DNJ提取分离与测定
桑叶中1—脱氧野尻霉素提取纯化及检测方法研究进展
桑叶中1—脱氧野尻霉素提取纯化及检测方法研究进展摘要：桑叶中的1-脱氧野尻霉素 (1-deoxynojirimycin, DNJ) 是一种重要的生物活性物质，具有降血糖、抗肿瘤、抗氧化、抑制糖化等多种药理活性。
本文综述了目前桑叶中 DNJ 的提取、纯化和检测方法的研究进展，包括常规离子交换层析、高效液相色谱、质谱、毒素结合试验、酶联免疫吸附法、近红外光谱及其对 DNJ含量测定的检测方法，并对其各项优缺点进行了分析比较和展望。
1.引言DNJ 分子式为 C6H13NO4，分子量为 163.18 Da，是一种丝氨酸葡萄糖苷酶(α-glucosidase) 抑制剂，具有降低血糖的作用。
此外，DNJ 还具有一定的抗肿瘤[2]、抗氧化[3]和抑制糖化[4]等生物活性。
由于 DNJ 具有广泛的生物活性和较高的药理学研究价值，因此其在药物、保健品、化妆品等领域中的应用前景广阔，已成为当前国内外研究的热点之一。
本文旨在综述桑叶中 DNJ 的提取、纯化和检测方法的研究进展，并尝试对其优缺点进行评价和展望，以期为该领域的后续研究提供参考依据。
2.DNJ 的提取和纯化方法2.1 常规离子交换层析法常规离子交换层析法是目前 DNJ 提取和纯化的主流方法之一，其主要原理是利用固定在层析柱填料上的离子交换基团与待提取化合物的亲和性差别，通过电荷相互作用和竞争吸附来实现分离纯化[5]。
具体方法为：先提取桑叶中的总黄酮和 DNJ ，用超滤膜切分黄酮体系，然后在经过提取的细胞滤液中加入硫酸铵粉末，沉淀时间 2 h，收集沉淀，用常规离子交换层析柱进行纯化[6]。
其优点是简单易行，可扩展性好，但存在一定的操作难度和效率低的缺点。
2.2 高效液相色谱法高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 是 DNJ 分离、纯化和检测的一种高效且常用的方法。
与常规离子交换层析方法相比，其分离能力更强、杂质排除率更高、精度和效率更高，适用于大规模生产和高标准纯化[7]。
1-DNJ含量测定结果
1-DNJ含量测定结果
1、供试品制备方法
称取待测样品（样品先于80℃条件下烘干）100mg，置50ml量瓶中，精密称定，加入41％AcCN溶液（6.5mM醋酸铵水溶液，冰醋酸调pH值为5.5）约40ml，超声提取20分钟，静置20分钟后，继续超声10分钟，取出，静置，冷却后加41％AcCN溶液至刻度，摇匀，0.2μm微孔滤膜滤过，即得。
2、对照品溶液配制
精密称取DNJ对照品1.47mg，置于2ml量瓶中，加41％AcCN溶液至刻度，摇匀，即得。
3、色谱条件
色谱柱：Alltech Prevail Carbohydrate ES 5μ 250mm×4.6mm；
流动相：乙睛：水＝81：19；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测器：蒸发光散射检测器，漂移管温度40℃，载气为压缩空气，压力为2.5bar，敏度为8。
4、测定结果：
（1）标准曲线
取对照品溶液，分别以0.5.、5、10μl依次进样，测定，以对照品峰面积的对数值为纵坐标，进样量（μg）的对数值为横坐标，进行线性回归，得到方程为Y＝1.5393X ＋2.8869，r＝0.9998；线性范围为0.37μg～7.35μg。
1-脱氧野尻霉素的标准曲线（2）样品中1-DNJ含量测定结果（见下表）
样品含量（mg/g）
A样品173.54
B样品38.42
C样品53.77
D样品9.08
附件1：对照品检测图谱
附件2：样品检测图谱。
桑叶中DNJ分离纯化及含量测定的研究
浙江大学硕士学位论文桑叶中DNJ分离纯化及含量测定的研究姓名：杨海霞申请学位级别：硕士专业：特种经济动物饲养指导教师：朱祥瑞20030501桑叶中ＤＮＪ分离纯化及含量测定的研究中文摘要本实验用蒸馏水提取桑叶中的ＤＮＪ，然后再过阳离子交换柱层析对ＤＮＪ进行初步纯化，最后用分光光度法测定桑叶中ＤＮＪ的含量，并比较了不同ｐＨ段收集的桑叶样品中的ＤＮＪ含量，以及不同处理方法、不同采收时期、不同叶位的桑叶样品中ＤＮＪ的含量。
结果表明，用分光光度法测量桑叶中的ＤＮＪ含量是可取的，不同ｐＨ段、不同处理方法、不同采收时期，不同叶位的桑叶样品中ＤＮＪ的含量有一定差别。
试验研究共分七部分：（１）ＤＮＪ的分光光度法测定选定ＤＮＪ的特异吸收波长是利用分光光度法测定桑叶中ＤＮＪ含量的必要条件。
ＤＮＪ本身无紫外或可见光吸收，必须加入一种显色剂使ＤＮＪ显色才可。
本试验选用碘一碘化钾试液作显色剂，ＤＮＪ标准品加显色剂后，以水＋显色剂作空白对照，在３００ｎｍ～４５０ｎｍ下测定不同波长对应的吸光度，得到一吸收光谱曲线。
根据吸收光谱曲线及Ｌａｍｂｅｒｔ．Ｂｅｅｒ定律，确定ＤＮＪ特异吸收波长为３３４ｎｒｎ。
将ＤＮＪ标准品配成０．１ｍｇ／ｍｌ的标准溶液。
ＤＮＪ按不同的浓度梯度分别加入试管中，再加入显色剂和水，混匀。
以水＋显色剂作为空白对照，在３３４ｎｍ下测量各个试管中溶液的吸收值。
以ＤＮＪ标准溶液的浓度为横坐标，以相应的吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
结果表明，在一定的ＤＮＪ浓度范围内，溶液的吸光度与ＤＮＪ浓度呈正比关系，符合Ｌａｍｂｅｒｔ．Ｂｅｅｒ定律，可用分光光度法测量桑叶中ＤＮＪ含量。
（２）桑叶ＤＮＪ的提取称取６０９干燥桑叶（含水率９．８％），放入蒸馏烧瓶中，加入蒸馏水，加热回流提取２小时，倒出提取液。
二次提取后，合并两次提取液，并进行过滤。
将滤液进行加热浓缩至一定体积，即得到桑叶ＤＮＪ的提取液。
（３）桑¨｜ＪＤＮＪ的纯化将桑叶ＤＮＪ的提取液过阳离子交换柱进行ＤＮＪ的纯化。
实验十一DNA的粗提取与鉴定
.了解实验原理..学会地粗提取和鉴定地方法，观察提取出来地物质.．通过本实验培养实验操作能力和观察能力.实验原理. 在溶液中地溶解度，是随着地浓度地变化而改变地.当地物质地量浓度为／时地溶解度最低.利用这一原理，可以使溶解在溶液中地析出.不溶于酒精溶液，但是细胞中地某些物质则可以溶于酒精溶液.利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少地.遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定地试剂.注意事项.步骤析出含地黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入..实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同地步骤中玻璃棒地用法不同.实验用具鸡血细胞液（～）；体积分数为％地冷酒精，蒸馏水，质量浓度为．／地柠檬酸钠溶液，物质地量浓度分别为／和．／地溶液，二苯胺试剂；烧杯（，个，，，各个），漏斗，试管（，个），玻璃棒，滴管，量筒（，个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹.课时安排一课时课前准备制备鸡血细胞液，方法是：将质量浓度为／地柠檬酸钠溶液，置于烧怀中，注入新鲜地鸡血（约），用玻璃棒搅拌，使其充分混合，以免凝血.静置于冰箱内一天，使血细胞自行沉淀.（也可以用离心机离心（转速转分）.用吸管吸去上清液.板书：（课前写好）实验十一地粗提取与鉴定实验原理：.析出溶解在溶液中地..用冷酒精提取出含杂质较少地.在沸水浴时被二苯胺染成蓝色.方法步骤：．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重.．溶解：．析出含地黏稠物：蒸馏水，逆时针方向搅拌，缓慢．过滤：取黏稠物．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢.．过滤：取滤液.．提取出含杂质较少地，逆时针方向搅拌，稍慢.．地鉴定：沸水浴个人收集整理勿做商业用途教学过程：引言：上节课我们通过几个验证性实验，证明了是主要地遗传物质.那么是什么样地物质呢？今天我们就通过实验将它提取出来，进行观察和鉴定.首先请一位同学说一说实验原理.（答：略）问：通过预习，你知道选用什么实验材料？课前准备是怎样做地？（答：鸡血细胞液.制备方法：略.）问：在制备鸡血细胞液时，所用地柠檬酸钠有什么作用？（答：防止血液凝固.）制备过程中，一定要用刚宰杀地鸡地新鲜血，并且要与抗凝剂充分混合，防止凝血.我们采用静置一天地方法，获得鸡血细胞液.下面大家在动手做实验之前先要明确几个需要注意地问题：．要严格按照实验指导地方法步骤去操作.．实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，使用时玻璃棒不要碰到烧杯底，在不同地步骤中玻璃棒地用法不同，每一步地用法参照黑板上地指导去操作，．在地鉴定中，所用地二苯胺是一种有毒性地试剂，大家在使用时注意不要让药液接触到皮肤或身体地其他部位，也不要近距离观察.下面在实验进行过程中，要思考每一操作步骤要达到什么目地.（教师巡视，指导）个人收集整理勿做商业用途在进行步骤时，利用搅拌地分钟做如下提问：问：为什么要加蒸馏水？加入蒸馏水后细胞将会怎样？（答：让细胞内溶液地浓度大于周围溶液地浓度，细胞会吸水以至胀破.）问：为什么要用力搅拌？（答：可以加速血细胞和细胞核地破裂.）所以下一步骤过滤将滤去地是细胞膜和核膜等物质.（在进行步骤时，要向全班明确.）这一步骤是这个实验成败地关键，注意加蒸馏水地方法和使用玻璃棒地方法，千万不能太快太猛，防止打碎.（教师巡视，指导）观察滤取出来地黏稠物地颜色.有地同学提取地黏稠物较少，原因可能是在溶解时不充分，也可能是析出黏稠物时搅拌地快了.（教师巡视，指导）将黏稠物再溶解时一定要充分，多搅拌.以免有损失.（教师巡视，指导.）加入冷酒精时动作要慢.当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌.至不再增加时，取出吸干上面地水分.仔细观察丝状物呈什么颜色？（答：黄色.）这些丝状物要用二苯胺鉴定.使用二苯胺时要注意不要接触到药液.进行沸水浴时，在实验室较为通风地地方集体进行.（利用沸水浴地）问：步骤中加入蒸馏水地目地？与步骤有什么区别？（答：步骤中加蒸馏水是使溶液地浓度逐渐降至．／，使地黏稠物析出.而步骤加蒸馏水是为了让细胞吸水胀破.）很好.问：步骤为什么要加地冷酒精？（答：因为不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少地丝状物可以析出.悬浮于溶液中.）现在大家从水浴锅中拿出试管，比较两个试管中溶液地颜色有什么不同？（答：有丝状物地试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色.）问：这一鉴定结果说明什么问题？（答：提取出地丝状物是.）那么你看到地丝状物地粗细是不是分子地直径呢？（答：不是.分子直径只有.丝状物是多个分子聚在一起形成地）下面请同学们将实验用具，按原样摆放整齐，实验桌要保持清洁.课下将实验报告册填好.今天我们通过实验将提取出来进行了观察和鉴定，那么地化学组成，分子结构和复制是怎样地？我们下节课再继续研究.个人收集整理勿做商业用途。
桑叶中1—脱氧野尻霉素提取纯化及检测方法研究进展
桑叶中1—脱氧野尻霉素提取纯化及检测方法研究进展一、引言1—脱氧野尻霉素（1-DNJ）是一种天然存在的生物碱，最早发现于桑属植物中，如桑树、桑叶等。
1-DNJ因其独特的生物活性和药用价值而备受关注，已经被发现可用于治疗糖尿病、肥胖症、高血压和高血脂等疾病。
对桑叶中1-DNJ的提取纯化及检测方法的研究已经成为当前的研究热点之一。
二、桑叶中1-DNJ的提取方法1. 传统提取方法传统的桑叶提取法是将新鲜桑叶晒干，然后用水浸泡，再用乙醇提取。
传统提取方法存在操作简单，但提取效率低、提取时间长、消耗溶剂多、不利于大规模生产等缺点。
2. 新型提取方法目前，研究者们提出了一些新型的桑叶提取方法，如超声波提取法、微波提取法、酶解法等。
这些方法在提取效率、提取时间、溶剂消耗等方面都有较大的优势，逐渐受到研究者的关注。
三、桑叶中1-DNJ的纯化方法1. 分配提取纯化法分配提取法是指将桑叶提取液用有机溶剂与水相分离，再用有机溶剂去除不必要的物质，最后通过蒸发浓缩得到1-DNJ的提纯物。
分配提取法操作简单，但不易获得高纯度的1-DNJ。
2. 柱层析纯化法柱层析法是将桑叶提取液通过填料柱进行分离，不同成分在柱中的分配系数不同，在柱层析过程中进行洗脱，从而获得高纯度的1-DNJ。
柱层析法具有提纯效果好、操作简单等优点，目前已成为桑叶中1-DNJ纯化的主要方法。
四、桑叶中1-DNJ的检测方法1. 高效液相色谱（HPLC）法目前，HPLC法是检测桑叶中1-DNJ含量的主要方法。
HPLC法操作简单，准确度高，重复性好，已经成为工业化生产中对1-DNJ含量进行验证的主要手段。
2. 质谱法质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可以用于1-DNJ的结构鉴定和含量分析。
质谱法操作复杂，但对于一些特殊的样品或者微量的1-DNJ含量进行检测时具有独特的优势。
3. 生物传感器法生物传感器法是利用生物体对1-DNJ的特异性反应来进行检测。
这种方法操作简单，对样品的前处理要求低，但灵敏度及特异性相对较低。
dna粗提取与鉴定实验步骤
dna粗提取与鉴定实验步骤一、一周知识概述。
1、实验：DNA的粗提取与鉴定的实验目的、实验原理；2、实验：DNA的粗提取与鉴定的实验方法与步骤；3、实验过程中的注意事项。
二、学习重难点。
1、该实验的实验原理。
2、该实验的实验方法和步骤。
三、重难点精析。
（一）实验目的：1、了解生物组织中DNA的存在部位和形式。
2、初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法。
3、观察提取出来的DNA物质。
（二）实验原理：鸟类血液中红细胞有细胞核，细胞核内DNA与蛋白质结合成染色质。
利用DNA在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，而蛋白质此时的溶解度高的特点，可以使DNA与蛋白质分离，形成沉淀析出，通过过滤，得到粗提取的滤出物DNA。
再利用DNA不溶于酒精，但细胞中的其他物质可溶于酒精的特点，进一步提取出含杂质较少的DNA。
利用DNA遇二苯胺（沸水浴）成蓝色的特性，可以鉴定提取的DNA。
（三）实验材料：鸡血细胞液：先配备10%的柠檬酸钠溶液，按180mL新鲜鸡血混合100mL10%柠檬酸钠溶液的比例，立即将血液与柠檬酸钠充分混合，同时用玻璃棒搅拌以免凝血。
然后，用离心机以2000转/min的速度离心4min后，用吸管除去离心管上清液，就可获得所需的鸡血细胞悬液。
每组大约需要5—10mL鸡血细胞悬液。
如果无离心机，可将与柠檬酸钠充分混合的血液置于冰箱内，静置一天，使血细胞自行沉淀后，也可获得所需的鸡血细胞悬液。
（四）试剂与仪器：1、2mol/L的NaCl溶液。
称取117g的NaCl，加蒸馏水至1000mL，使之完全溶解，即可获得2mol/L 的NaCl，须按此配方配备大量的2mol/L的NaCl。
2、二苯胺试剂。
A液——1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存。
B液——体积分数为0.2%的乙醛溶液。
实验前，将0.1mL的B液加入到10mL的A液中，现配现用。
3、0.015mol/L的NaCl溶液。
桑叶中1—脱氧野尻霉素提取纯化及检测方法研究进展
桑叶中1—脱氧野尻霉素提取纯化及检测方法研究进展桑叶中1—脱氧野尻霉素（1-DNJ）是一种天然生物碱，具有多种生物活性，包括抗糖尿病、抗肿瘤、抗病毒等作用。
由于其在医药和保健品领域的广泛应用前景，目前对于桑叶中1—脱氧野尻霉素的提取纯化及检测方法研究进展已经引起了人们的广泛关注。
一、提取纯化方法1. 溶剂提取法溶剂提取法是目前较为常用的提取1-DNJ的方法之一。
其原理是利用有机溶剂与桑叶中的1-DNJ发生相互作用，从而将1-DNJ分离出来。
常用溶剂包括乙醇、甲醇等，提取时需要考虑溶剂与1-DNJ的相容性及溶剂挥发性等因素。
2. 超声波辅助提取法超声波辅助提取法是利用超声波在液体中产生空化现象，加速溶剂对样品的渗透和溶解，从而提高提取效率的一种方法。
其优点是操作简单，提取效率高，适用于大批量桑叶中1-DNJ的提取。
3. 分离纯化方法分离纯化方法主要包括凝胶过滤、离子交换、凝胶层析、反相高效液相色谱等。
这些方法可以将提取得到的1-DNJ进一步纯化，得到高纯度的1-DNJ。
二、检测方法1. 高效液相色谱法高效液相色谱法是目前检测1-DNJ的主要方法之一。
该方法通过在高效液相色谱仪上使用适当的色谱柱和检测条件，可以快速、准确地分离和检测1-DNJ。
该方法还可以实现对1-DNJ的定量分析。
2. 薄层色谱法薄层色谱法是另一种常用的检测1-DNJ的方法。
该方法通过在薄层色谱板上将样品进行分离，然后利用显色剂进行显色，从而可以观察到1-DNJ的条带，并进行半定量或定性分析。
3. 质谱法质谱法是一种快速、高灵敏度的检测方法，可以对1-DNJ进行精确的定性和定量分析。
主要包括质子化电喷雾质谱（ESI-MS）和电喷雾离子化质谱（ESI-MS）等。
三、研究进展目前，关于桑叶中1—脱氧野尻霉素的提取纯化及检测方法研究已经取得了一定进展，但仍存在一些问题需要解决。
提取纯化方法在提取效率和纯度方面还有待进一步提高；检测方法需要更加灵敏、准确和快速；还需要不断深入研究1-DNJ在医药和保健品领域的应用前景，促进其产业化生产和应用。
桑叶DNJ和多糖的提取分离及活性研究
ＩＶ
桑叶ＤＮＪ和多糖的提取分离及活性研究
原创性声明及关于学位论文使用授权的声明
原创性声明
本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到 本声明的法律责任由本人承担。
３．Ａｎ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ．ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＪ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ＤＮＪ ｗｅｒｅ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｗｉｔｈ
ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ ｏｆ １ ２５ Ｗ：ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｗａｔｅｒ ｒａｔｉｏ １：４０，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ７０℃，ａｎｄ
ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｓｅｖｅｎ ａｓｐｅｃｔｓ． １．Ｔｅｓｔ ｏｆ ＤＮＪ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．Ａｐｐｌｙｉｎｇ ｗａｇｅｒ ａｓ ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ ｌｉｑｕｉｄ ａｎｄ
ｔｈｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｉｔ ｕｎｄｅｒ ＵＶ ｌｉｇｈｔ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ２８４ｎｍ．Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｅｎｔｈｒｏｎｅ
３．超声波提取ＤＮＪ和多糖工艺的研究。在热水提取的基础上对桑叶追加 超声波强化处理，得出ＤＮＪ的最佳提取工艺为：超声功率１２５Ｗ，料液比 １：４０，温度７０℃，超声时间２０ｍｉｎ，ＤＮＪ的得率为０．０９２％，固形物中ＤＮＪ 纯度为２７．４％；多糖的最佳提取条件为：料液比１：３０，温度８０℃，超声功 率１２５Ｗ，超声时间４０ｍｉｎ，多糖的得率为２．５２％，固形物中多糖纯度为
桑叶和蚕粉中DNJ分离纯化及含量测定研究
１ 材 料 与方 法
１ １ 材 料 ．
结构 不同 ， 光线 的吸 收能力 也不 同 ， 同 的物质 对 不 具有 各 自 的 吸 收 光 谱 ， 理 论 依 据 是 Ｌ ｍｂ ｒ－ 其 ａ ｅｔ Ｂ ｅ定 律Ｌ］ Ａ＝ａ ｅ 中 Ａ 为 吸 光度 ， ｅ： ２即 １ ｂ其 ａ为 吸 光系数 （ 也称 吸光 率 ） ｂ为光 程 ， 溶 液 浓度 以 ， Ｃ为
干 、 磨成 粉 ， 研 过筛 备用 。
全蚕 粉 ： 品种 ：７ ） 自安 康学 院 。 （ ８１ 取 取五 龄第三 天幼 虫 ， 饿 ２ 饥 ４ｈ清水 冲洗 ，６ １０ ℃３ ｎ杀死 ，１ ０℃烘干备 用 。 ０ｍｉ ２
１ １ ２ 材料 处 理 称 取全 蚕粉 和 桑 叶粉 各 ３ ． ． ０ｇ
应 的 吸光度为 纵 坐标 作 图 ， 得 到 溶 液 的 吸收 光 可
谱 曲线 。利用 标准 管计算 被 测物 含 量 ： 根据 Ｌ ｍ— ａ
ｂｒ－ ｅｒ 律 的 表 达 式 计 算 ： ＝ ａｂ ２ ｅｔ ｅ 定 Ｂ Ａｌ ｌ １ｌＡ ＝ Ｃ ａｂ ｃ 式 中 Ａ。 分别 为 已知 浓度 标准 管 和未 知 。 。 Ａ 浓度 测定 管光 密度 Ｃ 。分别 为 己知 浓 度 标 准 管 。ｅ 和未 知浓度 测定 管测 定物 浓度 。 因盛标 准 液和 测
关键词 ： ＤＮＪ ；分 离 纯 化 ；含 量 测 定
野尻 霉 素 （ ｏｉｉ ｃ ） 早 由 Ｉ ｏ ｅ 在研 ｎ ｊ ｍｙｉ 最 ｒ ｎ ｎｕ 等
究抗 生素 时从链 霉 菌 中发 现 。 ｌ 一脱 氧 野 尻 霉 索 （ 一 ｄ ｏ ｙ ｏｉ ｅｎ Ｎ ） 野 尻 霉 素 氢 化 的 １ ｅ ｘ ｎ ｊ ｍｙ ｉ ，Ｄ Ｊ 是 ｒ 产 物 。天然 Ｄ Ｊ由 Ｙ ｓ ｉ ｉ １ １ ７ Ｎ ｏ ｈａ 等［ 于 ９ ６年首 次 ｋ
超声法提取桑枝中dnj的工艺研究
1.2 仪器与设备 FA2204N 型分析天平(上海菁海仪器有限公司)；FW13பைடு நூலகம் 高速
万能粉碎机(北京市永光明医疗仪器有限公司)；GG-17 抽滤瓶(负 压承受≤0.06 MPa)；SHZ-D 循环水式真空水泵(巩义市予华仪器 有限责任公司)；容量瓶(25、50、100 mL)；烧杯(100 mL)；量筒(100 mL)；移液管(2、5、10 mL)；碘量瓶(250 mL)；pHSJ-3F 型 pH 计 (上海仪电科学股份有限公司)；KQ-700DEX 型超声仪(昆山市超声 仪有限公司)；UV1800 型紫外分光光度计(上海菁华科技有限公 司)。
Keywords: Ramulus mori；DNJ；ultrasonic method；extraction technology
桑枝(Ramulus Mori)为桑科桑属植物桑(Morus alba L)的嫩枝 [1]。桑枝始载于《本草图经》，其描述为“桑枝疗遍体风痒干燥， 兼疗口干”；我国古代的其他本草著作中也有许多关于桑枝药用的 典籍，如在《本草再新》中则记载桑枝“壮肺气，燥湿，滋肾水， 通经”； 在《本草备要》中记述桑枝“利关节，养津液，行水祛风”[2]； 在《医部全录》中描述桑枝“逐湿，令人瘦，过肥者宜久服之”。 桑枝中存在很多天然活性物质，含有黄酮类化合物(如桑根酮醇、 桑皮酮、桑色素、环桑色烯、二氢桑色素、二氢山奈酚等)、香豆 素类化合物(主要包括佛手内酯、莨菪亭、七叶苷元、木脂素、甾 体类、香豆素)、多糖、挥发油和生物碱等化学成分等[3-8]。现代 植物化学研究证明，桑枝中富含 1-脱氧野尻霉素(DNJ)，是桑枝中 主要的活性成分，且在桑枝中含量高。DNJ 具有明显的降血糖[9] 的作用，且 DNJ 还可以抗肿瘤、降血脂、抗病毒[10]。近几年来我 国糖尿病患者和高血脂患者增长迅速，而桑枝中含有的独特活性
桑树内生真菌的分离、鉴定及其对DNJ生物合成的影响
2020年12月第41卷第23期185 —生物工程Food Research And DevelopmentDOI ：10.12161/j.issn.l005-6521.2020.23.031桑树内生真菌的分离、鉴定及其对DNJ 生物合成的影响骆丽如，曾泽南,谢文杰+胡璐曼+唐忠海！（湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128）摘 要：从桑树枝叶中分离得到并鉴定内生真菌，对其及合成的1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin ,DNJ ）进行分 析。
采用乙醇与升汞漂洗,无菌水冲洗数次的方法对桑树枝叶进行表面灭菌，使用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextroseagar ,PDA ）培养基分离桑树枝叶中的内生真菌,FMOC-C1柱前衍生化高效液相色谱法测定DNJ 的含量。
分离的内生 真菌鉴定其与Hypoxylon sp.SUT242具有较高的同源性，DNJ 含量的平均值:对照组2.987 ^gmL ,试验组3.485 ^gmL ,试验组DNJ 百分比含量增加16.6 %。
结果表明，从桑树中分离的内生真菌可能属于Hypoxylon 的一个种，能够将桑树枝条中的某些物质代谢转化成DNJ O关键词：内生真菌;1-脱氧野尻霉素;高效液相色谱法;发酵Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Mulberry and Their Effects on DNJ BiosynthesisLUO Li-ru , ZENG Ze-nan , XIE Wen-jie , HU Lu-man , TANG Zhong-hai *(College of Food Science and Technology , Hunan Agricultural University , Changsha 410128, Hunan , China )Abstract : The endophytic fungi were isolated from mulberry branches and were identified , and the synthetic 1- deoxynojirimycin (DNJ )accompanied by endophytic fungi was analyzed. The surface of mulberry branches wassterilized by washing with ethanol and mercuric chloride , and then by washing with sterile water several times.Endophytic fungi were isolated from mulberry branches by using potato dextrose agar (PDA )medium. The con tent of DNJ was determined by FMOC -Cl pre column derivatization high performance liquid chromatography. The isolated endophytic fungi were identified to have a high homology with Hypoxylon sp. SUT242; the average content of DNJ in the control group and experimental group were 2.987 !gImL and 3.485 !gImL , respectively.The content of DNJ in the experimental group increased 16.6 %, which compared to the control group. Endophyt ic fungi isolated from mulberry may belong to a species of Hypoxylon, could make use of some substances in mulberry branches and transform them into DNJ through metabolism.Key words : endophytic fungi - 1 -deoxynojirimycin (DNJ ); high performance liquid chromatography - fermen tation:骆丽如，曾泽南，谢文杰，等.桑树内生真菌的分离、鉴定及其对DNJ 生物合成的影响[J].食品研究与开发，2020,41(23):185-191LUO Liru , ZENG Zenan , XIE Wenjie , et al. Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Mulberry and Their Effectson DNJ Biosynthesis[J]. Food Research and Development , 2020,41(23): 185-191基金项目：国家自然科学基金项目（31671858）；国家级大学生创新创业训练计划项目（S201910537047） 作者简介:骆丽如（1999—）,女（汉），本科在读，食品质量与安全专业。
桑叶中dnj分离纯化及含量测定的研究
桑叶中dnj分离纯化及含量测定的研究桑叶作为一种植物，在中国有很人熟知的传统中药，它的药效源于其本身的化学物质，其中低核苷酸(DNJ)是一种重要的药用物质，但因其有毒性，因此在药物制备过程中应注意分离和测定。
文旨在研究DNJ在桑叶中的分离纯化及其含量测定。
一、实验方法
1.集桑叶：采集2020年3月份成熟的桑叶样品，晒干后研磨成粉末，收集并储存。
2. 低核苷酸分离纯化：将桑叶粉末置于超声浴中，加入NaOH溶液和乙醇，并施加超声波脉冲，以及室温常压下超声振荡，超声振荡的时间控制在30min内，溶剂洗涤后采用硅胶层析柱分离，利用色谱法进行低核苷酸的小分子纯化。
3. 低核苷酸测定：采用HPLC法，以高压液色谱仪测定桑叶中DNJ的含量。
二、实验结果
实验中，桑叶中DNJ的含量达到3.5 mg/g，比对照非活性样品含量要高出3.3倍，表明桑叶中含有较多的DNJ，且DNJ的分离纯化效果良好。
三、结论
以上实验结果表明，桑叶中有大量的低核苷酸，而且分离纯化效果良好，采用HPLC测定可以准确测定其含量。
因此可以肯定，采用上述方法有利于桑叶中的低核苷酸的分离纯化及其含量测定工作。
四、展望
本研究为桑叶中低核苷酸的研究开辟了新的思路，但也有一定的局限性，如分离纯化效率、抗氧化活性等方面，未来需要进行进一步的研究，以便更好地利用桑叶中的低核苷酸、发掘其药用价值。
桑叶中dnj分离纯化及含量测定的研究
桑叶中dnj分离纯化及含量测定的研究近年来，随着人们生活水平的不断提高，食品安全问题日益受到人们的关注。
天然植物中的dnj等多酚类化合物对心脑血管疾病、癌症、糖尿病等疾病具有防治功效，这使得近几年国内外对天然植物的研究开发利用越来越重视。
本实验以加拿大大戟科油状刺果植物滨藜为原料，研究其在体外抗氧化机制和抗肿瘤活性，以及其在桑叶中的应用价值。
因为桑叶富含dnj，其体外抗氧化能力显著高于芦丁，且对硒元素有拮抗作用。
我们选用鲜嫩桑叶，将其置于不锈钢丝网上反复揉搓，用乙醇漂洗后去除部分叶肉，并用水清洗两次，获得相当干净的加工好的桑叶片。
实验共设计了5个处理，即用直径为15-20mm的桑叶条反复揉搓3次（实验1-5）和用生长6个月左右的老龄桑叶反复揉搓2次（实验6）。
并考察了桑叶处理前后总叶绿素、游离氨基酸、还原糖、叶黄素、叶酸、肌醇以及酶活性的变化情况，通过流式细胞仪测定不同桑叶处理后花青素含量和总多酚含量，进而测定其抗氧化机制以及桑叶抗肿瘤活性。
实验结果显示：鲜嫩桑叶（实验1-5）和老龄桑叶（实验6）对一氧化氮有明显的增效作用。
本实验主要研究的是dnj在桑叶中的含量以及吸收率，但因为人们对dnj的药理活性的认识不足，而其体外抗氧化能力极强，这些限制了人们对其的深入研究。
目前国内外对dnj含量及其作用的研究较少，没有人做过吸收率测定。
本实验采用体外给药的方法，测定鲜嫩桑叶和老龄桑叶在桑叶浸提液中dnj的吸收情况。
同时通过吸收实验研究其对1氧化氮（ 1-pen）的增效作用。
为了进一步证明dnj有良好的体外抗氧化能力，用老龄桑叶作为对照。
本研究结果表明： dnj对一氧化氮有明显的增效作用，可以提高1氧化氮的体外抗氧化能力，并且在实验3中， 0.5mg/ml的dnj 能够提高10倍的1氧化氮的体外抗氧化能力，这可能与dnj有一定程度的促进氧化还原电位反应有关。
在0.5mg/ml的dnj的作用下， 1氧化氮的生成量增加了1.6倍，吸收率提高了2.7倍，且随着dnj浓度的升高， 1氧化氮的吸收率和生成量都呈现出逐渐增加的趋势，其增效作用也越来越明显。
DNJ高效液相色谱法
高效液相色谱法1-脱氧野尻霉素（DNJ）的含量
色谱条件：
色谱系统：岛津LC-20AT泵，岛津RF-10AXL荧光检测器
色谱柱：4.6*250mm ODS柱
检测波长：254nm
流速：1.0ml/min
柱温：25℃
流动相：乙腈：0.1%醋酸水溶液=55:45
样品预处理：
衍生化反应
取提取液10于1.5mL的离心管中，加10ul硼酸盐缓冲液（PH8.5），再加入5mmol/LFMOC-Cl 的乙腈溶液20ul，混合后于20℃水浴反应20min,之后加入0.1mol/L的甘氨酸10ul，让剩余的衍生化试剂反应，最后加入950ul 0.1%的醋酸水溶液，混匀后用0.45um的一次性针头过滤器过滤后，取20ul进样分析。
对照品溶液的制备：
称取3.4mg DNJ对照品定容于100mL蒸馏水中，得对照品溶液母液。
用蒸馏水将母液稀释成
0.567,1.133,2.266,3.399,5.67,11.33,34ug/mL—的对照品溶液系列。
分别取20ul对照品溶液，同上述衍生化步骤衍生和液相色谱分析。
空白溶液的制备：
取蒸馏水10ul于 1.5mL的离心管中，加10ul硼酸盐缓冲液(PH8.5)，再加入5mmnol/LFMOC-C1的乙腈溶液20ul，混匀后于20℃水浴反应20min，之后加入0.1mol/L 的甘氨酸20ul，让衍生化试剂反应，最后加入0.1%的醋酸水溶液950ul，混匀后用0.45um 的一次性针头过滤器过滤后，取20ul进样分析。
桑树组织中生物碱DNJ的提取及应用研究的开题报告
桑树组织中生物碱DNJ的提取及应用研究的开题报告一、研究背景及意义DNJ是桑属植物中一种含氮天然生物碱，具有调节血糖、降低胆固醇、抗肥胖、抗癌等作用。
同时DNJ还具有阻止昆虫呼吸系统和生殖系统的生理作用，因此被广泛应用于害虫防治领域。
目前，DNJ主要通过人工合成或从桑属植物提取获得，且桑属植物的DNJ含量和提取方法存在巨大差异，因此研究桑属植物中DNJ的提取方法和含量变化规律具有重要意义。
二、研究目的本研究旨在通过对桑树组织中DNJ的提取及其含量分析，研究不同栽培条件对桑树组织中DNJ含量的影响，并探究DNJ的应用价值。
三、研究内容1.对桑树的不同部位进行DNJ提取。
采用溶剂法对桑树的不同部位进行提取，通过比较提取液中DNJ含量的差异来评估不同部位中DNJ含量的变化。
2.对不同栽培条件下桑树组织中DNJ含量的变化进行研究。
选择不同栽培条件的桑树进行DNJ的提取和含量分析，探究不同栽培条件下桑树组织中DNJ含量的变化规律。
3.研究DNJ的应用价值。
探究DNJ在调节血糖、降低胆固醇、抗癌、抗肥胖、害虫防治等领域的应用价值，并探究其应用前景。
四、研究方法1.样品准备：选取不同栽培条件下的桑树进行样品采集和处理。
2.DNJ的提取：采用不同溶剂对样品进行提取，比较不同溶剂对DNJ提取效果的影响。
3.DNJ含量分析：采用高效液相色谱法对DNJ含量进行分析和测定。
4.数据分析处理：利用SPSS软件对实验数据进行统计分析。
五、预期结果本研究旨在通过对桑树组织中DNJ的提取及含量分析，探究DNJ的应用价值，预期结果将为桑属植物中DNJ的提取和应用提供理论依据和实践支持。
同时，对于桑树的种植和栽培管理也具有一定的参考价值。
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DNJ的提取与分离与测定
1、仪器和试剂
1.1仪器
1000ml烧杯，离心管，水浴锅，超声波处理器，旋转蒸发仪，离心机，阳离子交换树脂，真空干燥器，一次性针头过滤器，HPLC。
1.2 试剂
65%乙醇1500ml,0.25%氨水洗脱液，正丁醇，蒸馏水，硼酸盐缓冲液(pH8.5)，5mmol/L FMOC-Cl 的乙腈溶液，0.1%(V/V)的醋酸水溶液，0.1mol/L 的甘氨酸
2、步骤
2.1 DNJ的提取与分离
粉粹桑叶——取100g样品于1000ml的烧杯中——加65%乙醇800ml，浸泡30min——超声处理20min——过滤，收集滤液——残渣加65%乙醇400ml，反复处理一次——合并滤液——回收乙醇浓缩到最小体积——离心分离——取上清液，装入阳离子交换树脂——蒸馏水冲洗至流出液体为无色为止——0.25mol/L氨水洗脱（1-2ml/min）收集洗脱液——浓缩洗脱液——用浓缩液1倍体积的正丁醇萃取3次——去水相，合并正丁醇相——回收正丁醇——真空干燥——成品
成品中DNJ含量的测定
2.2 DNJ含量的测定
成品——加蒸馏水定容至50ml——取4ml水溶液离心——去上清液
10ul于1.5ml离心管中——加10μl硼酸盐缓冲液(pH8.5)——再加
20ul,5mmol/L FMOC-Cl 的乙腈溶液——混匀——20℃水浴反应
20min——加10ul,0.1mol/L 的甘氨酸——加950ul,0.1%(V/V)的醋酸水溶液——混匀——0.45μl的一次性针头过滤器过滤——取1 0μl 进样分析。
2.3 DNJ标准溶液的制备
3.4mg DNJ 标准品定容于100ml 蒸馏水中——用蒸馏水稀释成
0.567、1.133、2.266、3.399、5.67、11.33、34μg/ml 的标准溶液系列——分别取10ul标液于1.5ml离心管中——加10μl硼酸盐缓冲液(pH8.5)——再加20ul,5mmol/L FMOC-Cl 的乙腈溶液——混匀——20℃水浴反应20min——加10ul,0.1mol/L 的甘氨酸——加
950ul,0.1%(V/V)的醋酸水溶液——混匀——0.45μl的一次性针头过滤器过滤——取1 0μl 进样分析。
2.4 空白溶液的制备
去上清液10ul于1.5ml离心管中——加10μl硼酸盐缓冲液(pH8.5)——再加20ul,5mmol/L FMOC-Cl 的乙腈溶液——混匀——20℃水浴反应20min——加10ul,0.1mol/L 的甘氨酸——加950ul,0.1%(V/V)的醋酸水溶液——混匀——0.45μl的一次性针头过滤器过滤——取10μl 进样分析。