DNS-氨基酸的制备和鉴定-

DNS-氨基酸的制备和鉴定

实验目的

1.了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定的原理

2.掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法

实验原理

荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-Cl)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-氨基酸再经酸水解可释放出DNS-氨基酸，其反应式如下：

图1：DNS-氨基酸生成反应机理图2：单项层析结果示意图DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB 法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。

DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即：

图3：DNS-Cl在pH过高水解产生DNS-OH

在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH

2

，即：

图4：DNS-Cl过量产生DNS-NH

2

DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄绿色荧光，而DNS-OH和DNS-NH

2

产生蓝色荧光，可彼此区分开。

DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01ug(相当于10—10mol)。由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。

层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。

聚酰胺是—类化学纤维原料，由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一C＝O及>NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类<如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。

实验器材

1.聚酰胺薄膜（7×7cm）

2.电吹风一个

3.紫外灯一台

4.点样管（4支）

5.吸管

6.量筒

7.烧杯（500ml）8.铅笔

实验试剂

1.DNS-Cl丙酮溶液

2.展层液： V(甲酸)：V(蒸馏水)=1.5:100

3.氨基酸样品：标准Gly、Phe、His溶液

4.混合氨基酸溶液

实验操作

1.DNS标记：

取4个小离心管，分别加入氨基酸30ul，再各加入30ulDNS-Cl丙酮溶液，混合均匀后置于37℃水浴中1小时；

2.点样：

在距聚酰胺薄膜底端1cm处用铅笔画一条直线，以这条直线为基准，分别取四个离心管中液体用四个不同的点样管在聚酰胺薄膜上点样，直径不宜超过2mm，，重复2-3次，最多不宜超过5次；

3.展层：

1)配制展层液(V(甲酸)：V(蒸馏水)=1.5:100)100ml，可两个小组共同配制使用；

2)将展层液置于培养皿盖（加12-13ml）或底（加10ml）中，将已点样的聚酰胺薄膜用皮筋

套上可使其站立后放入展层液中，盖上500ml烧杯；

3)待展层液上升到距顶端大约0.5cm时展层结束，将其取出，冷风吹干；

4.透射：

将冷风吹干的聚酰胺薄膜放在紫外灯下，用铅笔将黄绿色斑点圈出。

注意事项

1.严格控制点样位置以及点样直径，点样时直径不宜超过2mm，不宜点在边缘，点样后马上用吹

风机冷风吹干，重复2-3次以保证点样量足够，点样不能太用力，防止聚酰胺薄膜断裂而影响展层；

2.展层液要现配现用，需混合均匀，用量既不可不足，又不可过量而导致把点样点没过；

3.展层后必须经电吹风将膜吹干；

4.使用紫外照射时要注意使用时间短。

实验结果

1.下面是我在本次试验中所得到的聚酰胺薄膜，由于实验中第一次点样过大，所以将聚酰胺薄膜

的左下角与其它区域分割开，以免影响展层结果。从左到右依次为丙氨酸（Ala）、苯丙氨酸（Phe）赖氨酸（Lys）和混合氨基酸。

2.Rf值计算：

注：X为色斑中心至原点中心的距离，Y为溶剂前缘至原点中心的距离,其中Y值均相同为5.10cm。

在混合氨基酸中：

1.对于丙氨酸：X=

2.62cm,Rf=2.62/5.10=0.51

2. 对于苯丙氨酸：X=0.95cm，Rf=0.95/5.10=0.19

各个标准氨基酸与混合氨基酸中的对应成分Rf值相同。

分析总结

从实验结果分析可得以下几条结论：

1.由实验原理可知，氨基酸的氨基与DNS-Cl反应后是黄绿色荧光。而Lys含有两个氨基，因

此L ys带有两个黄绿色荧光标记。又由于DNS-Cl主要与α-氨基反应，由此可判断最上方的少量黄绿色荧光的是Lys的δ-氨基反应后的DNS-Lys。

2.DNS-丙氨酸的相对分子质量体积最小,非极性最强，形成氢键最弱，展层速度最快，因而在

最上方；而Lys由于与聚酰胺表面形成2个氢键，极性强，所以展层速度慢；Phe的极性处于两者之间，因而展层速度也在两者之间。所以本实验的结果主要与氨基酸的极性和所形成的氢键有关。

3.聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随展层液通过聚酰胺薄膜时，由于被分离

氨基酸与薄膜形成氢键，而各氨基酸形成氢键的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力强,展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。导致所展示的层析结果。

4.展层液与被分离氨基酸在聚酰胺离子表面竞争形成氢键，展层液使被分离氨基酸在展层液

与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有较大差异。易溶于展层剂的所受的动力作用大，展层速度快，反之，速度慢。

5.从实验结果分析可得：混合氨基酸中应同时含有丙氨酸和苯丙氨酸两种。

实验中可导致误差出现的几点：

1.在聚酰胺薄膜上点样时用力过大，很可能会使聚酰胺薄膜断裂，影响层析结果，可能会导

致心形黄绿色荧光斑出现，我在点样时就出现这种情况，导致混合氨基酸的荧光斑的其中