α -亚麻酸生物合成方法研究

巴斯德毕赤酵母催化生成α －亚麻酸的工艺条件优化
冯康，葛军军，张昕欣
( 台州职业技术学院生物与化工学院，浙江台州318000)
摘要: 利用正交实验优化了巴斯德毕赤酵母催化硬脂酸生成α －亚麻酸的工艺条件，结果显示催化时巴斯德
毕赤酵母接种
量对催化效率影响显著，在此基础上得到的最佳催化条件为pH 值6. 5，硬脂酸乙醇饱和溶液加量4 mL，
巴斯德毕赤酵母接种量为
1 mL。

在此条件下，以α －亚麻酸甲酯气相色谱积分面积( 18∶3) /硬脂酸甲酯气相色谱积分面积( 18∶0) 为标准计算出的转化率
为7. 16。

关键词: 巴斯德毕赤酵母; α －亚麻酸; 正交试验; 催化
中图分类号: Q815 文献标志码: B 文章编号: 1001 －9677( 2015) 017 －0080 －02
*
基金项目: 台州市海洋科技创新团队子项目( No. MBＲ2012073) 。

通讯作者: 张昕欣( 1980 －) ，女，讲师，主要从事微生物制药的教学和研发。

α －亚麻酸是人体正常生理活动所必须的不饱和脂肪酸之一［1］，它对人的早期营养. 婴儿脑发育. 心脑血管疾病、高血脂症的治疗改善等均有一定的作用［2］，还能防止皮肤衰老. 抗炎抗过敏，对人体的健康有非常重要的积极意义［1］。

但α －亚麻酸在人体内普遍缺乏，目前我国普通人群体内缺乏α －亚麻酸的比例大于95% ，人均摄入量不到世界卫生组织推荐量( 1 g /d) 的一半［1］，各国都在对其高含量生产方法进行研究，以供在药剂，生命科学等方面使用［2］。

截止目前，国内外对α －亚麻酸的合成研究很多，但大多数工艺都需要高温、高压条件，工艺复杂，转化率较低［2 －4］。

尚无法进行产业化。

本研究利用正交实验初步优化了巴斯德毕赤酵母催化硬脂酸生成α －亚麻酸的工艺条件。

由于巴斯德毕赤酵母体内具有催化硬脂酸生成α －亚麻酸的完整代谢酶系，可进行高密度发酵，遗传稳定性高，不易染菌。

因此利用巴斯德毕赤酵母来催化硬脂酸制备α －亚麻酸成本低，工艺简单，无污染，具有很好的产业可行化，以及重要的经济价值和社会
价值。

1 材料与方法
1. 1 培养基配制
YEPD 培养基的配制: 酵母粉10 g; 葡萄糖20 g; 蛋白胨20 g; 蒸馏水1000 mL，调节PH 为酸性，采用高压蒸汽灭菌113 ℃，灭菌30 min，制成YEPD 培养基。

1. 2 巴斯德毕赤酵母细胞培养
巴斯德毕赤酵母菌种活化后，接种单菌落于5 ～10 mL YEPD 液体培养基中，30 ℃，300 rpm 过夜培
养。

上述活化菌液1% 接种量接种于25 mL YEPD 中。

28 ～30 ℃，300 rpm 培养到OD = 2 ～6，此时细胞为对数生长期。

1. 3 硬脂酸催化
将上述菌液接种至100 mL YEPD 培养基，30 ℃、300 rpm培养至OD600 = 1. 0; 加入饱和硬脂酸乙醇溶液后，调节pH 值、25 ℃培养24 h。

1. 4 α －亚麻酸甲酯化
酵母菌体用蒸馏水洗涤3 次，然后50 ℃烘干、研碎。

每100 mg 干菌粉加入5% 的KOH －CH3OH 溶液5 mL，70 ℃反应2 h。

反应结束冷却到室温，用6 mol /L 的盐酸调节溶液pH 值
为2. 0。

然后加入14% BF3 －CH3OH ( BF3 石油醚，甲醇)第43 卷第17 期冯康，等: 巴斯德
毕赤酵母催化生成α －亚麻酸的工艺条件优化81 4 mL，70 ℃反应1. 5 h 后加入饱和的NaCl 溶液10 mL，用8 mL 1∶4 的氯仿: 己烷抽提两次，收集上清液。

把含有脂肪酸甲酯的上清液用氮气吹干后正己烷溶解得到的脂肪酸甲酯。

将所得脂肪酸甲酯正己烷溶液10000 rpm 离心10 min，上清－20 ℃备用。

1. 5 α －亚麻酸气相色谱分析
把上述方法制备的脂肪酸甲酯化的样品，进行GC 分析。

分析条件如下: 气相色谱仪，岛津GC －7A; 色
谱柱，弹性石英毛细管柱，0. 32 mm × 30 m; 固相支持物，聚二乙二醇丁二酸酯( Poly －diethylene glycol succinate，DEGS) ; 镀膜物，酰亚胺; 载气，N2 ; 线速，10 cm/s; 分流比，100∶1; 气化室温度，250 ℃; 柱温，180 ℃; 尾吹，50 mL/min; 检测器，氢火焰离子化检测器。

上样量为1 μL。

以Sigma 公司生产的α －亚麻酸甲酯化后为标准品，上海生工公司产硬脂酸甲酯化后为底物对照。

2 结果与讨论
2. 1 正交试验设计
为寻求毕赤酵母催化硬脂酸生成α －亚麻酸的最佳条件，在预试验的基础上，采用正交试验设计法，以催化
时培养基pH 值( A) 、硬脂酸量( B) 和菌浓度( C) 三项为主要考查因素，分别选择3 个水平，依照L9 ( 34 )
正交试验方案进行试验，以α －亚麻酸甲酯气相色谱积分面积/硬脂酸甲酯气相色谱积分面积来计算硬脂酸转
化为α －亚麻酸的转化率，以此作为考察指标，对催化条件进行优选。

因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平
水平
因素
A B/mL C/mL
1 5. 5
2 1
2 6. 5
3 2
3 7. 5
4 4
2. 2 结果分析
正交试验结果见表2。

根据极差计算结果可知，各因素的影响大小顺序为: 菌浓度( C) ＞硬脂酸量( B) ＞培
养基pH 值( A) ; 优选出最佳条件为A2B3C1，即培养基pH 值为6. 5，硬脂酸量为4 mL，接种量为1 mL，在此条件下，以α －亚麻酸甲酯气相色谱积分面积( 18∶3) /硬脂酸甲酯气相色谱积分面积( 18∶0) 为标准计算出的转化率为7. 16。

分析出来的最优方案与第6 号试验条件相同。

从实际做出来的结果看，第6
组试验中的转化率是9 次试验中最高的，这也说明找出的最优方案是符合实际的。

由此可见，1% 的接种量在30 ℃、300 rpm 培养至OD600 = 1. 0 时，菌液细胞的状态是最适合催化硬脂酸生成α －亚麻酸的，不仅转化率最高，可以耐受的底物浓度也是最高的( 4 mL 硬脂酸乙醇饱和溶液) 。

表2 正交试验结果表
Table 2 Ｒesults of the orthogonal experiment
试验号
因素
A B C
18∶3 /18∶0
1 1 1 1 3. 50
2 1 2 2 1. 53
3 1 3 3 3. 46
4 2 1 2 2. 87
5 2 2 3 2. 60
6 2 3 1 7. 16
7 3 1 3 2. 65
8 3 2 1 5. 52
9 3 3 2 3. 88
K1 8. 49 9. 02 16. 18
K2 12. 63 9. 65 8. 28
K3 12. 05 14. 50 8. 71
k1 2. 83 3. 01 5. 39
k2 4. 21 3. 22 2. 76
k3 4. 02 4. 83 2. 90
极差1. 38 1. 82 2. 63
3 结论
本研究利用正交实验优化了巴斯德毕赤酵母催化硬脂酸生成α －亚麻酸的工艺条件，在pH 值6. 5，硬脂酸乙醇饱和溶液加量4 mL，巴斯德毕赤酵母接种量为1 mL 条件下，以α －亚麻酸甲酯气相色谱积分面积( 18∶3) /硬脂酸甲酯气相色谱积分面积( 18∶0) 为标准计算出的转化率为7. 16。

相对于目前需要高温、高压条件，工艺复杂，转化率较低［2 －4］的α －亚麻酸合成研究现状，本研究利用巴斯德毕赤酵母来催化硬脂酸制备α －亚麻酸成本低，工艺简单，无污染，具有很好的产业可行化，以及重要的经济价值和社会价值。

参考文献
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方法［P］．中国专利: 201110208499，2012 －01 －18．
［2］康定学，程富建．一种高含量α －亚麻酸的制备方法［P］．中国专
利: 02140849，2004 －01 －14．
［3］胡德甫，汪文继，袁沪宁．一种高纯度α －亚麻酸的制备方法［P］．
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［4］高健，韩柱，郑海洲，等．一种巴斯德毕赤酵母培养基［P］．中国专
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