DNJ提取分离与测定
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DNJ的提取与分离与测定
1、仪器和试剂
1.1仪器
1000ml烧杯，离心管，水浴锅，超声波处理器，旋转蒸发仪，离心机，阳离子交换树脂，真空干燥器，一次性针头过滤器，HPLC。1.2 试剂
65%乙醇1500ml,0.25%氨水洗脱液，正丁醇，蒸馏水，硼酸盐缓冲液(pH8.5)，5mmol/L FMOC-Cl 的乙腈溶液，0.1%(V/V)的醋酸水溶液，0.1mol/L 的甘氨酸
2、步骤
2.1 DNJ的提取与分离
粉粹桑叶——取100g样品于1000ml的烧杯中——加65%乙醇800ml，浸泡30min——超声处理20min——过滤，收集滤液——残渣加65%乙醇400ml，反复处理一次——合并滤液——回收乙醇浓缩到最小体积——离心分离——取上清液，装入阳离子交换树脂——蒸馏水冲洗至流出液体为无色为止——0.25mol/L氨水洗脱（1-2ml/min）收集洗脱液——浓缩洗脱液——用浓缩液1倍体积的正丁醇萃取3次——去水相，合并正丁醇相——回收正丁醇——真空干燥——成品
成品中DNJ含量的测定
2.2 DNJ含量的测定
成品——加蒸馏水定容至50ml——取4ml水溶液离心——去上清液
10ul于1.5ml离心管中——加10μl硼酸盐缓冲液(pH8.5)——再加
20ul,5mmol/L FMOC-Cl 的乙腈溶液——混匀——20℃水浴反应
20min——加10ul,0.1mol/L 的甘氨酸——加950ul,0.1%(V/V)的醋酸水溶液——混匀——0.45μl的一次性针头过滤器过滤——取1 0μl 进样分析。
2.3 DNJ标准溶液的制备
3.4mg DNJ 标准品定容于100ml 蒸馏水中——用蒸馏水稀释成
0.567、1.133、2.266、3.399、5.67、11.33、34μg/ml 的标准溶液系列——分别取10ul标液于1.5ml离心管中——加10μl硼酸盐缓冲液(pH8.5)——再加20ul,5mmol/L FMOC-Cl 的乙腈溶液——混匀——20℃水浴反应20min——加10ul,0.1mol/L 的甘氨酸——加
950ul,0.1%(V/V)的醋酸水溶液——混匀——0.45μl的一次性针头过滤器过滤——取1 0μl 进样分析。
2.4 空白溶液的制备
去上清液10ul于1.5ml离心管中——加10μl硼酸盐缓冲液(pH8.5)——再加20ul,5mmol/L FMOC-Cl 的乙腈溶液——混匀——20℃水浴反应20min——加10ul,0.1mol/L 的甘氨酸——加950ul,0.1%(V/V)的醋酸水溶液——混匀——0.45μl的一次性针头过滤器过滤——取10μl 进样分析。