的超家族基因编码的同工酶，因还原型P450与一氧化碳有特殊的亲和力，且形成的复合物在波长450nm处有一特异吸收峰而得名。已知的细胞色素P450超家族中，主要有CYP1、CYP2、CYP3三个基因家族，是生物体参与内外源性化合物生物转化酶系的主要成员，并与肿瘤的发生密切有关。其中CYP1家族中的CYP1A1与多种前致癌物、致突变物的代谢活化及肿瘤的发展密切相关，所以对CYP1A1的研究有重要的意义。

本实验采用蛋白免疫印迹（western blotting , WB）技术分析小鼠肝，肾两个器官中的CYP1A1的含量。WB的原理如下。

Western blotting 常用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS—PAGE）法分离蛋白质。SDS是一种阴离子去污剂，它能与绝大多数蛋白质结合。无论与SDS结合前蛋白质的等电点是多少，结合后蛋白质将带上等量的负电荷，通常SDS与蛋白质结合的比例为1.4：1g 。同时结合后蛋白质的分子构象发生改变，行成长椭圆棒状，其短轴大约为18nm,其长轴与分子量有关（一定范围内成正比），此时蛋白质的电泳迁移率仅与蛋白质的分子量有关。另外，SDS—PAGE过程中还加入了二硫苏糖醇和ß-巯基乙醇等强还原剂，破坏二硫键使得蛋白质的原有空间结构充分破坏，因此SDS—PAGE能将不同分子量的蛋白质分离开。

分离后的蛋白质带有负电荷，因而用电转移的方法能有效地将蛋白质转移至固相载体上（如硝酸纤维素膜）。用于承载蛋白质的各种膜均具有一个特点，它们都能与蛋白质发生非特异的共价结合，因而结合较为牢固，不易被后续的洗膜等操作洗脱.

Western blotting所用的探针为针对靶蛋白某段氨基酸序列的抗体。能直接与靶蛋白发生抗原抗体结合的抗体称为第一抗体（简称一抗），通常由于较难大量获得该抗体，使得对其进行标记很困难。为此人们设计了能与一抗结合的抗体，成为第二抗体（简称二抗）。二抗是将一抗的FC段作为抗原的，而每一物种的抗体FC段氨基酸序列都较为保守，这使得二抗能够大量生产，因而对二抗进行标记也就较为容易了。二抗与一抗能通过抗原抗体特异性结合后，以一定的方法对二抗上的标记进行检测便可检出靶蛋白。

二、器材

电热水浴箱、玻璃匀浆器、冷冻离心机、滤纸、水平摇床、电转移装置、醋酸纤维素膜（NC膜）、电泳仪、试管、微量移液器、Tip头、Epp管（2ml、5 ml、1.5 ml）

三、试剂配制：

1）、1.5M Tris—Hcl, pH8.8：18.16g Tris溶于60 ml ddH2O，用浓盐酸调节PH至8.8，定容至100 ml，4℃保存。

2）、1.0M Tris—Hcl, pH6.8：12.12g Tris溶于60 ml ddH2O，用浓盐酸调节PH至6.8，定容至100 ml，4℃保存。

3)、10％SDS： 10g SDS溶于90 ml ddH2O，轻柔搅拌，溶解后加水

至100 ml。

4）、10×TBS（Tris buffer solution）, pH7.6：24.2g Tris，80g NaCl, 溶于700 ml ddH2O 用1M HCl（约15 ml）调节pH至7.6，加ddH2O 至1000 ml。

5）、TBS-T，pH7.6：前述TBS-T加Tween-20使浓度为0.1％。6）、5×电泳缓冲液，pH8.3：15g Tris, 72g甘氨酸，5g SDS 溶于1000 ml ddH2O，4℃保存。（若有沉淀出现，用前加热至室温即可）。7）、转移缓冲液（25mM Tris、 192 mM甘氨酸、20％甲醇），pH8.3：3.03 g Tris，14.4 g 甘氨酸，200 ml甲醇加ddH2O至1000 ml。（勿用酸碱调节pH）。

8）、10mM PMSF液；异丙醇8 ml，PMSF0.01742 g溶解后定容至10 ml。（使用时按照10 ml裂解液：1 ml 10mM PMSF）

9）、裂解缓冲掖；包含50mmol/L Tris.HCl(Ph8.0),150mmol/L NaCl,1％TritonX:配置100ml的裂解缓冲掖，需称取Tris碱0.61g 溶解于60ml双蒸水，用浓盐酸调节Ph8.0，然后加入NaCl0.88g,TritonX—100 1ml,加水至总量为100ml。

10）、PBS 800ml 蒸馏水中加入NaCl18g，KCl0.2g,Na2HPO4 1.44g和KH2PO4 0.24g,用浓盐酸调节Ph至7.4，定容至1L。高压灭菌。11）、10％过硫酸胺（APS）：称取APS 0.5g溶解于5ml ddH2O中，分装保存于—20℃。

12）、1％溴酚蓝: 称取0.1 g溴酚蓝溶解于10ml ddH2O中,分装保存于4℃。

13）30%丙烯酰胺（Acr:Bis=29:1）:称取丙烯酰胺（Acr）29g,甲叉丙烯酰胺（Bis）1g,用去离子水溶解并稀释至100ml,储存在棕色瓶中于4℃保存，可用1个月

13）、Sample Buffer:

总体积8.0 ml

ddH2O 3 .8 ml

0.5M Tris—Hcl 1.0 ml

甘油0.8 ml

10％SDS 1.6 ml

ß-巯基乙醇0.4 ml

1％溴酚蓝0.4 ml

实验步骤：

1、样品制备：

小鼠禁食过夜，断头处死，迅速剖开腹腔，取出肝、肾分别称

重

↓

按1g组织中加入冰预冷的10ml裂解液，10mM PMSF 1ml 冰上制成10％的组织匀浆

↓

取1ml匀浆20000g，4℃、离心30分钟

↓

小心吸取上清液

↓

取少量上清液进行蛋白定量，余下的-20℃保存备用

2、蛋白质定量（考马斯亮蓝染色法）

考马斯亮蓝G—250 是一种蛋白质染料，最大吸收峰在465nm,当它与蛋