遗传学实验 多倍体诱发

诱变物质的微核检测技术

摘要人工诱导多倍体植物观察多倍体的特点，利用染色体分析的方法对多倍体细胞做出准确判断。

1.引言

微核：间期细胞的细胞质中一个或多个圆形或杏仁状结构。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具有合成DNA的能力。微核是染色体畸变的一种表现方式。

引起染色体断裂的因素分为物理因素和化学因素。物理因素包括：具有能量的各种射线，如α射线，β射线，γ射线，X-ray，中子，质子，UV等。化学因素包括：诱变剂和重金属等。经典断裂剂：Ｘ射线。诱变剂：环磷酰胺、氧化铬CrO3、叠氮化钠NaN3、甲基璜酸乙酯EMS、硫酸二乙酯。

微核发生率同作用因子的剂量呈正相关。微核技术获得的结果与通过中期畸变染色体计数所获结果相当。

2.实验材料

2.1实验材料

多倍体诱导的蒜根，1mol/L盐酸,改良苯酚品红,载玻片，盖玻片，解剖针，显微镜，刀片。

2.2实验方法

2.2.1材料的获取及处理

取材：

取大蒜发根至0.5-1cm，然后转入盛有0.15%秋水仙素水溶液的培养皿中继续培养24小时，待观察到根部有膨大时取出固定。与在水中培养的材料做对照。

图片来源：/webcourse/xibaoyichuan/jdsy/images/5-1.jpg 固定：

在卡诺固定液中固定24小时，移至70%乙醇中保存或备用。

解离：

解离植物的分生组织如根尖、茎尖等需要经过处理以便除去细胞之间的果胶层并使细胞壁软化，经解离的组织才能使压片步骤顺利进行。解离常用酸解法和酶解法。

①酸解法：固定后的材料用清水洗涤后，用1MHCl在60℃水浴中恒温处理5-10min。在酸解过程中一定要掌握好温度和时间，若解离不够，则压片不易分散。若解离太过，在下一步处理材料时由于材料过软而易丢失。然后水洗3次。

②酶解法：用10-20g/L的果胶酶，或与10-50g/L的纤维素酶混合使用。

本次实验采用酸解法。

染色：

切取根尖分生组织区，用改良苯酚品红染色15 min

2.2.2染液的制备

改良苯酚品红，其制备过程如下：

原液A 3g碱性品红溶于100ml 70%乙醇中。

原液B 取原液A 10 ml加入90 ml 5%的苯酚水溶液。

取原液B 45ml加入6ml 冰乙酸和6ml 37%的甲醛。（适合于植物原生质培养中的细胞核染色）取2-10ml染色液，加90-98ml 45%的醋酸1.8g山梨醇。（适合于细胞核的染色，只有细胞核及染色体被染成紫红色，而细胞质不着色）

2.2.3制片及镜检

压片：

将染色后的材料盖上盖玻片，在盖玻片上盖上两层吸水纸，用一个双面刀片，插到盖片与载片之间的一角，用左手食指压紧盖片，防止滑动，用右手持解剖针，用针柄轻敲盖片，使材料均匀分散开。然后将刀片轻轻撤出，再用针柄重敲盖片，使细胞分散压平。

镜检：

在制成的染色体玻片标本中，染色清晰而且分散良好的中期分裂相总是少数，所以，在压片之后需要认真地进行镜检。

镜检时先用低倍镜进行观察，找到好的视野后再转用高倍镜观察。

3.结果

16条染色体，有姐妹染色单体

16条染色体，无姐妹染色单体

32条染色体，无染色单体

64条染色体，无染色单体

4.讨论

1）微核监测的关键：

（1）材料的选择

应选择染色体条数少，个体大，便于统计，对污染物反应比较敏感的材料，应适宜于在当地生长。

在微核试验（MNT)中经常使用的小鼠品系CD-1、BDF1、ddY、MS/Ae系(小鼠是由瑞典学者Aeschbacher建立的对诱变作用高度敏感的新品系)。

（2）材料的处理

①巨大性：随着染色体加倍，细胞核和细胞变大，组织器官也变大。根、茎粗壮叶宽厚、色深、花大、色艳、气孔、花粉粒、果实、种子大

②可孕性低：多倍体特别是三倍体是高度不孕的。例如，无籽、种子皱缩如无籽香蕉，无籽葡萄，无籽西瓜，无籽柑橘，无球悬铃木。但风信子三倍体品种(2n=3X=24)表现高度可孕性。

③适应性强：植物多倍化不仅使植株基因活性及酶的差异性增强，而且还增强了植株的生态适应性、对逆境的抗耐性，所以分布地区较广。多倍体杜鹃多分布在我国西南山区，而二倍体只分布在平原。

④有机合成速率增加：多倍体有多套基因，新陈代谢旺盛，酶活性加倍，提高了有机物的合成速率。例如，多倍体甜菜，产糖量高；三倍体表现出明显的超亲优势；浆果类，贮存期延长；多倍体花卉花大香味浓。

⑤克服远缘杂交的不结实性

2.一张制片好的细胞染色体制片至少符合如下条件：

①在一张制片中应有较多的中期分裂相。

②染色体分散而不重叠。

③染色体不扭曲、断裂、主缢痕、随体清晰。

④制片基本上为一层平展的细胞，视野内的细胞都在一个平面上。

⑤染色体着色较深而细胞质不着色或着色很浅，背景清晰无过多杂质。

选择中期分裂相好的细胞观察，通过观察和计数中期染色体数目，确定细胞类型。