ambion triol 中文说明书

或细胞
注意：所得颗粒含有 ECM，多糖和高分子量 DNA，
而上清液含有 RNA。 在高脂肪含量的样品中，一层
脂肪收集在上清液上方。
2.取出并丢弃脂肪层。
3.将清除的上清液转移到新管中。
3、进行相分离，或储存均质样品。 均质样品可以在室温下储存几个小时，或在-60 至-70℃保存至少一个月。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
相分离
1.均匀化样品（见均质化样品）在室温下孵育 5 分钟以允许核蛋白复合物完全解离。
下保存过夜，但长期储存可用 HEPES 调节至 pH7-8，加入 1mM EDTA。 储存于 4°C 或-20°C。
确定 RNA 和 DNA 的产量
在 260 nm 和 280 nm 处使用 RNA 和 DNA 的吸光度来确定浓度。
样品
步骤
RNA
1.在无 RNase 的水中稀释样品，并测量 260 nm 和 280
均质样品
1、确定样品类型，并按照下表在室温下进行均质化。 样品体积不应超过用于均质化的 TRIzol®试剂的体积 的 10％。 确保使用指定量的 TRIzol®试剂，因为体积不足可导致分离的 RNA 的 DNA 污染。
样本类型
步骤
组织
1.每 50-100 毫克组织样品加入 1 毫升 TRIzol®试剂。 2.使用 glassTeflon 或均质器均匀化样品。 注意：收 集后立即加工或冻结组织样品。
DNA 重悬
将 DNA 重悬于 8mM NaOH，浓度为 0.2-0.3μg/μL。
1.每 50-70 毫克组织或每 1×10 7 个细胞加入 0.3-0.6 毫升 8mM NaOH。
注意：由于分离的 DNA 不能重新悬浮在水或 Tris 缓冲液中，因此强烈建议重新悬浮 DNA 是温和的。
2.通过在 4℃下将样品以 12,000×g 离心 10 分钟，去除任何不溶物质。 3.将含有 DNA 的上清液转移到新管中。 根据 HEPES 的需要调整 pH 值，并进行下游选择。 DNA 可以在 4℃
TRIzol Reagent
Catalog Numbers 15596-026 15596-018
Ambion trizol 中文说明书
Quantity 100 mL 200 mL
Store at 2℃ to25℃
介绍 TRIzol®试剂是一种即用型试剂，用于在一小时内从人，动物，植物，酵母或细菌来源的细胞和组织样品中 分离出高质量的总 RNA（以及 DNA 和蛋白质）。 TRIzol®试剂是苯酚，异硫氰酸胍和其他专有成分的单相溶 液，有助于分离大小分子大小的各种 RNA 物质。 TRIzol®试剂由于高效抑制 RNase 活性而保持 RNA 的完整 性，同时破碎细胞并在样品均质化过程中溶解细胞成分。 TRIzol®试剂允许同时处理大量样品，并且是由 Chomcynski 和 Sacchi 开发的单步 RNA 分离方法的改进（Chomczynski＆Sacchi，1987）。 TRIzol®试剂允许用户从单个样品中顺序沉淀 RNA，DNA 和蛋白质（Chomczynski，1993）。 在用 TRIzol®试 剂均质化样品后，加入氯仿，使匀浆分离成透明的上层（含 RNA），相间和红色较低的有机层（含有 DNA 和蛋白质）。 用异丙醇从水层中沉淀出 RNA。 用乙醇从相间/有机层沉淀出 DNA。 蛋白质通过异丙醇沉 淀从酚 - 乙醇上清液中沉淀。 将沉淀的 RNA，DNA 或蛋白质洗涤以除去杂质，然后重悬浮以用于下游应 用。 分离的 RNA 可用于 RT-PCR，Northern 印迹分析，点印迹杂交，poly（A）+选择，体外翻译，RNA 酶保
需要以下附加材料，但不提供用于分离 RNA，DNA 或蛋白质。
分离 RNA
氯仿
分离 DNA
氯仿
分离蛋白质
氯仿
异丙醇
100％乙醇
异丙醇
75％乙醇（在 DEPC 处理过的水中） 75％乙醇
100％乙醇
无 RNase 的水或 0.5％SDS
0.1M 柠檬酸钠在 10％乙醇中
2.用 1 mL 75％乙醇洗涤沉淀，每 1 mL 初始匀浆中使用的 TRIzol®试剂。 注意：RNA 可以在-20℃下至少 1 年或在 4℃至少 1 周的 75％乙醇中储存。 3.短暂旋转样品，然后在 4℃下以 7500×g 离心管 5 分钟。 丢弃洗涤。 4.真空或空气干燥 RNA 颗粒 5-10 分钟。 不要用真空离心机干燥颗粒。 注意：不要让 RNA 完全干燥，因为颗粒会失去溶解性。 部分溶解的 RNA 样品的 A260 / 280 比例<1.6。 5.进行 RNA 重悬。 RNA 重悬 1.通过移液管尖端将溶液上下移动几次，将 RNA 沉淀物悬浮于无 RNase 的水或 0.5％SDS 溶液（20-50μL） 中。 注意：如果要将 RNA 溶解在随后的酶反应中，请勿将其溶解在 0.5％SDS 中。 2.在 55-60℃的水浴或热块中孵育 10-15 分钟。 3.继续下游应用，或存储在-70°C。 DNA 分离步骤 从相分离步骤中分离 DNA 和苯酚 - 氯仿层。 DNA 沉淀 1.除去覆盖在相间的剩余水相。 这对于分离的 DNA 的质量至关重要。 2.每 1mL 用于初始均化的 TRIzol®试剂中加入 0.3mL 的 100％乙醇。 3.盖上试管，倒置样品几次混匀。 4.在室温下孵育样品 2-3 分钟。 5.在 4℃下以 2000×g 离心管 5 分钟以沉淀 DNA。 6.如果需要蛋白质分离，则取出苯酚 - 乙醇上清液并将其储存在新的管中。清液可以在-70℃下储存几个月。 7.使用 DNA 沉淀物进行 DNA 洗涤步骤。 DNA 洗涤 1.每 1mL 用于初始均质化的 TRIzol®试剂，用 1mL 柠檬酸钠/乙醇溶液（0.1M 柠檬酸钠，10％乙醇，pH8.5） 洗涤 DNA 沉淀。 2.室温孵育 30 分钟。偶尔混合通过温和倒置。 注意：DNA 可以在柠檬酸钠/乙醇溶液中保存至少 2 小时。 3.在 4℃下以 2000×g 离心 5 分钟。取出并弃去上清液。 4.重复洗涤（步骤 1-3），一次。注意：重复洗涤两次大 DNA 芯片（> 200μg）。 5.每 1mL 用于初始均质化的 TRIzol®试剂添加 1.5-2mL 75％乙醇。注意：DNA 样品可以在 4℃的 75％乙醇中 储存几个月。 6.室温孵育 10-20 分钟。通过温和倒置偶尔混合管。 7.在 4℃下以 2000×g 离心 5 分钟。取出并弃去上清液。 8.空气或真空干燥 DNA 沉淀 5-10 分钟。不要让颗粒干燥。不要用真空离心机干燥颗粒。 9.进行 DNA 重悬浮步骤。
3-4μg
肾
3-4μg
3-4μg
蛋白质分离步骤
起始材料
数量
RNA
DNA
上皮细胞
1×106 cells
8-15μg
---
新烟叶 成纤维细胞 培养细胞，哺乳动物
---1×106 cells 1×106 cells
73μg 5-7μg
--5-7μg 5-7μg
骨骼肌肉和大脑
1mg
1-1.5μg
2-3μg
胎盘
1mg
1-4μg
2-3μg
肝
1mg
6-10μg
RNA 分离步骤
在准备和处理 RNA 时，请务必采取适当的预防措施以避免 RNA 酶的污染。
RNA 沉淀 1.（可选）当从小量样品（<10 6 个细胞或 10 毫克组织）中沉淀出 RNA 时，加入 5-10 微克无 RNA 酶的糖原
作为载体的水相。
注意：糖原与 RNA 共沉淀，但不抑制浓度≤4mg / mL 的第一链合成，不抑制 PCR。
悬浮细胞
1.通过离心收集细胞并除去培养基。
2.每 0.25mL 样品（来自动物，植物或酵母来源的 5-10 ×10 6 个细胞或细菌来源的 1×10 7 个细胞）加入 0.75mLTRIzol®试剂。 注意：添加 TRIzol®试剂前不要 洗涤细胞，以避免增加 mRNA 降解的几率。 3.通过上下移动数次将样品中的细胞溶解。 一些酵 母和细菌细胞的破坏可能需要使用均化器。
2、（可选）当制备具有高含量脂肪，蛋白质，多糖或细胞外物质（例如肌肉，脂肪组织或块茎植物材料） 的样品时，可能需要额外的分离步骤以从样品中除去不溶性物质。
注意：如果您对样品进行后续的 DNA 分离，请勿执行此额外的隔离步骤。
样品类型
步骤
具有高脂肪，蛋白质，多糖或细胞外物质含量的组织 1.匀化后，在 4℃下以 12,000×g 离心 10 分钟。
护测定和分子克隆。 分离的 DNA 可用于 PCR，限制酶消化和 Southern Blots。 分离的蛋白质可用于 Western 印迹，回收一些酶活性和一些免疫沉淀。 警告 TRIzol®试剂含有苯酚（有毒和腐蚀性）和异硫氰酸胍（刺激物），如果处理不当，可能会对健康构成危害。 始终与通风柜中的 TRIzol®Reagent 一起使用，并始终穿上实验室外套，手套和安全眼镜。 请联系您的环境 健康与安全（EH＆S）部门以获得正确的工作和处置指南。 避免与 TRIzol®试剂直接接触，因为接触皮肤， 眼睛或呼吸道可能导致暴露部位的化学灼伤。 如果接触到皮肤或眼睛，立即用大量的水冲洗暴露的区域 15 分钟，并在必要时就医。 如果吸入蒸气，必要时移动新鲜空气并寻求医疗救护。 有关更多信息，请参阅 我们网站 www.invitrogen.com/sds 上的 TRIzol®试剂 SDS（安全数据表）。 内容和存储 TRIzol®试剂以 100mL（目录号 15596-026）或 200 mL（Cat。no。15596-018）体积供应，并在室温下运输。 收到后，将 TRIzol®试剂储存在室温下。 妥当储存时，TRIzol®试剂稳定 12 个月。 使用范围 仅供研究使用。 不适用于人或动物的诊断或治疗用途。 所需材料
粘附细胞
从培养皿中取出生长培养基。
（单层）
2.每 10 cm2 培养皿表面积，将 1 mL TRIzol®试剂直接 加入培养皿中的细胞。 注意：添加 1 mL TRIzol®试剂， 用于 35 mm 培养皿，3 mL 用于 60 mm 培养皿，8 mL 用于 100 mm 培养皿。 3.通过将细胞上下移动数次，直接在培养皿中溶解细 胞。
在 95％乙醇中 0.3M 盐酸胍
离心机和转子能够达到 12,000×g 8 mM NaOH
1％SDS
聚丙烯微量离心管
离心机和转子能够达到 12,000×g 离心机和转子能够达到 12,000×g
水浴或热块（55-60℃）
聚丙烯微量离心管
聚丙烯微量离心管
准备样品
nm 处的吸光度。
2.使用 A260×稀释×40 =μgRNA / mL 的公式测定浓
度。
DNA
1.将样品稀释至水或缓冲液（pH> 7.5），并测量 260 nm
和 280 nm 处的吸光度。
2.使用 A260×稀释×50 =μgDNA / mL 的公式测定浓
度。
预期收益率
下表列出了各种原料的 RNA（A260 / 280> 1.8）和 DNA（A260 / 280 为 1.6-1.8）的典型产率。
2.每 1mL 用于匀浆的 TRIzol®试剂加入 0.2mL 氯仿。牢固地盖住管子。
3.用手摇动管 15 秒钟。
4.室温孵育 2-3 分钟。
5.在 4℃下以 12,000×g 离心 15 分钟。
注意：该混合物分成：较低的红色苯酚氯仿相，中部和无色的上部水相。 RNA 完全在水相中。上部水相为
总体积的约 50％。
6.以 45°倾斜管取出样品的水相，并将溶液移出。在吸取水相时，避免将任何相间或有机层吸入移液管。
7.将水相置于新管中，并进行 RNA 分离步骤。
8.如果需要分离 DNA 或蛋白质，可以节省中间层和有机酚 - 氯仿相。有关详细信息，请参阅 DNA 分离程序
和蛋白质分离程序。有机相可以在 4℃下储存过夜。
2.每 1mL 用于匀浆的 TRIzol®试剂，向水相中加入 0.5mL 的 100％异丙醇。
3.在室温下孵育 10 分钟。
4.在 4℃下以 12,000×g 离心 10 分钟。
注意：RNA 在离心之前通常不可见，并在管的侧面和底部形成凝胶状颗粒。
5.进行 RNA 洗涤。
RNA 洗涤
1.从管中取出上清液，只留下 RNA 颗粒。