实验4 叶绿体色素的吸收光谱曲线及含量的测定
叶绿素含量的测定实验报告
一、实验目的1. 学习叶绿素提取和分离的方法。
2. 掌握利用分光光度法测定叶绿素含量的原理和操作步骤。
3. 了解不同植物叶绿素含量的差异。
二、实验原理叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，其含量直接影响植物的生长和发育。
本实验采用分光光度法测定叶绿素含量，基于叶绿素在不同波长下对光的吸收特性，通过测定其最大吸收峰处的吸光度值，计算出叶绿素的含量。
三、实验材料与仪器实验材料：1. 新鲜菠菜、小麦、水稻等植物叶片。
2. 95%乙醇、无水乙醇、碳酸钙、石英砂等试剂。
实验仪器：1. 分光光度计2. 研钵3. 移液管4. 量筒5. 滤纸6. 比色皿7. 电子天平四、实验步骤1. 样品制备：- 称取新鲜植物叶片0.1g（准确至0.0001g），放入研钵中。
- 加入少量石英砂和碳酸钙，用研杵研磨成匀浆。
- 加入5ml 95%乙醇，继续研磨至叶片组织变白。
2. 叶绿素提取：- 将提取液转移至10ml试管中，用少量95%乙醇冲洗研钵、研杵及残渣，合并于试管中。
- 用滤纸过滤提取液，收集滤液。
3. 叶绿素分离：- 将滤液转移至比色皿中，以无水乙醇为空白，在波长663nm、645nm和652nm处测定吸光度值。
4. 叶绿素含量计算：- 根据吸光度值和标准曲线，计算出叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量。
- 叶绿素总含量 = 叶绿素a含量 + 叶绿素b含量。
五、实验结果与分析以菠菜叶片为例，实验结果如下：| 植物种类 | 叶绿素a含量（mg/g） | 叶绿素b含量（mg/g） | 类胡萝卜素含量（mg/g） | 叶绿素总含量（mg/g） || -------- | ------------------- | ------------------- | --------------------- | ------------------- || 菠菜 | 1.23 | 0.78 | 0.45 | 2.46 |通过比较不同植物叶片的叶绿素含量，可以分析其光合作用能力和生长发育状况。
叶绿体色素吸收光谱曲线的绘制
叶绿体色素吸收光谱曲线的绘制一、引言叶绿体是植物细胞中的重要器官，通过光合作用为植物生长和代谢提供能量。
叶绿体内含有多种色素，其中叶绿素是叶绿体中最主要的光合色素，它能够吸收阳光中的能量，并转化为化学能以供植物生长代谢。
科研人员通常使用光谱曲线来研究叶绿体色素的吸收特性，本文将介绍叶绿体色素吸收光谱曲线的绘制方法。
二、叶绿体色素的吸收光谱1. 叶绿体色素的种类叶绿体中含有多种色素，其中叶绿素a和叶绿素b是最主要的两种色素，它们吸收光谱曲线在400-700nm范围内有两个峰值，分别是绿光谱和橙黄光谱。
2. 吸收光谱的特点叶绿体色素对不同波长的光具有不同的吸收能力。
在光谱曲线上可以清晰地看到叶绿素在红光和蓝光波长处的吸收峰值，这与植物在不同波长的光线下呈现不同的颜色有着密切的关系。
三、叶绿体吸收光谱曲线的绘制方法1. 实验材料与准备（1）测光仪：用于测量叶绿体吸收光谱的光谱仪器。
（2）叶绿体样品：新鲜的叶绿体样品需要在光谱测量前进行破碎提取。
（3）100的乙醇：用于提取叶绿体中的色素。
2. 测量步骤（1）将叶绿体样品破碎并配制成0.5的叶绿素提取液。
（2）将叶绿素提取液置于测光仪中，进行吸收光谱的测量，记录各个波长的吸光度数值。
（3）使用实验数据绘制叶绿体色素的吸收光谱曲线，其中横轴为波长，纵轴为吸光度。
3. 数据处理与分析（1）绘制曲线时需要对实验数据进行平滑处理，去除噪音影响。
（2）根据测量得到的各个波长的吸光度数据绘制曲线，得到叶绿体色素的吸收光谱图。
四、实验注意事项1. 实验中需要注意叶绿体样品的处理和提取方法，保证叶绿体色素的完整性和稳定性。
2. 测量过程中要严格控制光线和温度等环境因素，以保证实验数据的准确性。
3. 实验后需要做好仪器的清洁和样品的处理，避免交叉污染和实验结果的偏差。
五、实验结果与分析通过上述方法绘制出叶绿体色素吸收光谱曲线后，我们可以清晰地观察到叶绿素在不同波长下的吸收特性。
叶绿体色素的提取、分离及含量测定
叶绿体色素的提取、分离及含量测定实验目的叶绿素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
叶绿素a与叶绿素b是高等植物叶绿体色素的重要组分，约占到叶绿体色素总量的75%左右。
叶绿素在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用(少量的叶绿素a还具有光能转换的作用)，因此叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，在一定范围内，光合速率随叶绿素含量的增加而升高。
另外，叶绿素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染、元素缺乏都可以影响叶绿素的含量与组成，并因之影响植物的光合速率。
因此叶绿素含量a与叶绿素b含量的测定对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义。
实验原理从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
纸层析是其中最简单的一种。
当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合色素中各种成分在两相(即流动相和固定相)间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的各种成分得到分离。
强光可以破坏离体的叶绿素，因为植物体内本来有还原酶，可以破坏光产生的强氧化物质。
而离体的叶绿素提取液中不含有还原酶，光产生的强氧化物质会破坏叶绿素。
叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b，二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度。
A663=82.04Ca+9.27Cb（1）A645=16.75Ca+45.60Cb（2）公式中Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b浓度（单位为g/L），82.04和9.27分别是叶绿素a和叶绿素b在663nm下的比吸收系数（浓度为1g/L，光路宽度为1cm时的吸光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素a和叶绿素b在645nm下的比吸收系数。
叶绿素含量的测定实验报告
叶绿素含量的测定实验报告叶绿素含量的测定实验报告引言：叶绿素是植物中一种重要的生物色素，它在光合作用中起着至关重要的作用。
叶绿素能够吸收光能，并将其转化为化学能，促进光合作用的进行。
因此，测定叶绿素含量对于研究植物的光合作用和生长发育具有重要意义。
本实验旨在通过不同方法测定叶绿素含量，并比较其准确性和适用性。
材料与方法：1. 实验材料：新鲜的植物叶片、酒精、乙醚、石油醚、丙酮、叶绿素提取液、比色皿、分光光度计等。
2. 实验步骤：a. 将新鲜的植物叶片取下，并用酒精擦拭叶片表面，以去除表面的叶蜡和杂质。
b. 将擦干的叶片放入离心管中，加入适量的酒精，用研钵捣碎叶片，使叶绿素溶于酒精中。
c. 将离心管放入冰箱中静置一段时间，使叶绿素充分溶解。
d. 将离心管取出，用滤纸过滤叶绿素提取液，收集滤液。
e. 取一定量的叶绿素提取液，分别加入不同溶剂（乙醚、石油醚、丙酮）中，使叶绿素溶于溶剂中。
f. 将溶液转移到比色皿中，并使用分光光度计测定其吸光度。
g. 根据标准曲线，计算叶绿素的含量。
结果与讨论：在本实验中，我们使用了不同的溶剂对叶绿素进行提取，并通过测定吸光度来计算叶绿素的含量。
实验结果显示，使用乙醚提取的叶绿素含量最高，丙酮次之，而使用石油醚提取的叶绿素含量最低。
这是因为不同的溶剂对叶绿素的溶解能力不同，乙醚具有较强的溶解能力，可以更好地提取叶绿素。
而石油醚的溶解能力较弱，因此提取效果较差。
此外，我们还发现在同一种溶剂中，叶绿素的吸光度与其浓度呈正相关关系。
也就是说，叶绿素浓度越高，吸光度也越高。
这为我们测定叶绿素含量提供了依据。
通过制作标准曲线，我们可以根据吸光度值来计算叶绿素的含量。
这种方法简单、快速，并且具有较高的准确性。
然而，需要注意的是，叶绿素的测定结果受到多种因素的影响。
例如，叶片的新鲜程度、叶片的厚度、溶剂的选择等都会对测定结果产生影响。
因此，在进行叶绿素含量测定时，应尽量保持实验条件的一致性，以提高测定结果的准确性和可比性。
叶绿素含量的测定实验报告
叶绿素含量的测定实验报告一、实验目的1、掌握叶绿素含量测定的原理和方法。
2、学会使用分光光度计测定叶绿素的含量。
3、了解叶绿素在植物光合作用中的重要作用。
二、实验原理叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，包括叶绿素 a 和叶绿素 b 两种类型。
叶绿素在特定波长的光下有吸收峰，利用分光光度计分别测定叶绿素提取液在 665nm 和 649nm 波长下的吸光度，根据朗伯比尔定律，可以计算出叶绿素 a 和叶绿素 b 的含量，进而得出叶绿素的总含量。
叶绿素 a 和叶绿素 b 在 665nm 和 649nm 波长下的吸光系数分别为8331 和 1675，在 649nm 波长下的吸光系数分别为 2454 和 4466。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的菠菜叶片。
2、实验仪器分光光度计、电子天平、研钵、漏斗、容量瓶、移液管、剪刀等。
3、实验试剂95%乙醇、石英砂、碳酸钙。
四、实验步骤1、材料准备选取新鲜的菠菜叶片，用剪刀剪碎，称取 05g 左右，放入研钵中。
2、研磨提取在研钵中加入少量石英砂和碳酸钙，以及 10ml 95%乙醇，充分研磨成匀浆。
3、过滤将研磨好的匀浆用漏斗过滤到 25ml 容量瓶中，用少量 95%乙醇冲洗研钵和漏斗，将滤液收集到容量瓶中，直至刻度线，摇匀。
4、吸光度测定以 95%乙醇作为空白对照，用分光光度计分别测定提取液在 665nm 和 649nm 波长下的吸光度，每个波长重复测定 3 次，取平均值。
五、实验结果与计算1、记录吸光度值665nm 波长下的吸光度平均值记为 A665，649nm 波长下的吸光度平均值记为 A649。
2、计算叶绿素含量叶绿素 a 的浓度（Ca，mg/L）＝ 1395×A665 688×A649叶绿素 b 的浓度（Cb，mg/L）＝ 2496×A649 732×A665叶绿素的总浓度（C，mg/L）＝ Ca ＋ Cb叶绿素含量（mg/g）＝（C×V）／（W×1000）其中，V 为提取液总体积（ml），W 为叶片鲜重（g）。
植物体叶绿素含量的测定实验报告
实验报告植物体叶绿素含量的测定摘要：本实验采用分光光度法，利用95%乙醇提取菠菜叶片中和番茄叶片中叶绿体色素，叶绿素a,叶绿素b和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是665nm>649nm和470r1m。
根据分光光度计测定的吸光度值，从而计算出乙醇提取液中叶绿体色素含量。
实验原理：利用95%乙醇提取叶绿体色素，叶绿素a,叶绿素b和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是665nm>649nm和470nm o根据分光光度计测定的吸光度值，可以计算出乙醇提取液中叶绿体色素含量。
实验目的：扇握分光光度计法对叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总浓度和类胡萝卜素总浓度测定和计算的方法。
实验材料：生物材料：菠菜叶片0.25g,自己培养的全素番茄苗叶片0.2g,缺磷番茄苗叶片0.2g；试剂：95%乙醇、石英砂、碳酸钙；仪器：分光光度计、电子天平、研钵、漏斗、玻璃棒、小烧杯、IOm1量筒、50m1容量瓶、剪刀、滤纸、滴管。
实验步骤•1叶绿体色素的提取取新鲜菠菜叶片0.25g,擦干，去中脉，剪碎放入研钵，加入少许石英砂和CaCo3，再加入95%乙醇3m1,研磨成匀浆，再加95%乙醇IOmI,静置IOmin,用漏斗滤去残渣，用乙醇反复冲洗研钵、残渣至无色；用容量瓶定容至50m1。
2.吸光度的测定取光径Icm比色杯，注入上述叶绿素提取液，以95%乙醇注入另一同样的比色杯内作为空白对照，在波长665、649、和47Onm下测定吸光度。
3结果计算依据下列计算公式，分别计算出叶绿素a、B的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。
C a（叶绿素a）=13.95A≡-6.8Cb（叶绿素b）=24.96-9-7.32A665C T（叶绿素）=C a+C b=18.16‰+6.63MC xc（类胡萝卜素）=（IOOOA470-2.05C a-114.8C b）∕248色素浓度（mg∕1）χ提取液体积（1）X稀释倍数叶绿体色素含量样品鲜重（g）实验结果：菠菜叶片提取液吸光值:叶绿素叶绿素叶绿素总浓度1、测定叶绿素ab为什么选用红光波长？叶绿素吸收红光和蓝紫光，故有两个吸收峰，光合色素还有类胡萝卜素，只吸收蓝紫光，所以不能选蓝紫光区测定，否则被类胡萝卜素干扰，只能用红光。
叶绿体色素的提取和理化性质的鉴定 实验报告
实验报告实验名称：叶绿体色素的提取、分离及其理化性质日期：2011年11月2日小组成员：——（2010******）——（2010******）专业：生物科学生物科学与生物技术班级：************摘要本实验对叶绿体中的色素进行了提取、分离和理化性质的鉴定。
实验采用纸层析法进行分离，并从叶绿体色素的荧光现象、皂化作用、Mg2+的取代以及色素光谱对其理化性质进行了鉴定。
一、实验目的1.以植物叶片组织为材料,提取叶绿体色素;2.以纸层析法分离其成分;3.鉴定叶绿体色素的理化性质。
二、实验原理1.提取: 叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
2.分离: 当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。
对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。
3.理化性质的观察: 叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。
叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。
三、实验材料及用具1.材料：菠菜；2.用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光镜、量筒、烧杯、试管等；3.试剂：丙酮、碳酸钙、层析液（石油醚：丙酮=25：3），20%KOH-甲醇、乙醚、1%HCl、醋酸铜。
四、实验步骤1.叶绿体色素的提取1)取新鲜菠菜叶片2克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵；2)加入少许石英砂和CaCO3，再加入无水丙酮10ml，研磨成匀浆，再加丙酮15ml；3)用漏斗滤去残渣,得叶绿体色素提取液(置于暗处)。
2.纸层析分离叶绿体色素1)层析样纸制备：将优质滤纸剪成3cm×9cm的长条，将一端剪成中央留约1cm×0.5cm的窄条；2)点样：用细玻璃棒蘸取叶绿体色素提取液点于层析纸的窄条上端中央部，晾干后在原处重复点样7-8次；3)展层：在层析缸中加入3-5ml层析推动液，然后将已点样的层析纸插入缸的側壁槽内，调节纸条使窄条1/2部分浸入推动液中，盖好盖子，于阴暗处展层约10min，即可在层析纸上分辨出4种不同的清楚色层。
植物生理学实验报告叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定
实验报告课程名称：植物生理学及实验实验类型：探索、综合或验证实验项目名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定一、实验目的和要求掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法二、实验内容和原理以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。
原理如下：1.叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂.常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。
2.皂化反应。
叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。
3.取代反应。
在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。
H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+。
4.叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。
透射光下呈绿色，反射光下呈红色。
5.光谱分析。
叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。
三、主要仪器设备1.天平（万分之一）、可扫描分光光度计（UV-1240）、离心机2.研具、各种容（量）器、酒精灯等四、操作方法与实验步骤1.定性分析a)称取鲜叶3-5g，并逐步加入乙醇15ml，磨成匀浆取匀浆过滤，并倒入三角瓶中，同时观察荧光现象。
b)取三角瓶中约1ml溶液于小试管。
加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和HO 1ml分层后观察。
2c)取代反应：加醋酸约1ml，取1/2加醋酸铜粉加热。
观察颜色变化。
2. 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：a) 取皂化反应的上层黄色石油醚溶液→稀释（470nm OD 0.5-1） b) 取下层绿色溶液（留1/3），反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)→稀释（663nm OD 0.5-1）c) 两者在400-700nm 处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰3. 叶绿素定量分析：鲜叶0.1g ，加1.9mlH 2O ，磨成匀浆，取2份0.2ml 加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心5min,上清液在645，652，663测定OD ，计算Chla,Chlb 和Chl 总量的值。
植物叶绿体色素含量的测定
实验四植物叶绿体色素含量的测定高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素吸收的。
叶绿体色素含量与光合作用密切相关，是反应叶片生理状态的重要指标。
在植物光和生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。
叶绿素含量也是知道作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。
一、原理：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公事计算出提取液中个色素的含量。
根据朗博—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A=aCL。
式中：a为比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，a为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合溶液在某一波长下的吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿体a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
二、植物材料、仪器设备及试剂配制：（一）植物材料：完全液和缺素溶液培养的烟草苗叶片（二）仪器设备：分光光度计、电子天平、剪刀1把、镊子一把、玻璃研钵2个、4个25mL具塞棕色容量瓶、漏斗2个、移液管若干只、吸球、洗瓶、玻璃棒、吸水纸、保鲜膜等。
（三）试剂配制：95%乙醇（分析纯）、石英砂和碳酸钙三、实验步骤：1.称取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2.称取剪碎的新鲜叶片0.2g，共4份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙及2mL95%乙醇，研成匀浆，在加入乙醇10mL，继续研磨至组织变白。
静置3~5min。
3.取滤纸1张，置漏斗中，用95%乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25mL棕色容量瓶中，用少量95%乙醇冲洗钵体、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
叶绿体色素的提取、分离及含量测定
叶绿体色素的提取、分离及含量测定一、实验原理叶绿体色素是植物进行光合作用吸收光能的重要物质基础。
叶绿体色素主要包含叶绿素a, 叶绿素b,叶黄素和胡萝卜素。
利用四种不同色素在流动相（扩展剂）和固定相（滤纸中吸附的水）中的分配系数不同而将其分开；叶绿体色素溶液各组成成分在可见光谱中具有不同的特征吸收峰。
因此，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度，根据经验公式即可计算出色素溶液中各色素浓度，不同溶剂所提取的色素吸收光谱有差异，因此，应使用不同的计算公式。
叶绿体色素80％丙酮提取液中叶绿素a和b分别在663nm、646nm波长下有最大吸收峰，据此所测得的吸光值代入不同的经验公式，计算出叶绿体色素丙酮提取液中叶绿素a和b的浓度及总浓度，并依据所使用的单位植物组织，求算出色素的含量。
二、实验目的掌握用纸层析法提取分离叶绿体色素的原理和方法；掌握叶绿体色素提取液中叶绿素a和b的浓度及其总含量的测定与计算方法。
三、器材和试剂1、植物材料：新鲜菠菜2、实验器材：电子天平、分光光度计3、实验试剂：丙酮、扩展剂四、操作步骤1、色素的提取1）称取新鲜的洗净擦干的植物叶片0.5g ，去中脉、剪碎后放入研钵中，加少量石英沙和碳酸钙，再加入2ml 丙酮，研磨成匀浆后再加入4ml 丙酮，放暗处静置萃取5min 后过滤（取滤液进行纸层析），再用4ml80％丙酮冲洗研钵和研棒后也一并进行过滤2、纸层析1）准备滤纸2）点样3）层析 时间40分钟左右4）层析结果3、含量测定1）去除残渣，取上清液，用80％丙酮定容至10ml 。
2）取1ml 稀释溶液，加4ml80％丙酮稀释5倍。
3）吸光度的测定以80％丙酮为对照，分别测定663nm、646nm 波长下的光吸收值五、结果计算80％丙酮提取液中色素浓度计算公式：C a =12.21A 663-2.81A 646C b =20.13A 646-5.03A 663C T =C a +C b =17.32A 646＋7.18A 663浓度单位：mg/L单位植物组织中叶绿体色素的含量：叶绿体色素的含量＝色素的浓度（mg/L）×提取液体积（L）×稀释倍数/样品鲜重。
实验4 叶绿体色素的吸收光谱曲线及含量的测定
实验二叶绿体色素吸收光谱曲线及含量的测定一、实验目的掌握分光光度计的使用方法，学会绘制叶绿体色素的吸收光谱曲线。
了解叶绿体色素含量测定的原理，掌握叶绿体色素含量测定的方法。
二、实验原理叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光谱最强的吸收区有两个：一个在波长640~660nm的红光部分，另一个在波长430~450nm的蓝紫光部分。
在光谱的橙光、黄光和绿光部分只有不明显的吸收带，其中尤以对绿光的吸收最少。
胡萝卜素和叶黄素的最大吸收带在蓝紫光部分，不吸收红光等长波的光。
根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：D＝KCLD：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度,K：为比吸收系数（吸光系数），L：液层厚度，通常为1cm。
95 ％乙醇提取液中叶绿素a 和b 及类胡萝卜素分别在在665nm 、649nm 和470nm 波长下具有最大吸收峰，据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算出叶绿体色素乙醇提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出色素的含量。
三、实验材料及器材仪器及试剂：研钵、量筒、滴定管、烧杯、比色杯、滤纸、脱脂棉、分光光度计、95%乙醇材料：菠菜叶片四、实验步骤1、提取称取1g菠菜叶片，加入少许95%乙醇，研磨，用量筒定容至25ml。
2、吸收光谱去1ml提取液，加3ml95%乙醇，置于比色杯中，用95%乙醇作为对照，在400~700nm 之间每隔20nm测一次光，记录波长和吸光度D于下表中，并在标准绘图纸上绘出叶绿体色素的吸收光谱曲线。
λ（nm）400 420 440 460 480 500 …... 600 620 640 660 680 700 A3、将色素提取液充分混匀后，取光径1cm 的比色杯，注入提取液，以95%乙醇作为空白对照，在波长665nm 、649nm 和470nm 下测定吸光度（、和）。
叶绿体色素定量测定及性质实验报告
题目：叶绿体色素定量测定及理化性质鉴定一、实验原理1、叶绿体色素定量测定植物叶绿素在红光区有最大吸收值，因此，利用分光光度计测定其在特定波长下的吸光值，然后利用朗伯-比尔定律计算叶绿素含量。
根据郞伯-比尔定律，当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质（稀溶液）时，其吸光值A与吸光物质的浓度C及吸收层厚度d成正比，及A=KCd。
如果溶液中含有数种吸光物质，则混合液在某一波长下的总吸光值等于各组分在此波长下吸光值的总和。
如欲测定叶绿素混合提取液中叶绿素a、b、叶黄素、胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在3个特定波长下的吸光值A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、b时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、b分别663nm和645nm（80％丙酮提取）有最大吸收值；同时已知在波长663nm下，叶绿素a、b吸收系数分别为82.04和9.27；在波长645nm下分别为16.75和45.6；在有叶绿素存在的条件下，用分光光度计法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量，其推导公式如下：A663 = 82.04 C a + 9.27 C b；A645 = 16.75 C a + 45.6 C b；C a = 12.21 A663 - 2.81 A645；C b= 20.13 A645– 5.03 A645；C x·c=式中，C a、C b和C x·c分别为叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度。
2、叶绿素理化性质鉴定叶绿素是一种双羧酸，其中一个羧基被甲醇所酯化，另一个被叶醇所酯化。
故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿素的盐。
皂化反应如下：叶绿素分子吸收光量子后转变激发态后很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿体含卟啉环，卟啉环中的镁原子可被氢离子、铜离子、锌离子所置换。
叶绿素光谱吸收实验报告
一、实验目的1. 了解叶绿素的光谱吸收特性。
2. 掌握使用分光光度计进行光谱吸收测定的方法。
3. 分析叶绿素在不同波长下的吸收光谱。
二、实验原理叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，其主要功能是吸收太阳光能。
叶绿素分子对光的吸收具有选择性，主要吸收红光和蓝紫光。
根据朗伯-比尔定律，有色溶液的吸光度与其中溶质浓度和液层厚度成正比。
通过测定不同波长下叶绿素溶液的吸光度，可以得到叶绿素的光谱吸收曲线。
三、实验器材1. 分光光度计2. 100ml容量瓶3. 移液管4. 烧杯5. 滤纸6. 叶绿素提取液7. 标准比色皿8. 紫外-可见光光谱仪9. 电脑及数据采集软件四、实验步骤1. 准备叶绿素提取液：取一定量的新鲜叶片，用研钵研磨后加入适量丙酮，充分提取叶绿素。
过滤后，用丙酮定容至100ml容量瓶，得到叶绿素提取液。
2. 配制标准溶液：取适量叶绿素提取液，用移液管移取一定体积至烧杯中，加入丙酮稀释至10ml，配制成一定浓度的标准溶液。
3. 设置分光光度计：打开分光光度计，选择合适的光源，设置波长范围为400-700nm。
4. 测定标准溶液吸光度：将标准溶液倒入比色皿中，放入分光光度计，测定其在不同波长下的吸光度。
5. 测定叶绿素提取液吸光度：将叶绿素提取液倒入比色皿中，放入分光光度计，测定其在不同波长下的吸光度。
6. 数据处理：将实验数据输入电脑，使用数据采集软件进行数据处理，绘制叶绿素的光谱吸收曲线。
五、实验结果与分析1. 叶绿素的光谱吸收曲线：根据实验数据，绘制叶绿素的光谱吸收曲线，可以看出叶绿素在波长400-700nm范围内具有明显的吸收峰，主要吸收红光和蓝紫光。
2. 叶绿素a和叶绿素b的吸收峰：通过对比实验结果，可以发现叶绿素a和叶绿素b在吸收光谱上的差异。
叶绿素a在645nm处有一个明显的吸收峰，而叶绿素b 在663nm处有一个明显的吸收峰。
3. 影响因素分析：实验过程中，温度、pH值、提取溶剂等因素都可能对叶绿素的光谱吸收产生影响。
叶绿体色素的提取分离及含量测定
甄 毓 环境科学与工程学院
一、实验目的
掌握叶绿素的提取、分离和定量测定方法。 熟练掌握分光光度计的使用原理及其方法。
1. 2.
二、实验原理
1. 朗伯—比尔定律
某有色溶液的光密度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即： D = kCL
9
式中：k为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1 cm 时，k为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸 收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得。
9
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总光密度等于 各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。
2. 叶绿体色素的提取及分离
提取：叶绿体色素不易溶于水而易溶于有机溶剂特性--丙酮、 乙醇等有机溶剂提取。
色素分离：纸层析法分离。吸附剂对不同物质的吸附力不 同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动 相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度 不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。
3. 定量测定
测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡 萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波 长下的光密度D，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜 素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。
9
以80%丙酮为提取液测定663 nm和645 nm下吸光度即可用下 列公式计算出提取液中各色素的含量。 Ca=12.72D663 - 2.59D645 Cb=22.88D645 - 4.67D663 （ 1） （ 2）
9
点样：取前端剪成三角形的滤纸条，用 毛细管取叶绿素提取液，如图点样于 “色 点”处，注意每次所点溶液不可过多，点 样后晾干，再重复操作2～3次。 分离：在大试管中加入推动剂，然后将 滤纸固定于胶塞上，插入试管中，使尖 端浸入溶剂内盖紧胶塞，直立于阴暗处 层析。 当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤 纸，风干，观察色带的分布。
实验四+高等植物光合色素含量的测定
3、怎样把方法一中的叶绿素含量mg/dm2转换为方法二中 的mg / g FW ？怎样测定不同形态的植物叶片的叶面积？
附1.叶面积的计算 选取单位面积重量是一个常数的打印纸如A4或16K。一
般A4打印纸为70~105GSM（g/m2）。 用铅笔轻轻地沿着叶缘在A4纸上划线。 用剪刀沿着叶缘剪下A4纸。 称所剪下的A4纸的重量W (g)。
3、调节所需频率并确定
返回
6、按运行键
返回
计算： 叶面积 W (g) GSM (g / m2)
附2.高速冷冻离心机的使用方法
1、插上电源插座 2、按T接通电源
4、按功能键调节温度下限
温度调节
3、按功能键调节温度上限
5、按功能键显示目前温度
1、按功能键显示Cd00 2、Cd00改为Cd47
4、按功能键把Cd4Leabharlann 改为Cd59 5、调节所需时间并确定
溶液中的Amax分别为663nm、645nm，由此得出：见推导过程
Ca = 12.7 A663 – 2.69 A645
；Cb = 22.9 A645 – 4.68 A663
Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A645
实验仪器及药品
实验材料：植物叶片
A663 = Ca.ka1 + Cb.kb1 A645 = Cb.kb2 + Ca.ka2
实验四高等植物光合色 素含量测定
实
验
背
景
K652 = 34.5
实验目的
掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。
实验原理
混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍
然可以根据Lambert-Beer定律（A = k L C）求出各组分含量。
〖重点〗叶绿体中色素的种类吸收光谱及实验证明光合作用的实
〖重点〗叶绿体中色素的种类吸收光谱及实验证明光合
作用的实
叶绿体是植物细胞中的细胞器，其中含有叶绿素和其他辅助色素。
叶
绿素是光合作用的关键颜色素，它能够吸收太阳光能，并转化为化学能以
进行光合作用。
在叶绿体中，叶绿素有多种类型，包括叶绿素a、叶绿素b、叶绿素
c、叶绿素d等。
其中，叶绿素a是最常见的叶绿素，它在植物中起着关
键的光合作用。
叶绿素的吸收光谱是指叶绿素对不同波长的光的吸收情况。
根据实验
证明，叶绿素的吸收光谱主要有三个峰值，分别位于蓝光（430-450nm）、红光（640-680nm）和远红光（700-750nm）区域。
实验证明了叶绿素对不同波长光的吸收能力。
其中比较著名的实验是
光谱吸收实验和光电子转移实验。
光谱吸收实验是通过测量不同波长的光通过叶绿体溶液时的光透射率
来研究叶绿素的吸收特性。
实验结果显示，叶绿素在蓝光和红光区域的吸
收峰值相对较高，而在绿光区域的吸收较低。
这解释了为什么植物叶片呈
现绿色。
光电子转移实验是通过测量光照下光合作用产生的光能转化为化学能
的效率来研究叶绿素的光吸收和电子转移过程。
实验结果显示，叶绿素对
蓝光和红光的吸收效率较高，但对绿光的吸收效率较低。
这意味着蓝光和
红光更容易被叶绿素吸收，并转化为化学能。
总的来说，实验证明了叶绿体中色素的种类、吸收光谱以及叶绿素对不同波长光的吸收能力。
这些实验证明了叶绿体中色素的重要性和光合作用的机制，为进一步研究光合作用和植物生长发育提供了基础。
叶绿体色素吸收光谱的简易实验
叶绿体色素吸收光谱的简易实验一、实验目的2. 比较、观察叶绿体中四种色素：理解它们的特点及与光合作用的关系二、实验原理光合色素主要存在于高等植物叶绿体的基粒片层上，而叶绿体中的色素能溶于有机溶剂中。
故要抽取色素，必须毁坏细胞结构，毁坏叶绿体膜，并使基粒片层结构轻易与有机溶剂直奔触，使色素溶解在有机溶剂中。
叶绿体中的色素存有四种，相同色素在层析液(脂溶性弱的有机溶剂)中的溶解度相同，因而随层析液的扩散速度也不同。
三、材料用具取新鲜的绿色叶片、定性滤纸、烧杯、研钵、漏斗、纱布、剪刀、小试管、培养皿、毛细吸管、量筒、有机溶剂、层析液(20份石油醚、2份丙酮、1份苯混合)、二氧化硅、碳酸钙。
四、实验过程（见到书ｐ54）1.提取色素：2.制取滤纸条：3.色素分离，纸层析法。
（不要让滤液细线触及层析液）4.观测：层析后，取出滤纸，在通风处吹干。
观察滤纸条上出现色素带的数目、颜色、位置和宽窄。
结果是：4条色素带从上而下依次是：胡萝卜素(橙黄色)、叶黄素(黄色)、叶绿素a(蓝绿色)、叶绿素b(黄绿色)。
五、探讨1.滤纸条上的滤液细线为什么不能接触到层析液？一、实验目的2.比较、观察叶绿体中四种色素：理解它们的.特点及与光合作用的关系二、实验原理光合色素主要存在于高等植物叶绿体的基粒片层上，而叶绿体中的色素能溶于有机溶剂中。
故要提取色素，要破坏细胞结构，破坏叶绿体膜，使基粒片层结构直接与有机溶剂接触，使色素溶解在有机溶剂中。
叶绿体中的色素有四种，不同色素在层析液(脂溶性强的有机溶剂)中的溶解度不同，因而随层析液的扩散速度也不同。
三、材料用具取新鲜的绿色叶片、定性滤纸、烧杯、研钵、漏斗、纱布、剪刀、小试管、培养皿、毛细吸管、量筒、有机溶剂、层析液(20份石油醚、2份丙酮、1份苯混合)、二氧化硅、碳酸钙。
四、实验过程（见到书ｐ54）1.提取色素：2.制取滤纸条：3.色素分离，纸层析法。
（不要让滤液细线触及层析液）4.观测：层析后，抽出滤纸，在通风处揉搓。
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实验二叶绿体色素吸收光谱曲线及含量的测定
一、实验目的
掌握分光光度计的使用方法，学会绘制叶绿体色素的吸收光谱曲线。
了解叶绿体色素含量测定的原理，掌握叶绿体色素含量测定的方法。
二、实验原理
叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光谱最强的吸收区有两个：一个在波长640~660nm的红光部分，另一个在波长430~450nm的蓝紫光部分。
在光谱的橙光、黄光和绿光部分只有不明显的吸收带，其中尤以对绿光的吸收最少。
胡萝卜素和叶黄素的最大吸收带在蓝紫光部分，不吸收红光等长波的光。
根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：D＝KCL
D：吸光度，即吸收光的量，
C：溶液浓度,
K：为比吸收系数（吸光系数），
L：液层厚度，通常为1cm。
95 ％乙醇提取液中叶绿素a 和b 及类胡萝卜素分别在在665nm 、649nm 和470nm 波长下具有最大吸收峰，据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算出叶绿体色素乙醇提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出色素的含量。
三、实验材料及器材
仪器及试剂：研钵、量筒、滴定管、烧杯、比色杯、滤纸、脱脂棉、分光光度计、95%乙醇材料：菠菜叶片
四、实验步骤
1、提取
称取1g菠菜叶片，加入少许95%乙醇，研磨，用量筒定容至25ml。
2、吸收光谱
去1ml提取液，加3ml95%乙醇，置于比色杯中，用95%乙醇作为对照，在400~700nm 之间每隔20nm测一次光，记录波长和吸光度D于下表中，并在标准绘图纸上绘出叶绿体色素的吸收光谱曲线。
λ（nm）400 420 440 460 480 500 …... 600 620 640 660 680 700 A
3、将色素提取液充分混匀后，取光径1cm 的比色杯，注入提取液，以95%乙醇作为空白
对照，在波长665nm 、649nm 和470nm 下测定吸光度（、和）。
4、结果计算
依据下列乙醇提取液中色素浓度计算公式，分别计算出叶绿素a、b的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。
C T=C a+C b
式中，、和分别为叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度（mg/l）; 为类胡萝卜素的总浓度（mg/l）
各叶绿体色素的含量
五、注意事项
1、每次改变波长后，要用95%乙醇重新调零。
2、用分光光度法测定物质含量时，分光光度计的波长调节要准确，参比杯与测定杯的透光率要一致。
附录：721型分光光度计的原理及使用方法
1.吸收光谱原理
物质中分子内部的运动可分为电子的运动、分子内原子的振动和分子自身的转动，因此具有电子能级、振动能级和转动能级。
当分子被光照射时，将吸收能量引起能级跃迁，即从基态能级跃迁到激发态能级。
而三种能级跃迁所需能量是不同的，需用不同波长的电磁波去激发。
电子能级跃迁所需的能量较大，一般在1eV～20eV，吸收光谱主要处于紫外及可见光区，这种光谱称为紫外及可见光谱。
如果用红外线(能量为1eV～0.025eV)照射分子，此能量不足以引起电子能级的跃迁，而只能引发振动能级和转动能级的跃迁，得到的光谱为红外光谱。
若以能量更低的远红外线(0.025eV～0.003eV)照射分子，只能引起转动能级的跃迁，这种光谱称为远红外光谱。
由于物质结构不同对上述各能级跃迁所需能量都不一样，因此对光的吸收也就不一样，各种物质都有各自的吸收光带，因而就可以对不同物质进行鉴定分析，这是光度法进行定性分析的基础。
根据朗伯—比耳定律:当入射光波长、溶质、溶剂以及溶液的温度一定时，溶液的光密度和溶液层厚度及溶液的浓度成正比，若液层的厚度一定，则溶液的光密度只与溶液的浓度有关，
式中，c为溶液浓度，E为某一单色波长下的光密度(又称吸光度)，I0为入射光强度，I为透
射光强度，T为透光率，ε为摩尔消光系数，l为液层厚度。
在待测物质的厚度l一定时，吸光度与被测物质的浓度成正比，这就是光度法定量分析的依据。
2.分光光度计的构造原理
将一束复合光通过分光系统，将其分成一系列波长的单色光，任意选取某一波长的光，根据被测物质对光的吸收强弱进行物质的测定分析，这种方法称为分光光度法，分光光度法所使用的仪器称为分光光度计。
分光光度计种类和型号较多，实验室常用的有72型、721型、752型等。
各种型号的分光光度计的基本结构都相同，由如下五部分组成:
①光源(钨灯、卤钨灯、氢弧灯、氘灯、汞灯、氙灯、激光光源)；
②单色器(滤光片、棱镜、光栅、全息栅)；
③样品吸收池；
④检测系统(光电池、光电管、光电信增管)；
⑤信号指示系统(检流计、微安表、数字电压表、示波器、微处理机显像管)。
光源→单色器→样品吸收池→检测系统→信号指示系统
2.分光光度计的使用方法
在仪器尚未接通电源时，电表指针必须于“0”刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。
将仪器电源开通，打开比色皿暗箱盖，选择需用的波长，然后将比色皿暗箱盖合上，比色皿座处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，旋转调“100%”电位器，使电表指针到满度附近，仪器预热20分钟。
放大器灵敏度有五档，是逐步增加的，“1”最低。
其选择原则是保证能使空白档良好调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低档，这样仪器将有更高的稳定性。
所以使用时一般置“1”，灵敏度不够时再逐渐升高，但改变灵敏度后需按“4”重新校正“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作。
预热后，连续几次调整“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作。
如果大幅度改变测试波长时，在调整“0”和“100%”后稍等片刻，当指针稳定后，重新调整“0”和“100%”即可工作。