1398酶米氏常数Km的测定

50ml•N00mlˆ&€ô 1 瓶 研钵、 光光 温 计
实验方法
酶液的准备
蛋白酶1g 称1398蛋白酶 蛋白酶 倒入研钵中，加入 倒入研钵中， 少量PBS缓冲液 少量 缓冲液 用研钵磨碎
定容至100ml 定容至
定容至50ml 取1ml定容至 定容至
过滤
40℃保温15分钟 ℃保温 分钟
0 酪蛋白浓度（ 酪蛋白浓度（mg/ml) 酪蛋白体积（ ） 酪蛋白体积（ml） PBS（ml） （ ） 酶液 0 0 1 1
结果计算
• 以1/v对1/[S]作图，求出1398酶催化酪蛋白水解的米 氏常数Km。
1 2 0.5 3 4 5 0.2 6 0.167 7 0.143 8 0.125
1/[s] 1/v
0.625
0.333 0.25
• Km=
所得结果(mg/ml=g/L) 2X104(MW)
mol/L
1 1.6
2 2
3 3
4 4
5 5 0.25 0.75 1
6 6 0.3 0.7 1
7 7 0.35 0.65 1
8 8 0.4 0.6 1
实验方法 0.08 0.1 0.15 0.2
0.92 1 0.9 1 0.85 1 0.8 1
40 ℃ ，pH7.5，10min ， TCA 2ml 40 ℃ ，10min，过滤 ， 滤液（ ） 滤液（ml） Na2CO3（ml） （ ） 福林试剂（ ） 福林试剂（ml） 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1
1398酶米氏常数Km的测定 1398酶米氏常数Km的测定
实验目的
掌握米氏常数Km和Vmax测定的基本原理； 学习米氏常数Km值测定的方法； 测出1398酶以酪蛋白为底物时的米氏常数 Km。
Байду номын сангаас
Km值的意义 Km值的意义
• Km：米氏常数，是研究酶促反应动力学最重要的常数： ：米氏常数，是研究酶促反应动力学最重要的常数： • 它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物 它的数值等于酶促反应达到其最大速度 一半时的底物 浓度〔 〕 它可以表示酶和底物之间的亲和能力， 浓度〔S〕，它可以表示酶和底物之间的亲和能力，Km 值越大，亲和能力越弱，反之亦然。 值越大，亲和能力越弱，反之亦然。 • 可以确定一条代谢途径中的限速步骤：限速步骤就是一条 可以确定一条代谢途径中的限速步骤： 代谢途径中反应最慢的那一步， 代谢途径中反应最慢的那一步，Km值最大的那一步反应 值最大的那一步反应 就是，该酶也叫这条途径的关键酶。 就是，该酶也叫这条途径的关键酶。 • 它可以用来判断酶的最适底物，某些酶可以催化几种不同 它可以用来判断酶的最适底物， 的生化反应，叫多功能酶，其中Km值最小的那个反应的 的生化反应，叫多功能酶，其中 值最小的那个反应的 底物就是酶的最适底物。 底物就是酶的最适底物。 • Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关而与酶的浓 是一种酶的特征常数， 是一种酶的特征常数 度无关，与底物的浓度也无关，这一点与Vm是不同的， 是不同的， 度无关，与底物的浓度也无关，这一点与 是不同的 因此，我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。 值来鉴别酶的种类。 因此，我们可以通过 值来鉴别酶的种类
40 ℃ ，20min，显色 ， OD650nm
数据处理
• 各管在可见光分光光度计测定波长650nm的 OD值(OD650nm)。从对Tyr标准曲线上查出 OD650nm相当于产物对Tyr的含量(µg数) • 计算出各种底物浓度下的速度v，取倒数1/v填 入表内。 V=Tyr微克数X4/10 1/v=1X2.5/Tyr微克数
测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver测定 可通过作图法求得。 最常用的 Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形 双倒数作图法。 双倒数作图法 式，即：
以1/v对1/[S]作图，可得一条直线
1 Km 1 1 = ⋅ + v Vm [ S ] Vm
1/v
1/Vm
实验原理
• 在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物 浓度对酶促反应的速度有很大的影响。
实验原理
• 酶促反应 酶促反应v-[S]曲线 曲线
v
[S]
• 推导出米氏方程为： 推导出米氏方程为：
Vm [ S ] v= K m + [S ]
• 其中 为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km 为米氏常数 其中[S]为底物浓度； 为初速度 为初速度； 为最大反应速度； 为底物浓度 为最大反应速度
-1/Km
1/[S]
• 本实验测定1398酶催化底物酪蛋白水解的Km。 • 反应式：酪蛋白+H2O 酪氨酸
无色
蓝色
• 可通过分光光度法测定产物Tyr的含量，求出反应速 度v。
试剂和器材
试剂
氯 Na2CO3 2%¿#, 0.02Mj }¨ 试剂 缓 (PH7.5) （TCA） 试管27‹a试管架 ， 5ml 管