引物查询方法

一步一步教你使用NCBI查找DNA、mRNA、cDNA

一步一步教你使用 NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、...最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对……，这些问题在 NCBI 上都可以方便的找到答案。

现在我就结合我自己使用 NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下 BCBI 的使用。

希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！我分以下几个部分说一下 NCBI 的使用：Part one 如何查找基因序列、mRNA、PromoterPart two 如何查找连续的 mRNA、cDNA、蛋白序列Part three 运用 STS 查找已经公布的引物序列Part four 如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！请大家对以下我发表的容提出自己的意见。

关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充First of all，还是让我们从查找基因序列开始。

第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）下面以人的 IL6（白细胞介素 6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Map viewer 页面，网址为：/mapview/index.html在 search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。

操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。

2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。

尽管你分别点击后，序列代码、序列代码等有所差异，但碱基基本一致，不影响大家研究分析序列。

设计引物原则以及如何查找基因序列

引物设计原则：1.找出这种细胞物种的PTN全长核苷酸序列2.采用primer premier 5.0软件设计引物设计应注意如下要点：● 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应[2]。

● 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。

引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。

● 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。

不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。

另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。

5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。

● 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。

● 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。

● 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。

应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。

引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。

●7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。

●8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

blast验证引物

程序的选择
点击此按钮，进入结果页面
等待若干秒之后，出现results of BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。
（1）图形格式通过点击相应的bar 可以得到匹配情况的详细信息。
（2）结果信息概要：
A B C D E
从左到右分别为： A、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息 B、系列的简单描述 C、高比值片段对（high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的计算公式＝匹配的碱基×2＋0.1。举例：如果有20个碱基匹配，则其得分为40.1。 D、E值：代表被比对的两个序列不相关的可能性。E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显示了 E、最后一栏有的有UEG的字样，其中： U代表：Unigene数据库 E代表：GEO profiles数据库 G代表：Gene数据库
blast验证引物
一、概述
BLAST是Basic Local Alignmen类似性检索工具。它采用统计学记分系统，能将真正配对的序列同随机产生的干扰序列区别开来；同时采用启发式算法系统，即采用的是局部对准算法 (Local Alignment Algorithm)，而不是全序列对准算法(Global Alignment Algorithm)。
特殊blast
先将待查询的核酸序列和核酸序列数据库中的核酸序列按六种可读框架翻译成蛋白质序列，然后再将两种翻译结果从蛋白质水平进行查询。
ATGTTGGGGAAATGCTTGACC
引物序列输入窗口数据库的选择在此，我们选择第三个数据库输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样方法在进行下游引物的blast程序。在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。显示结果在新的窗口

qPCR 引物篇(7)-----BIOTN引物现货查询

BIOTN引物现货查询
BioTNT本公司拥有数十年的PCR引物设计和筛选经验，有大批量可以直接进行实验的引物对，种属涉及人，大鼠，小鼠，兔，豚鼠，羊，猪等。

现货引物具有以下优点：经过上千次实验验证，客户拿到上手就可以直接进行正式实验，缩短了实验周期；严格的质量把控，特异性好，在引物设计参数尽量均一化，使不同的基因能够在同一条件进行实验。

公司在完善已有的现货引物基础上开发出更多科研需求的引物。

常用内参基因：b-actin，GAPDH，18sRNA，
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Real time 染料PCR
PreMIX ：A2010A0112 1.25ml(20ul*125T)
Real time 染料PCR PreMIX ：A2010A0112-3 1.25ml*10（20ul*1250T）Real time 染料PCR PreMIX ：A2010A0112-2 1.25ml*4（20ul*500T）
细胞或组织样本中总RNA 抽提（用于细胞量和组织量较多时）：
A2010B0A01 A2010B0A02
细胞或组织样本中microRNA 抽提（用于细胞量少和微量组织的抽提）：RNeasy Micro Kit
石蜡样本中microRNA抽提：miRNeasy FFPE kit（50）217504
血清/血浆样本中microRNA抽提：miRNeasy Serum/Plasma Kit（50）217184。

引物设计的原则汇总中 -有重复的段落

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度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物
，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单
计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对
不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。
④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值
引物设计的原则汇总中（有重复的段落） - 日志 - 快乐的小麻雀 - 我的空间 - Powered by UCenter Home
。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method ，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm 值可以控制在50～70度之间。第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。 ⑤Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。 ⑥引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。 4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。二、引物设计过程中的心得 1、Primer 5.0搜索引物 ①Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 ②PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 ③Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 ④搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 2、Oligo 6.0评估引物 ①在analyze里，Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Di mer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol没有问题。 ②Hairpin Formation根据黄金法则 ③False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 ④在PCR栏，丁香园战友感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 ⑤Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。 3、其他 ①两个评价系统不一样，丁香园战友感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 ②3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（丁香园战友观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。 ③丁香园战友感觉3端有A无A影响不大，3端有T是不是一定不行，不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。 ④错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“到致命的程度”谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪。 ⑤GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以丁香园战友设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。

qPCR 引物篇(2)PCR 设计引物时如何查询基因

PCR 之引物设计--------基因序列查询篇•确定目标基因的形态：DNA or RNA•查找目标基因•比对目标基因同源性和特点•选取目标基因序列•选取目标基因的目标区段第一步：如何查基因：1、mRNA 序列的查询；以查大鼠cort为例；/search 选择11、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，Copy该ｍＲＮＡ序列作为软件查询序列的候选对象。

该mRNA文件的命名：Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA；NM_012835：是唯一的编号；把以下序列存成ｔｘｔ文件：Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA* Comment* Features* SequenceLOCUS NM_012835 438 bp mRNA linear ROD 11-FEB-2008DEFINITION Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA.ACCESSION NM_012835VERSION NM_012835.1 GI:6978682KEYWORDS .SOURCE Rattusnorvegicus (Norway rat)ORGANISM RattusnorvegicusEukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Glires; Rodentia;Sciurognathi; Muroidea; Muridae; Murinae; Rattus.REFERENCE 1 (bases 1 to 438)AUTHORS Xidakis,C., Mastrodimou,N., Notas,G., Renieri,E., Kolios,G.,Kouroumalis,E. and Thermos,K.TITLE RT-PCR and immunocytochemistry studies support the presence ofsomatostatin, cortistatin and somatostatin receptor subtypes in ratKupffer cellsJOURNAL Regul.Pept. 143 (1-3), 76-82 (2007)PUBMED 17481746REMARK GeneRIF: RT-PCR and immunocytochemistry studies support the presence of cortistatin in rat Kupffer cells.REFERENCE 2 (bases 1 to 438)AUTHORS Bourgin,P., Fabre,V., Huitron-Resendiz,S., Henriksen,S.J., Prospero-Garcia,O., Criado,J.R. and de Lecea,L.TITLE Cortistatin promotes and negatively correlates with slow-wave sleepJOURNAL Eur. J. Neurosci. 26 (3), 729-738 (2007)PUBMED 17686045REMARK GeneRIF: The capacity of CST-14 to increase SWA, together with preprocortistatin's inverse correlation with time spent in SWS, suggests a potential role in sleep homeostatic processes.REFERENCE 3 (bases 1 to 438)AUTHORS Deghenghi,R., Avallone,R., Torsello,A., Muccioli,G., Ghigo,E. and Locatelli,V.TITLE Growth hormone-inhibiting activity of cortistatin in the ratJOURNAL J. Endocrinol. Invest. 24 (11), RC31-RC33 (2001)PUBMED 11817718REFERENCE 4 (bases 1 to 438)AUTHORS de Lecea,L., Criado,J.R., Prospero-Garcia,O., Gautvik,K.M., Schweitzer,P., Danielson,P.E., Dunlop,C.L., Siggins,G.R.,Henriksen,S.J. and Sutcliffe,J.G.TITLE A cortical neuropeptide with neuronal depressant andsleep-modulating propertiesJOURNAL Nature 381 (6579), 242-245 (1996)PUBMED 8622767COMMENT PROVISIONAL REFSEQ: This record has not yet been subject to final NCBI review. The reference sequence was derived from U51919.1.Summary: inhibits growth hormone secretion; may act as aneuropeptide to mediate signaling via a somatostatin receptorsubtype [RGD].FEATURES Location/Qualifierssource 1..438/organism="Rattusnorvegicus"/mol_type="mRNA"/strain="Sprague-Dawley"/db_xref="taxon:10116"/chromosome="5"/map="5q36"gene 1..438/gene="Cort"/note="cortistatin"/db_xref="GeneID:25305"/db_xref="RATMAP:41189"/db_xref="RGD:2383"CDS 30..368/gene="Cort"/note="Preprocortistatin"/codon_start=1/product="cortistatin"/protein_id="NP_036967.1"/db_xref="GI:6978683"/db_xref="GeneID:25305"/db_xref="RATMAP:41189"/db_xref="RGD:2383"/translation="MGGCSTRGKRPSALSLLLLLLLSGIAASALPLESGPTGQDSVQDATGGRRTGLLTFLAWWHEWASQDSSSTAFEGGTPELSKRQERPPLQQPPHRDKKPC KNFFWKTFSSCK"sig_peptide 30..110/gene="Cort"mat_peptide 324..365/gene="Cort"/product="cortistatin-14"ORIGIN1 aaagcacagacttcaggtctccaaggaggatgggtggctgcagcacaagaggcaagcggc61 cgtcagccctcagtctgctgctgctgctgctgctctcggggatcgcagcctctgccctcc121 ccctggagagcggtcccaccggccaggacagtgtgcaggatgccacaggcgggaggagga181 ccggccttctgactttccttgcctggtggcatgagtgggcttcccaagacagctccagca241 ccgctttcgaagggggtaccccggagctgtctaagcggcaggaaagaccacccctccagc301 agcccccacaccgggataaaaagccctgcaagaacttcttctggaaaaccttctcctcgt361 gcaagtagcccgagcctgaccggagcctgaccggccaccctgtgaatgcagccgtggcct421 gaataaagagtgtcaagt//其中origin后面的序列，是我们用来设计的序列。

一步一步教你使用 NCBI 查找DNA

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第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）下面以人的 IL6（白细胞介素 6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Map viewer 页面，网址为：/mapview/index.html 在 search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。

操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene 前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。

2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。

一步一步教你使用NCBI查找DNA、mRNA、cDNA

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操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。

2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。

尽管你分别点击后，序列代码、序列代码等有所差异，但碱基基本一致，不影响大家研究分析序列。

引物查询方法范文

引物查询方法范文引物查询是一个快速获取相关文献的方法，对于进行科学研究或写作论文的人来说非常有用。

通过引物查询，可以找到发表过的研究文章、报告以及学术杂志等内容，以获取相关领域的最新研究成果和信息。

本文将介绍引物查询的基本原理、常见的引物数据库和查询方法。

引物查询的基本原理是通过已知文献中的引用关系，寻找新的相关文献。

当一个研究者在论文中引用了其他文献时，这些文献也被称为“引物”。

通过查找已有文献中的引物，可以找到与其相关的研究文献。

这种方法可以追踪和发现更多的相关文献，帮助研究者更好地了解一个研究领域，从而进行深入研究。

在进行引物查询之前，我们需要选择合适的引物数据库。

以下是一些常见的引物数据库：1. Web of Science：Web of Science是一个多学科的引物数据库，涵盖了自然科学、社会科学和人文学科。

它收录了众多有影响力的学术期刊和会议文章，并提供了引用分析和引传索引等丰富的功能。

2. Scopus：Scopus是另一个广泛使用的引物数据库，也涵盖了各个学科领域。

与Web of Science类似，它提供了引用分析、引证报告和引用预测等功能。

3. Google 学术：Google 学术是一个免费的引物数据库，它通过学术资源来找到相关文献。

尽管它的覆盖范围可能不如Web of Science和Scopus广泛，但它非常方便使用，可以满足大多数用户的需求。

一般来说，我们可以使用以下几种方法进行引物查询：1.通过文献数据库的引用功能：许多文献数据库都提供了引用功能，可以通过输入论文的标题、作者或者摘要进行查询。

系统会返回与之相关的引文，可以进一步查询这些引文是否与你的研究方向相关。

2. 使用文献的 DOI 进行查询：DOI（Digital Object Identifier）是一个唯一的标识符，用于标识数字对象，如文章、图书等。

通过使用DOI，可以直接在相关数据库中定位到对应的文献，并查找与之相关的引文。

使用 NCBI 查找DNA引物设计BLAST序列比对

最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对……，这些问题在 NCBI 上都可以方便的找到答案。

现在我就结合我自己使用 NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下 BCBI 的使用。

希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！我分以下几个部分说一下 NCBI 的使用：Part one 如何查找基因序列、mRNA、PromoterPart two 如何查找连续的 mRNA、cDNA、蛋白序列Part three 运用 STS 查找已经公布的引物序列Part four 如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。

关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充First of all，还是让我们从查找基因序列开始。

第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）下面以人的 IL6（白细胞介素 6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Map viewer 页面，网址为：/mapview/index.html 在 search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。

操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene 前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。

2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。

尽管你分别点击后，序列代码、序列代码等有所差异，但碱基基本一致，不影响大家研究分析序列。

RT-PCR引物设计原则和方法

RT-PCR引物设计原则和方法在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence，出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。

点击Primer，进入引物窗口。

此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search 按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。

在Search Parameters里面，可以设定相应参数。

一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100~200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300~500bp。

点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3‘端不要以A结尾，最好是G或者C，T也可以；3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。

此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55~70度之间，GC%应该在45%~55%间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。

该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。

若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。

最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。

但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。

blast验证引物分析

（3）结果详细信息
序列的信息
上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的匹配情况：共有21个碱基匹配，得分42.1分【21×2＋ 0.1＝42.1】，E值为0.014 上游引物与序列的1～21位点匹配
结果判断： ①验证文献报道的引物是否正确：如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因，一般说明你的引物正确性没问题。如果你blast后没有发现你的目的基因，或者分值很低，该引物就可能不适合用 ②检测该对引物是否可与其它序列匹配，引起PCR的非特异性扩增。如果找到了你的目的基因名称，而且找到了一大批同物种的不同基因，（上下游引物分别搜索到相同的基因），而且分数也较高。这时表明你的引物设计的特异性不高，极有可能在你的扩增产物中出现非特异性产物。
1. 进入网页： /blast/Blast.cgi
Blast的页面
常见生物基因组的blast
核酸序列数据库查询；
蛋白质序列数据库先将待查询的核酸序列按六种可读框架翻译成蛋白质序列，然后将翻译结果对蛋白质序列数据库进行查询；先将核酸序列数据库中的核酸序列按六种可读框架翻译成蛋白质序列，然后将待查询的蛋白质序列及其互补序列对其翻译结果进行查询；
程序的选择
点击此按钮，进入结果页面
等待若干秒之后，出现results of BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。
（1）图形格式通过点击相应的bar 可以得到匹配情况的详细信息。
（2）结果信息概要：
A B C D E
从左到右分别为： A、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息 B、系列的简单描述 C、高比值片段对（high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的计算公式＝匹配的碱基×2＋0.1。举例：如果有20个碱基匹配，则其得分为40.1。 D、E值：代表被比对的两个序列不相关的可能性。E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显示了 E、最后一栏有的有UEG的字样，其中： U代表：Unigene数据库 E代表：GEO profiles数据库 G代表：Gene数据库

ncbi设计引物

转一步一步教你使用NCBI 查找DNA、引物设计、BLAST 序列比对[i=s] 本帖最后由绝地重生于2012-10-6 20:13 编辑[/i]原始版本下载：[url=/preview/2096690]/preview/2096690[/url]最近看到很多战友在论坛上询问如何查询[size=12px]基因序列、如何进行引物设计、如何使用[/size]BLAST 进行序列比对……，这些问题在NCBI 上都可以方便的找到答案。

现在我就结合我自己使用NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下BCBI 的使用。

希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！我分以下几个部分说一下NCBI 的使用：Part one 如何查找基因序列、mRNA、PromoterPart two 如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列Part three 运用STS 查找已经公布的引物序列Part four 如何运用BLAST 进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。

关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充First of all，还是让我们从查找基因序列开始。

[size=24px][b]第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）[/b][/size]下面以人的IL6（白细胞介素6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Map viewer 页面，网址为：[url=/mapview/index.html][color=#0066cc]http://www.ncbi.nlm.nih. gov/mapview/index.html[/color][/url]在search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。

primer操作流程

一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy 目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。

点击Primer，进入引物窗口。

②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。

在Search Parameters里面，可以设定相应参数。

一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～5 00bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。

此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。

该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。

若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。

最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。

但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。

引物设计的详细步骤

一、引物设计s‎t ep by step1、在NCBI‎上搜索到目‎的基因，找到该基因‎的mRNA‎，在CDS选‎项中，找到编码区‎所在位置，在下面的o‎r igin‎中，Copy该‎编码序列作‎为软件查询‎序列的候选‎对象。

2、用Prim‎e r Premi‎e r5搜索‎引物①打开Pri‎m er Premi‎e r5，点击Fil‎e-New-DNA seque‎n ce,出现输入序‎列窗口，Copy目‎的序列在输‎入框内（选择As），此窗口内，序列也可以‎直接翻译成‎蛋白。

点击Pri‎m er,进入引物窗‎口。

②此窗口可以‎链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Sea‎r ch按钮‎，进入引物搜‎索框，选择“PCR‎prime‎r s”，“Pairs‎”，设定搜索区‎域和引物长‎度和产物长‎度。

在Sear‎c h Param‎e ters‎里面，可以设定相‎应参数。

一般若无特‎殊需要，参数选择默‎认即可，但产物长度‎可以适当变‎化，因为100‎～200bp‎的产物电泳‎跑得较散，所以可以选‎择300～500bp‎.③点击OK，软件即开始‎自动搜索引‎物，搜索完成后‎，会自动跳出‎结果窗口，搜索结果默‎认按照评分‎（Ratin‎g）排序，点击其中任‎一个搜索结‎果，可以在“引物窗口”中，显示出该引‎物的综合情‎况，包括上游引‎物和下游引‎物的序列和‎位置，引物的各种‎信息等。

④对于引物的‎序列，可以简单查‎看一下，避免出现下‎列情况：3’不要出现连‎续的3个碱‎基相连的情‎况，比如GGG‎或CCC，否则容易引‎起错配。

此窗口中需‎要着重查看‎的包括：Tm应该在‎55～70度之间‎，GC％应该在45‎％～55％间，上游引物和‎下游引物的‎T m值最好‎不要相差太‎多，大概在2度‎以下较好。

该窗口的最‎下面列出了‎两条引物的‎二级结构信‎息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉‎二聚体和错‎误引发位置‎。

引物查询方法
一共有两种查询引物的方法，包括primerbank和primer3，当我们查到引物时，我们需要用Pubmed来验证。

详细说明见下文。

1.Primerbank
用引物银行查询引物时，我们只需要输入引物的名称，种属
网址：/primerbank/
2.primer 3
使用这个工具之前您需要在Pubmed 中查到您的目的基因的序列，然后黏贴到primer3中，软件便会自动设计引物。

Pumed
Primer3
网址：
http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
完成引物的设计后，我们可以用pubmedblast 来验证引物
Blast
网址：/Blast.cgi 输入网址会显示以下页面，按照以下步骤便可验证
大概就是这样，不足之处还望大家给予建议和谅解精品文档，你值得期待。

一步一步教你使用NCBI查找DNA、mRNA、cDNA教学资料

一步一步教你使用N C B I查找D N A、m R N A、c D N A一步一步教你使用 NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、...最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对……，这些问题在 NCBI 上都可以方便的找到答案。

现在我就结合我自己使用 NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下 BCBI 的使用。

希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！我分以下几个部分说一下 NCBI 的使用：Part one 如何查找基因序列、mRNA、PromoterPart two 如何查找连续的 mRNA、cDNA、蛋白序列Part three 运用 STS 查找已经公布的引物序列Part four 如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。

关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充First of all，还是让我们从查找基因序列开始。

第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）下面以人的 IL6（白细胞介素 6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Map viewer 页面，网址为：/mapview/index.html在 search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。

操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。

2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。

ncbi使用指导

ncbi使用指导摘要：一、NCBI 简介1.NCBI 的定义和作用2.NCBI 的主要数据库二、NCBI 数据库使用方法1.基因数据库查询2.蛋白质数据库查询3.核酸序列数据库查询4.文献数据库查询三、NCBI 工具使用方法1.BLAST 工具2.ClustalW 工具3.Primer-BLAST 工具四、NCBI 的高级功能1.基因变异数据库查询2.基因表达数据库查询3.基因组数据库查询正文：一、NCBI 简介CBI（National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心）是一个提供生物科学和生物医学研究的公共资源网站。

它包含了大量的生物学和医学信息，为科研工作者提供了便捷的生物信息学资源。

NCBI 的主要数据库包括基因数据库、蛋白质数据库、核酸序列数据库和文献数据库等。

二、NCBI 数据库使用方法1.基因数据库查询基因数据库（Gene Database）是NCBI 的核心数据库之一，包含了大量已知的基因信息。

用户可以通过基因名称、序列标签、转录因子结合位点等信息进行查询。

查询结果包括基因的详细信息、基因序列、表达数据等。

2.蛋白质数据库查询蛋白质数据库（Protein Database）包含了大量已知的蛋白质信息，包括蛋白质序列、功能域、结构域等。

用户可以通过蛋白质名称、序列、功能等信息进行查询。

查询结果包括蛋白质的详细信息、序列、结构等。

3.核酸序列数据库查询核酸序列数据库（Nucleotide Database）包含了大量已知的核酸序列信息，包括基因组序列、cDNA 序列等。

用户可以通过序列名称、物种等信息进行查询。

查询结果包括核酸序列的详细信息、序列等。

4.文献数据库查询文献数据库（PubMed Database）是生物医学领域的文献摘要数据库，收录了大量的生物学和医学文献。

用户可以通过关键词、作者、杂志等信息进行查询。

查询结果包括文献的详细信息、摘要等。

blast引物设计流程

blast引物设计流程BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 引物设计是分子生物学研究中一个非常重要的步骤。

它用于通过比对已知的DNA或RNA序列来选择特定区域的引物，以进行PCR（聚合酶链式反应）、RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链式反应）和荧光原位杂交等实验技术。

在本文中，我们将详细介绍设计BLAST 引物的流程。

1.收集目标序列数据：首先，我们需要收集目标序列的数据。

目标序列可以是基因序列、mRNA序列或其他DNA/RNA序列。

这些数据可以从公共数据库（如GenBank）或实验室内部的数据库获得。

2.确定引物长度：下一步是确定引物的长度。

通常，引物的长度在18到25个碱基对之间，相对长度和GC含量对于PCR引物尤为重要。

3.构建BLAST数据库：在设计引物之前，我们需要构建一个BLAST数据库。

选择适当的引物长度和需要比对的目标序列，将这些序列导入数据库中。

BLAST数据库可以通过使用NCBI（National Center for Biotechnology Information）或其他Bioinformatics软件来构建。

4.查询引物序列：使用BLAST软件，将具有已收集的目标序列信息的引物序列输入到BLAST数据库中。

BLAST会在数据库中寻找与引物序列相似的序列。

基于比对结果，可以评估引物的特异性和亲合性。

5.分析BLAST结果：根据BLAST比对的结果，需要对引物进行评估和筛选。

主要考虑以下几个方面：-特异性:引物应该与目标序列非常特异性地结合，而不会与其他非靶DNA或RNA结合。

特异性可以通过比对结果中的E值（期望值）和匹配长度来评估。

-互补性:引物应与目标序列互补，以便正确结合并形成PCR产物。

通过比对结果来评估引物序列与目标序列的互补性。

- 引物结构: 引物应具有适当的物理参数，如长度、GC含量和熔解温度等。

这些特征可以使用Bioinformatics工具来评估和优化。

已知引物序列查基因序列

已知引物序列查基因序列引言在生物学研究中，了解基因序列是非常重要的。

基因序列是指组成生物体遗传信息的DNA或RNA的排列顺序。

通过了解基因序列，我们可以深入了解生物体的遗传特征、功能和进化关系等。

在实验室中，我们常常需要查找某个特定基因的序列。

这时候，已知引物序列可以帮助我们快速准确地找到目标基因。

本文将介绍已知引物序列如何查找基因序列的方法和步骤，并提供一些相关资源和工具供参考。

查找基因序列的方法和步骤1. 获取引物信息首先，我们需要获取已知引物的信息。

引物是一段能够与目标基因特异性结合的DNA或RNA片段。

通常，引物由两个部分组成：前向引物和反向引物。

前向引物是与目标基因链上一个特定位置相对应的DNA或RNA片段，而反向引物是与目标基因链上另一个特定位置相对应的DNA或RNA片段。

获取引物信息可以通过多种途径，包括文献检索、数据库查询等。

在选择引物时，需要考虑以下几个方面：•引物长度：通常，引物长度在18到30个碱基对之间。

•引物特异性：引物应该与目标基因序列特异性结合，避免与其他基因序列产生非特异性杂交。

•引物的GC含量：引物的GC含量应在40%到60%之间。

2. 数据库查询一旦获得引物信息，我们可以使用各种数据库进行基因序列的查询。

以下是一些常用的数据库：•NCBI（National Center for Biotechnology Information）：提供了多种生物信息学工具和数据库，包括GenBank、RefSeq等。

•Ensembl：提供了多种生物信息学工具和数据库，包括基因组浏览器、基因注释等。

•UCSC Genome Browser：提供了多种生物信息学工具和数据库，包括基因组浏览器、比较基因组等。

这些数据库都提供了在线查询功能，可以根据引物序列进行搜索并获取目标基因的序列信息。

3. 引物设计和验证在获得目标基因序列后，我们需要设计和验证引物的特异性和效果。

以下是一些常见的方法：•BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）分析：使用BLAST工具将已知引物序列与目标基因序列进行比对，评估其特异性和效果。