细菌 、放线菌 、酵母菌及霉菌的分离与纯化
酵母菌的分离与纯化
酵母菌的分离与纯化酵母菌的分离与纯化⼩组组员: ⼀、实验⽬的1.学习分离纯化酵母菌的技术与⽅法2.了解培养基的配置与灭菌技术3.增强⽆菌操作技术的意识⼆、基本原理从混杂的微⽣物群体获得只含某⼀种某⼀株微⽣物的过程叫做微⽣物分离与纯化，酵母菌常见于含糖份⽐较⾼的环境中，如果园⼟、菜园⼟及果⽪等的表⾯。
多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌⽣长迅速，容易分离培养。
马丁⽒培养基是⼀种⽤来分离真菌的选择性培养基。
此培养基是由葡萄糖、蛋⽩胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉红(玫瑰红，Rose Bengal)和链霉素等组成。
其中葡萄糖主要作为碳源，蛋⽩胨主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4·7H2O作为⽆机盐，为微⽣物提供钾、磷和镁离⼦。
⽽孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌⽆抑制作⽤，因⽽真菌在这种培养基上可以得到优势⽣长，从⽽达到分离真菌的⽬的。
三、实验材料及⽤具1.⽤品：苹果、葡萄糖、琼脂、⽔、1%孟加拉红⽔溶液、马铃薯2.设备与器材：1ml的⽆菌吸管、⽆菌培养⽫等.四、实验步骤1、马铃薯培养基的配置培养基成分:马铃薯 40克、蔗糖（葡萄糖） 4克、琼脂 4克、⽔ 200毫升、 pH ⾃然。
配置⽅法:（1）配制20%马铃薯浸汁：取去⽪马钓薯40g，切成⼩块，加⽔200ml.加热煮游30 min ，⽤纱布过滤，然后补⾜失⽔互所需体积。
121Pa灭菌30min.即成20%马铃馨漫汁，贮存备⽤。
（2）配制时，按每100ml 马铃薯浸汁加⼊2g蔗糖，加热煮沸后加⼊4克琼脂，继续加热融化并补⾜失⽔。
（3）分装、加塞，包扎。
（4）⾼压蒸汽灭菌：121Pa灭菌30min（5）将灭菌培养基放⼊37C°的温室中培养24-48⼩时，观察是否有菌落⽣成，以检查灭菌是否彻底。
2、倒平板：将马铃薯培养基加热融化，冷却⾄55--50C°时，倒平板，倒三⽫3、制备苹果悬液（1）⾸先将1g苹果在研钵中磨细，放⼊装有10ml⽣理盐⽔和玻璃珠的100ml三⾓瓶中去。
实验3：细菌的分离与纯化
实验 3 微生物的纯种分离培养微生物广泛地分布在自然界的土样、水体、空气、动植物体表及人体、动物体的排泄物中。
它们以单个的菌体、无性孢子和芽孢的形式存在。
由于单一的自然界环境并不能完全满足微生物对水、空气、营养物质、温度、pH的综合要求，它们往往以散居”的状态出现，而不能形成人们肉眼可直接观察到菌落。
不同的自然环境中，微生物的种类和数量差异很大。
肥沃的土壤，富养化的水体，是许多微生物麇集、孳生的场所，在这里存活着能分解淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素、木质素、果胶、农药、含磷有机物（卵磷脂、肌醇、核酸等）、石油以及溶解铜矿的细菌、放线菌、真菌等多种类的微生物，如何根据微生物的生理要求，按照人类的需求，将它们从自然界中分离出来，获得纯种，发挥微生物的特长为人类的生产和生活服务，是微生物研究中最基础的实验技术。
一、实验目的：1．学会将混杂的各种微生物分离成纯种，统计分析样品中微生物的种类和数量的方法。
2．学会从菌落及培养特征区分细菌、酵母菌、放线菌和霉菌。
3．学会好氧微生物平板及斜面培养的方法。
二、实验原理：在自然界中，微生物的种类很多，数量很大，为了获得单个菌体，首先必须把要分离的材料进行适当的释放，按其生长所需要的条件，使其在平板上，由一个菌体繁殖成单个菌落，这样，就能从中挑选出所需要的纯种，由于细菌、放线菌和霉菌所要求的营养条件不同，利用不同的培养基制成平板进行分离，然后从菌落形态上的差异，可以把细菌、放线菌和霉菌三大类群区分并可计算出其数量，分别接种到试管斜面上，然后，在平板上反复进行分离培养，最后可获得纯种。
三、实验材料和用具：1．材料（1）土壤样品（ 2 ）培养基：①牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏蛋白胨培养基（% ）牛肉膏0.3-0.5g 蛋白胨1.0g NaCl 0.5g 琼脂2.0g 蒸馏水100mL pH 7.2-7.4 ，0.1Mpa 压力，灭菌20-30分钟。
配制液体培养基时不加琼脂；半固体培养基加0.3-0.5%琼脂。
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年 10月16日一、实验目的和要求1.掌握微生物接种培养技术2.掌握微生物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。
在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。
为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。
2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途一般多用于筛选菌株。
土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法
土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法微生物因为体积小、质量轻、适应性强、繁殖能力强等特点，广泛分布于自然界中。
它们存在于食品、化妆品、饲料、环境等人们能触及的各个角落中。
某些微生物对产品的污染，不仅影响到产品本身的质量，更严重的是它危及消费者的健康和安全。
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以下介绍几种菌的分离方法：一、从土壤中分离放线菌1.制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
2.称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。
振荡10分钟，制成10-1菌悬液。
按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。
3.用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。
然后将培养皿倒置于25-30℃温箱中，培养7-10天，培养基上会出现微生物菌落。
如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。
4.挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。
二、从土壤中分离霉菌1.制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。
将培养皿中，凝成平板，待用。
2.称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。
3.取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。
然后将培养皿倒置于2 5-30℃温箱内培养3-4天。
培养基上会出现微生物菌落。
霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。
4.挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上三、从饮水中分离大肠杆菌1.制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
2.用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1:10稀释。
土壤中放线菌的分离和纯化实验（精选5篇）
土壤中放线菌的分离和纯化实验（精选5篇）第一篇：土壤中放线菌的分离和纯化实验土壤中放线菌的分离和纯化实验一、实验目的1、制作MS培养基的方法，掌握母液的保存方法。
2、掌握培养基的灭菌方法。
掌握外植体的消毒和超净工作台的使用。
4、掌握放线菌的分离纯化及染色的基本流程；5、掌握高氏一号培养基的配制方法；6、复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方学会使用高压蒸汽灭菌锅。
7、培养微生物实验的设计思路和动手能力。
二、实验材料高压蒸汽锅、培养瓶、石斛的愈伤组织、超净工作台，酒精灯、酒精棉球、镊子、电子天平、称量纸、烧杯、量筒、显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、分析天平；接种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液枪、剪刀三、实验原理植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）第 1 页或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。
四、实验步骤1、配制MS培养基8L，称取马铃薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、琼脂80g、配制母液。
2、配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；为防止母液被微生物污染，有机母液放在冰箱里4℃保存；②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。
溶化琼脂用粗天平分别称取琼脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。
实验二土壤中微生物的分离纯化及观察
实验结果
➢ 详细描述实验中各种微生物在斜面上、半固体和液体 培养基中的培养特征。
思考题
➢ 一个好氧的具周生鞭毛的菌株分别在斜面、半固体和 液体培养基中的培养特征。
➢ 用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划 多条线或蛇形，而只要划一条直线？
➢ 接种环（针）接种前后灼烧的目的是什么？为什么在 接种前一定要将其冷却？如何判断灼烧过的接种环已 冷却？
法和步骤； ➢ 掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方
法。
培养基的种类
➢ 按成分不同分 天然培养基 合成培养基 半合成培养基
➢ 按培养基的物理状态分 固体培养基 半固体培养基 液体培养基
➢ 按培养基的用途分 基础培养基 营养培养基 鉴别培养基 选择培养基
培养基的配制方法和步骤
➢ 称量：按照配方正确称取各种原料置于搪瓷杯中； ➢ 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，补足水
（使样品中的微生物细胞充分分散，成单个细胞存 在），再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培 养皿中特定的选择性培养基内，最后根据在平板上长 出的菌落数计算出每克或每毫升样品中的微生物数量。
实验器材 ➢ 土壤稀释液的三种不同培养基的培养平板 ➢ 菌种：大肠杆菌菌悬液 ➢ 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 ➢ 仪器或其他用具：1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有
灭菌
干热灭菌 ➢ 火焰灼烧法 ➢ 干热灭菌法（烘箱内热空气灭菌法） 湿热灭菌法 ➢ 加压蒸汽灭菌法 紫外线灭菌法 微孔滤膜过滤除菌
火焰灼烧法
直接在火焰上灼烧灭菌 主要用于实验室接种针(环)、试管口、三角瓶口和金属小 工具等的灭菌。
干热灭菌法
设备：电热烘箱 适用于耐高温器皿，160-170℃，维持2小时 注意事项：
分离纯化酵母菌的方法
分离纯化酵母菌的方法
分离纯化酵母菌的方法通常包括以下步骤：
1. 选择培养基：选择适合酵母菌生长的培养基，常用的包括酵母培养基（如魏氏酵母氮盐悬液、麦芽葡萄糖培养基等）。
2. 传代培养：从原始酵母菌培养物中，选取单个菌落或分离菌株，进行逐级传代培养。
3. 泛培养：将菌落接种到含有可溶性碳源（如麦芽糖、葡萄糖等）的培养基中，培养一段时间以增加菌量。
4. 单菌落分离：将泛培养液中的菌液均匀涂布于含有琼脂的培养基上，使菌落分离。
5. 纯化：从单菌落中挑取菌落，进行进一步的分离与培养，直至得到纯化的酵母菌。
6. 保存：将纯化得到的酵母菌进行冷冻保存或低温保存，以备今后的实验使用。
以上方法是一种常见的分离纯化酵母菌的方法，具体操作可根据实验目的和需求进行调整和修改。
细菌放线菌酵母菌霉菌的繁殖方式
细菌放线菌酵母菌霉菌的繁殖方式细菌、放线菌、酵母菌和霉菌都是常见的微生物，它们对人类生活和健康有着重要的影响。
这些微生物具有不同的繁殖方式，理解它们的繁殖方式可以帮助我们更好地了解它们的生态学和生物学特点。
细菌繁殖方式细菌可以通过两种方式繁殖：纵向分裂和横向转移。
在纵向分裂中，细胞会分裂成两个相同的细胞，这是一种非常快速的繁殖方式，在适宜的环境下，细菌每20分钟就可以分裂一次，短时间内很容易产生大量的细菌。
另一种繁殖方式是横向转移，即细菌通过对周围环境中的遗传物质进行吸收和重新组合的方式来获得新的基因组成，从而促进其繁殖和适应性。
这种细菌的基因转移能力可以使其获得对抗抗生素的能力。
放线菌繁殖方式放线菌也有两种繁殖方式：分裂和孢子形成。
分裂是指放线菌的细胞分裂成两个相同的细胞，这种方式和细菌类似。
但是，放线菌还可以产生孢子，这是储存遗传物质来应对环境变化的一种方式。
当放线菌处于不利环境中（如营养不足），它会形成芽孢。
芽孢可以在不利环境中存活，并在环境条件改善的时候重新发育出成熟放线菌。
酵母菌繁殖方式酵母菌也有两种主要的繁殖方式：无性繁殖和有性繁殖。
无性繁殖是指酵母细胞通过碎裂、分裂或持续性纵向裂解等方式自我繁殖。
有性繁殖是指两个不同的酵母菌细胞结合，形成一个双重的细胞，然后通过减数分裂形成子细胞。
这种形式的繁殖有助于保持基因多样性和适应性，但是由于需要两个不同的细胞相遇并结合，因此有性繁殖需要有特定的条件和环境。
霉菌繁殖方式霉菌的繁殖方式有三种：产生分生孢子、芽单孢子和无性生殖体。
分生孢子对应的是产生在支枝上、节上或菌盖顶端的分生孢子，该孢子承担霉菌繁殖的重要任务，分生孢子也是霉菌产生的最主要孢子。
芽单孢子产生于线状菌丝的端部，成为一系列具有萌芽能力的孢子，芽单孢子可以承担分离、繁殖等多种功能。
无性生殖体是靠生殖细胞分裂形成，这类生殖体具有强大的适应性和灵活性。
总结各种微生物的繁殖方式各有特点，这些方式不仅是它们适应环境和生存的策略，还能帮助我们更好地了解它们在自然界中的生态角色。
生防菌的纯化与鉴定
孢子囊梗与菌丝无区别，孢子 囊呈袋状，有的呈袋状叶瓣状。成 熟时不脱落，萌发时形成泡囊，由 泡囊产生游动孢子，有性产生一个 卵孢子。 •
(2)疫霉属(Phytophthora)
取马铃薯晚疫病(P.infestans)标本，观察受
害部位。注意症状特点，特别要注意叶片 上病斑的位置，大小、状态、颜色，边缘 是否清楚，是否产生灰白色的霉层(特别是 叶背面)?挑取马铃薯晚疫病菌斜面培养菌制 片镜检游动孢囊梗、游动孢子囊和游动孢 子，注意孢囊梗分枝的特点及游动孢子囊 的形态。
链霉菌 myctinomycetes•
•属于链霉菌属（Streptomyces），粉红孢类群（Roseoporus）弗氏亚群 亚群（Fradiae）
链霉菌属（Streptomyces）蓝色亚群（Gyaneus）.
链霉菌属（Streptomyces）黄色亚群（Flavus）
菌落边缘菌丝、产孢子形态
(1)单胞锈菌属(Uromyces)
冬孢子有柄，单细胞，顶壁较厚，突破寄主 表皮生于体外，取菜豆锈病 (U.appendiculatus)病叶和病荚标本观察夏孢 子堆和冬孢子堆的大小、颜色，是否穿破 表皮?用解剖针挑取病叶上的冬孢子制片镜 检，注意该属锈菌的形态特征。
(2)黑粉菌属(Ustilago)
2. 镜检：方法同上，观察酵母菌的细胞形态及生殖方式。 3. 菌落观察：仔细观察平板培养基上的孤立菌落，记载所观
察酵母菌种类的菌落特征。
注意：1. 加盖玻片时，以一边先接触液体，勿使产生气泡 ； 2. 用完油镜后一定要将镜头上的油擦干净。
五、实验结果的观察记录
1. 放线菌菌落特征：
菌落特征：圆形、较小、干燥、质地致密，表面粉粒 状或绒毛状，有呈同心环或辐射状。皿内菌丝与培养基紧 密结合，用针难以挑取。菌丝体与孢子常具不同色素，故 菌落正面和背面可显示相应颜色。有的种类可散发特殊气 味。
微生物的分离纯化：平板分离法
微生物的分离纯化：平板分离法基本原理分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
即用接种环将菌种接至平板培养基上，或用移液管、滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上，然后培养。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
包括稀释涂布平板法稀释混合平板法平板划线法土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方，所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地。
本实验采用三种不同的培养基和方法从土壤中分离细菌、放线菌、酵母菌和霉菌。
操作步骤采样：选取校园内或校园附近地点，用无菌药匙，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样约30g，装入事先准备好的无菌瓶内并盖好。
编号并记录地点、时间及其他环境条件。
一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。
制备土壤稀释液土壤稀释液的制备和稀释液的取样（建议稀释到10-即可）无菌操作1.取三只无菌培养皿，在皿底用记号笔写上稀释度、组别观察分离出的真菌菌落形态。
稀释混合平板法土壤稀释液的制备和稀释液的取样倒平板的无菌操作将融化的琼脂培养基,冷却至50℃左右(以手背能忍受的温度为准)，在酒精灯火焰旁，右手掌心握住三角瓶的底部，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，灼烧瓶口。
用左手的大拇子将皿盖掀开一缝，至瓶口刚好伸入，向皿内注入培养基（约15 mL,铺满皿底），迅速盖好皿盖。
左手持培养皿稍加旋转摇动，使培养基均匀分布于整个培养皿底部，然后平置于桌面水平位置,待凝后即为平板。
也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板。
微生物的分离与纯化- 从土壤中分离纯化微生物
1)超净工作台、恒温培养箱、酒精灯 2）1000ul及100ul移液枪、1000ul及100ul枪头、无菌
1.5ml的离心管、离心管架 3）无菌平皿、涂布棒、接种环 实验试剂:无菌水;
实验内容
1、采土样:
选择肥沃土壤,去表层土,挖5－20cm深度的土壤数10g, 装入已灭菌的牛皮纸袋,封好袋口,带回实验室。
所有菌落数均不在30~300间 以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数
6、挑菌划线分离
挑取单个菌落（细菌菌落），分别在平板上做分区和 连续划线。
370C培养48h检查菌落是否单纯。
划线方法：详见实验指导书P72、P237
无菌操作（ 近火焰处操作）： 接种环 Nhomakorabea烧灭菌、冷却
微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功能的微生物、优良菌 种及纯化被污染的菌种等。
土壤是微生物的大本营，混杂着大量的微生物，从中分离可得到只含有 这一种微生物的纯培养。
稀释分离法有倾注法和涂布法两种；菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬 液常用划线法进行纯种分离。
要获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适 培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间详见实验指导书P67 表格。细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，在30-37℃ 温度下培养1-2天。
平板菌落计数——活菌计数
0.1ml
0.1ml
0.1ml
0.1ml
00..11ml
0.1ml
0.1ml
0.1ml
0.9ml
0.9
分离纯化 基本流程
芽孢杆菌、放线菌、酵母菌、曲霉、青霉的分离纯化
芽孢杆菌、放线菌、酵母菌、曲霉、青霉的分离纯化一：实验目的1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。
2、学习、掌握微生物的鉴定方法。
3、对提取的土样进行微生物的分离、纯化培养，并进行简单的形态鉴定4、对简单鉴定后的微生物进行生理生化鉴定。
二：参考文献微生物课本，微生物实验教程，老师课件三：实验原理从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。
四：实验材料1、器材：小铁铲和无菌纸或袋（可省）、培养皿8个、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、无菌水试管5支（每支4.5mL水）、烧杯3个、三角瓶5个、电炉、玻璃棒、接种环、镊子、恒温培养箱、高温灭菌锅、天平、滤纸、pH试纸等。
2、试剂：配制牛肉膏蛋白胨培养基的原料（牛肉膏0.9g、NaCl1.5g、琼脂4.5g、蛋白胨3.0g）、Lugol氏碘液、可溶性淀粉0.6g、结晶紫染液、番红染液、95％乙醇、无菌水等。
3、土样：取自黄冈师范学院图书馆后，地下10cm左右。
五：实验方法步骤分离纯化1.菌体来源：土壤，发霉的橘子，发霉的花生。
2.培养基名称及配方：牛肉膏蛋白胨固体培养基（芽孢杆菌）牛肉膏1.2g，蛋白胨4g，NaCl2g，琼脂6~8g，自来水400ml，pH7.2~7.4查氏培养基（曲霉，青霉）蔗糖或葡萄糖24g,NaNO31.6g,K2HPO4·3H2O0.8g,KCl0.4g,MgSO4·7H2O0.4g,FeSO4·7H2O0.008g,琼脂12~16g,蒸馏水800ml，自然pH高氏1号培养基（放线菌）可溶性淀粉8g,KNO30.4g,NaCl0.2g,K2HPO4·3H2O0.2g,MgSO4·7H2O0.2gFeSO4·7H2O0.004g,琼脂6~8g,蒸馏水400ml,pH7.4~7.6制法：先用少量冷水把可溶性淀粉调成糊状，用文火加热，然后再加水及其他药品，待各成分溶解后再补足水至400ml.酵母菌富集培养基（酵母菌）葡萄糖20g，尿素0.4g，（NH4）2SO4·7H2O0.4g,KH2PO41g,Na2HPO40.2g,MgSO4·7H2O0.4g，FeSO4·7H2O0.04g，酵母膏0.2g，孟加拉红0.012g，pH4.53.实验条件：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，蔗糖或葡萄糖，可溶性淀粉，自来水，NaNO3K2HPO4·3H2OKCl MgSO4·7H2O FeSO4·7H2O KNO3尿素（NH4）2SO4·7H2O KH2PO4Na2HPO4酵母膏，孟加拉红平板15个，试管15个，试管塞15个，三角瓶4个，玻璃珠10颗，接种针1个，接种环1个，酒精灯1个，打火机1个，量筒1个，电子秤1台，标签纸，无菌操作台，高压灭菌锅，温箱4实验流程：平板灭菌——配制培养基——灌试管——培养基灭菌，水灭菌——倒平板，溶解土样——接种到平板——培养——接种到试管培养基——培养六：实验结果芽孢杆菌青霉芽孢杆菌：菌落较潮湿，部分小而有突起，菌落稍透明，菌落与培养基基本没结合，菌落正反两面颜色相同。
实验三霉菌、放线菌及土壤中微生物的分离纯化
． 黑 曲 霉 培 养 物 ．
一
插 片 培 养 物 ．
放 线 菌 培 养 物 ： 链 霉 菌
． 放 线 菌 和 真 菌 培 养 物
三 、 实 验 材 料
碘
灯环
四
液
、、
天
、
四、实验步骤
观察放线菌气生菌丝和基内 菌丝的区别 取插片一片，直接在显微镜 下进行观察，注意分界面两 侧菌丝形态的差异 插片法培养放线菌
分离真菌的同学取一瓶马丁-孟加拉红培养基 （200ml／瓶）熔化后冷至50℃后加链霉素 2ml倒平板。
四．悬液涂布(演示): 无菌操作(从稀至浓将菌液涂布均匀)采用10 －2，10－3，10 －4稀释液涂布马丁－孟加拉红平板；采用 10－3，10－4，10－5稀释液涂布牛肉膏蛋白胨平板,每人用 剩下的1个平板做划线分离，从三角瓶中取土壤悬液作划线分 离（演示）
2、霉菌：
霉菌是一些“丝状真菌”的统称，不是分类学上的名词。凡是在基质上长成毛状、棉絮 状或蜘蛛网状的丝状真菌统称霉菌。
霉菌形态比细菌、放线菌复杂，个体比较大，具有分枝的菌丝体和分化的繁殖器官。因 此，在观察是要注意菌丝的直径大小，菌丝体有无隔膜，营养菌丝有无假根，无性繁殖 或有性繁殖时形成的孢子是哪一种，孢子是怎样着生的。
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实验三 放线菌、霉 菌的形态观察 及微生物的分离纯 化
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一、实验 目的
实验（一）放线菌、霉菌的形态 观察
观察放线菌、霉菌的形态结构特征
学习掌握霉菌染色的基本方法 基本掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉 菌菌落形态特征
二、实验原理
放线菌：放线菌是介于细菌与丝状真菌之间而又接近于细菌的一类丝状原核生物，因菌落呈放射状 而得名。 放线菌的菌落在培养基上着生牢固，不易被接种针挑取，由于孢子的存在，常使菌落表面呈粉末状。 它和细菌单染色一样，可用石炭酸复红和吕氏美蓝等染料着色后，在显微镜下观察它们的形态。放 线菌是由不同长短的纤细的菌丝所组成的单细胞菌丝体，菌丝内无隔膜，菌丝体分为两部分，即潜 入培养基中的营养菌丝（基内菌丝）和有营养菌丝向上生长的气生菌丝，有些气生菌丝分化成各种 孢子丝，呈螺旋状、波浪形或分枝状等，着生形式有丛生、互生和轮生三种。孢子的表面光滑或粗 糙，圆或椭圆和干形。孢子有各种颜色。这些形态特点都是鉴别放线菌的重要依据。
实验四细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验四细菌、真菌、放线菌的分离与培养实验报告课程名称：环境微⽣物学实验实验类型：综合实验实验项⽬名称：微⽣物的分离与培养与菌落观察学⽣姓名：专业：环境⼯程学号：同组学⽣姓名：指导⽼师：实验地点：实验⽇期：2018 年 10⽉16⽇⼀、实验⽬的和要求1.掌握微⽣物接种培养技术2.掌握微⽣物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察⽅法，认识并理解它们的形态特征。
⼆、实验内容和原理⼟壤是微⽣物⽣活的⼤本营，是寻找和发现具有重要价值微⽣物的主要菌源。
在不同⼟壤中，各类微⽣物的数量千差万别。
为了分离获得某种微⽣物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗⽣素抑制不需要的微⽣物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微⽣物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接⾄新鲜平板上，即可使⽬的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微⽣物群体中获得只含有某⼀种或某⼀株微⽣物的过程称为微⽣物分离与纯化。
在分⼦⽣物学的研究及应⽤中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微⽣物群中分离出特定的微⽣物，⽽且还必须随时注意保持微⽣物纯培养物的“单⼀性”，防⽌其他微⽣物的混⼊。
2.平板涂布法：因为将微⽣物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采⽤稀释倒平板法也会使⼀些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧⽓⽽影响其⽣长，因此在微⽣物学研究中常⽤的纯种分离⽅法是涂布平板法。
⽤途上，⼀般多⽤于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进⾏分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微⽣物的⽅法是平板划线法，其原理是将微⽣物样品在固体培养基表⾯多次作“由点到线”稀释⽽达到分离⽬的的。
划线的⽅法很多，常见的⽐较容易出现单个菌落的划线⽅法有斜线法、曲线法、⽅格法、放射法、四格法等。
酵母菌的分离纯化实验方案
酵母菌的分离纯化∙实验目的1.了解培养基的配置与灭菌技术；2.无菌操作技术；3.工业微生物的分离与纯化技术；4.工业微生物的检测及保藏。
∙基本原理1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。
也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。
由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。
不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH 的要求选择合适的PH。
由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。
2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。
所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。
3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。
首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。
分离纯化的方法通常有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。
此次实验采用梯度稀释涂布平板法。
4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法（CFU）、光电比浊计数法等。
本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。
实验器材仪器设备恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器玻璃器皿烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片试剂与材料苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液其它纱布、滤纸实验内容及操作步骤(一)、样品的选择酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。
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土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化
一、实验目的
1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。
2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
4. 学习平板菌落计数法。
二、实验原理
将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。
要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。
表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求
样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度
/℃培养时间/d
土样细菌稀释分离10-5，10-6，
10-7
牛肉膏蛋白胨30～37 1～2
土样放线菌稀释分离10-3，10-4，
10-5
高氏1号28 5～7
土样霉菌稀释分离10-2，10-3，
10-4
马丁氏琼脂28～30 3～5
面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，
10-6
马铃薯葡萄糖28～30 2～3
细菌分离平
板
细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2
三、实验材料
1. 菌源土样
2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。
3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。
4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。
4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。
（一）系列稀释平板法
1. 取土样
选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
同时取10～15g，称重后经105℃烘干8h，置干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。
土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。
2. 制备土壤稀释液
称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，此即为10-2浓度的菌悬液。
用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。
同样方法，依次稀释到10-7。
稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。
3. 接种
分离不同的微生物类群采用不同的稀释度，参考表2-1进行选择。
从稀至浓分别吸取各浓度稀释液1mL于各平皿中（每个稀释度每种做2-3个培养皿，并注意做好浓度及培养基种类标记），同时做空白对照，倒入熔化后冷却至45℃～50℃左右的相应培养基，轻轻地摇动并旋转平皿，使菌悬液与培养基混合均匀，水平静置待凝，倒置于相应温度的培养箱中培养，2～5天后，观察菌落情况及计数。
1.包装纸套中取出无菌移液管；
2.安装橡皮头，勿用手指触摸移液管；
3.火焰旁取出土壤悬浮液；
4.灼烧试管口及移液管吸液口；
5.在火焰旁对试管中土壤悬浮液进行稀释；
6.用手掌敲打试管，混匀土壤稀释液；
7.从最小稀释度开始，将稀释液加入无菌培养皿中；8.将融化冷凉至45～50℃培养基倒入培养皿内；9.用毕的移液管装入废弃物缸中浸泡消毒后灭菌洗涤
4. 培养
冷凝后，将平板倒置于在各自适宜的温度下培养，培养一定时间后观察。
5. 计数
选菌落单个分散、菌落数适量且各平行皿数量接近的稀释度的平皿计数。
通常细菌和放线菌选取菌落数在30～300之间的平皿，霉菌选菌落数在10～100之间的平皿，最后换算成每克干土所含菌数，记录于表2-2。
表2-2 样品中四大类微生物的菌落数
采样日期
采样
地点
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
平均每克样品所含
微生物数
细菌
放线菌
酵母菌
霉菌
（二）涂布法分离（酵母菌定量分离用）
依前法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至45～50℃的马铃薯葡萄糖培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取三个不同稀释度菌悬液0.1mL，依次滴加于相应编号已制备好的马铃薯葡萄糖培养基平板上，右手持无菌玻璃涂棒，左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。
（三）平板划线法
取各平板一只做好标记，将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸一环10-2土壤稀释液，按图2-4和图2-5的方式在培养基表面轻轻划线，注意勿划破琼脂。
划线完毕，将培养基倒置培养，2～5天后，挑取单个菌落，并移植于斜面上培养。
如果只有一种菌生长，即得纯培养菌种。
如有杂菌，可取培养物少许，制成悬液，再做划线分离，有时要反复几次，才能得到纯种。
（四）平板菌落形态及个体形态观察
从不同平板上选择不同类型菌落观察，区分细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态特征。
再用接种环挑取不同菌落，在显微镜下进行个体形态观察。
将所分离的各类菌株的主要菌落特征和细胞形态记录于表2-3。
（五）分离纯化菌株转接斜面（斜面接种）
在分离细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的不同平板上选择分离效果较好的菌落各挑选一个用接种环接种斜面。
表2-3 各类菌株的主要菌落特征和细胞形态
菌株编号分离培养基菌落特征细胞形态
细菌1 2
放线菌1 2
酵母菌1 2
霉菌1 2
将细菌接种于牛肉膏蛋白胨斜面，放线菌接种于高氏1号斜面，霉菌接种于马丁氏培养基，酵母菌接种于马铃薯葡萄糖斜面上。
贴好标签，在各自适宜的温度下培养，培养后观察是否为纯种，记录斜面培养条件及菌苔特征于表2-4。
置冰箱保藏。
表2-4 四大类微生物斜面培养条件及菌苔特征
微生物培养基名称培养温度培养时间菌苔特征纯化程度
细菌
放线菌
酵母菌
霉菌
五、实验报告
1. 简述分离微生物纯种的原则及列出分离操作过程的关键无菌操作技术。
2. 将所检测样品中四大类微生物的菌落数填入表2-2。
3. 将所检测样品中各类菌株的主要菌落特征和细胞形态填入表2-3。
4. 记录斜面培养条件及菌苔特征（包括纯化结果）于表2-4。