感染性疾病实验室诊断技术及其研究进展_龙海燕

DOI ：10.7507/1002-0179.20150280作者简介：龙海燕（1989－），女，重庆人，在读硕士，E m a i l ：longhaiyan1989@ 通讯作者：冯萍，Email: fengp_62@ 网络出版时间：2015-05-14 15:16网络出版地址：/kcms/detail/51.1356.R.20150514.1516.022.html

感染性疾病实验室诊断技术及其研究进展

龙海燕，冯萍

四川大学华西医院感染性疾病中心（成都 610041）

【摘要】 目前全球感染性疾病现状严峻，应用于感染性疾病诊断的实验室技术种类繁多，为了解感染性疾病实验室诊断技术及其最新进展，帮助临床工作者早期、快速、准确地诊断感染性疾病，降低感染性疾病暴发的危险性，及时启动感染性疾病的正确治疗等，现从病原学检测、免疫学技术、分子生物学技术、生物传感器、流式细胞术这几个方面对感染性疾病诊断技术进行综述。

【关键词】 感染性疾病；免疫学；分子生物学；生物传感器；流式细胞术

目前全球感染性疾病现状严峻，很多经典疾病卷土重来或出现了新特点，如新变异型克-雅病、重症急性呼吸综合征（SARS ）、新型冠状病毒感染、H7N9禽流感等。以前从未认识到的感染性疾病正在持续不断出现，包括人类免疫缺陷病毒（HIV ）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、霍乱弧菌和登革热病毒所致疾病等[1]。从不断新发和再发的感染性疾病中可以看出，感染性疾病仍然给人类的生存带来了巨大的挑战，因此对感染性疾病的诊断技术提出了更高的要求。本文就现有的感染性疾病实验室诊断技术和最新研究进展进行综述，为临床工作者对感染性疾病的诊治 提供参考。

1　病原学检测

传统的病原微生 物实验室诊断技术以分离、培养、染色、生物化学鉴定为主，目前仍是许多病原体检测的“金标准”。传统人工病原学检测方法操作复杂、检测周期长（2～5 d ），干扰因素多，敏感性与特异性也有限。为了缩短传统细菌“鉴定”时间，微生物鉴定自动化技术也应运而生，如V i tek 系统、Mi c roScan 系统、Phoenix 系统、Mini API 系统等。自动化微生物鉴定系统是根据微生物代谢特点，如细菌分解底物后反应液中pH 值的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌，鉴定时间约15～24 h 。Crowley 等[2]采用Vitek2自动化微生物鉴定系统和

Vitek2革兰染色阴性鉴定识别卡对707例G −菌株进行鉴定，准确率98%，10 h 内可以出结果。此类鉴定系统大大缩短了检测时间，降低了劳动强度，为疾病的确诊争取了宝贵时间。

2　免疫学检测

免疫学技术是通过检测病原微生物的抗原或抗体来进行快速鉴定的技术。该方法简化了病原微生物的鉴定步骤，因此广泛应用于临床。感染性疾病传统的免疫学技术包括凝集反应、沉淀反应、中和反应等，如临床上常用的肥达反应、免疫固定电泳、抗链球菌溶血素O 试验等。近二十几年来，免疫学分析方法 发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，灵敏度和特异度显著提高。目前常用的标志物有放射性同位素、酶、荧光素、电子致密物、化学发光物质、DNA 等。

放射免疫沉淀实验是敏感性很高的免疫标记技术，精确度高且易标准化和自动化，但由于放射性同位素有一定的危害性，其临床应用受到一定限制。酶联免疫吸附试验（ELISA ）是目前免疫酶技术中应用最广泛的，由此发展出了阵列-ELISA （array-ELISA ），同时具备简便、高通量、快捷等特点[3]。时间 分辨荧光免疫分析及上转换发光免疫分析技术拥有灵敏度高、示踪物稳定、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染、多标记等优点[4-6]。胶体金免疫层析技术操作简单、成本低、结果判读直观快速，虽然只能定性，但可用于基层单位，可进行现场诊断或大规模检测等[7]。免疫-聚合酶链反应（PCR ）是1992年Sano 等[8]建立的一种检测微量蛋白的免疫标记技术。它是用一段已知的DNA 分子来标记特定的检测抗体作为探针，然后用此探针与待检抗原结合反应，再通过

PCR 方法扩增吸附在抗原抗体复合物上的这段标记

・综述・

DNA分子，结合特异性PCR产物的有无，判断待检抗原是否存在。免疫PCR及其拓展技术如纳米金免疫PCR、噬菌体展示技术介导的实时免疫PCR等极大地提高了灵敏度，特别适合微量抗原和抗体的检测[9-10]。

3　分子生物学技术

3.1　核酸的序列分析技术

每一种生物都有它特定的核酸序列，因此核酸序列分析可以对微生物进行准确分类鉴定，并逐渐成为细菌鉴定、分类的“金标准”。焦磷酸测序技术是一种新型酶联级联测序技术，是在DNA聚合酶、腺苷三磷酸硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个脱氧核糖核苷三磷酸的聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的，主要是对已知短序列的DNA片段测序分析。目前焦磷酸测序技术在临床常用于多重耐药结核分枝杆菌耐药性检测，它不需要荧光标记的引物或核酸探针，也无需进行电泳，具有快速、灵敏度高、自动化、高通量等优点，因此值得临床推广应用[11-13]。

3.2　核酸杂交技术

核酸杂交技术是基于DNA分子碱基互补配对原理，利用核酸变性和复性的性质，使特异性的核酸探针与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。它可直接检测出临床中的病原菌的特异基因，而不受非致病菌的影响。核酸分子杂交可分为液相杂交、固相杂交、原位杂交3类。固相杂交包括Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、斑点或狭缝杂交、菌落杂交。利用荧光标记的DNA或RNA分子作为探针与组织或细胞中的核酸进行杂交而发展出的荧光原位杂交（FISH）技术主要用于肿瘤或产前诊断方面，近年来也开始用于病原微生物的检测。Frickmann等[14]使用FISH技术对448份临床分离的沙门菌进行检测，认为它是一种可靠、快速、灵敏度高、便宜、简单的检测手段，特别适合那些资源有限，高新技术无法施展的地区。

3.3　核酸扩增技术

该技术通过对待测病原体目标DNA片段的体外扩增，然后对产物进行分析，从而得以鉴定那些未知病原体、生长缓慢或难以培养的已知病原体、以及对形态生物化学反应不典型，甚至死亡的病原微生物。现有核酸扩增技术根据其特点可分为2类：一类是靶核酸的直接扩增，如PCR、核酸依赖的扩增技术（NASBA）、环介导等温扩增技术（LAMP）；另一类是信号放大扩增，如支链DNA（bDNA）。滚环扩增两者均有。

3.3.1　PCR　PCR是一种模拟天然DNA复制的体外扩增技术，应用这种技术可在数小时内将目标DNA片段扩增百万倍。因标本用量少、耗时短，直接针对微生物特异DNA片段、灵敏度高等特点而受青睐。在此基础上衍生出的新技术也不断应用于临床，如特异性和准确性显著提高的巢式PCR，高灵敏度、高特异性的实时荧光定量PCR，高效性、高通量、经济简便的多重PCR等。师永霞等[15]研究发现巢式PCR法在疟疾的初步检测和虫种鉴定中有利于提高疟疾的检出率和准确性。Deshpande等[16]等用Meta分析发现使用实时荧光PCR检测艰难梭菌与传统的细菌培养和细胞毒性实验相比其平均灵敏度和特异度分别为90%、96%和89%、97%。Persson等[17]使用多重PCR检测艰难梭菌的致病相关基因tcdA、tcdB、ctdA、cdtB和tcdC，发现其对027核酸型有很高的特异度，并且能检测其他艰难梭菌临床类型，对流行病学也有重要意义。PCR已成为分子生物学技术的核心和基础，为感染性疾病的诊断作出了巨大贡献。

3.3.2　NASBA　该技术是利用3种酶（逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶）及1对寡聚核苷酸引物在体外特异地对单链RNA进行恒温扩增的技术。Mohammadi-Yeganeh等[18]用多重实时NASBA 技术对HIV-1和丙型肝炎病毒进行检测，临床检测灵敏度达98%，特异度达100%。王立朋等[19]用NASBA检测曲霉菌，该方法灵敏度可达到1个孢子，认为因其灵敏度高、特异性强等特点，有望成为曲霉菌感染的临床诊断方法。依赖核酸扩增技术不需温度循环，循环次数少，测定范围大，几乎可以对所有生物样品进行检测，比普通PCR检测用时更短，灵敏度更高。

3.3.3　LAMP　LAMP是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件（63 ℃左右）保温30～60 min，即可完成核酸扩增反应。Wu等[20]运用LAMP技术对49例SARS 患者的样品进行了回顾性研究，发现比传统的实时荧光定量PCR灵敏度提升了10～100倍，可最低检测到0.01～10个空斑形成单位。Lalande等[21]以产毒株培养为金标准，用LAMP检测艰难梭菌发现灵敏度和特异度分别可达91.8%和99.1%，且可1 h 内出结果。LAMP灵敏度高，不需要特殊仪器，仅用水浴锅或恒温箱即可，可实时监测反应的结果，解决了PCR需要特殊仪器、变温处理等问题。