生物医学电镜技术与细胞及组织超微结构总论
电镜--细胞的超微结构及功能
光学显微镜和电子显微镜的比较
光学显微镜 1. 可用以研究活的和无生命 的物质，对研究组织和完 整的细胞特别有用 2. 放大倍数：1000倍 3. 测量限度：大约0.2μm 4. 通常将细胞杀死，用染料 染色，以便于清楚地观察 特殊的成分 5. 光线穿过物体（或从物体 反射），经玻璃透镜放大 和聚焦，在眼睛的视网膜 上或在照相底片上产生影 象 电子显微镜 1. 用于研究死的、干的切成 非常薄片的细胞，利于研 究细胞器 2. 放大倍数：数10万倍 3. 测量限度：大约1nm 4. 细胞常用电子致密的重金 属盐染色，使细胞成分易 于看到和照相 5. 电子束通过物体，经磁透 镜放大和聚焦到荧光屏或 照相底片上，由于电子不 易穿透物质，因此，物体 必须非常薄（大约100 nm 以下）
质膜不对称性的生理意义
使膜的两层流动性有所不同，有助于维持 蛋白质的极性； 生物膜结构上的不对称性，保证了膜功能 的方向性；
– 有的功能只能发生在膜的外侧，如许多激素受 体是接受细胞外信号的结构； – 有的功能只能发生在膜的内侧，如调节细胞内 外Na+、K+浓度的Na+-K+ATP酶，其运转时所 需的ATP是细胞内产生的。
TEM
x436,740
二、质膜的化学组成
化学组成主要是脂类、 蛋白质和糖类。
–脂类常排列成双分子层， 蛋白质通过非共价键与 其结合，构成膜的主体， 糖类通过共价键与膜的 某些脂类或蛋白质组成 糖脂或脂蛋白。 –脂类30-80%；
–蛋白质20-70%
–糖类2-10%
质膜的化学组成（续）
膜脂以磷脂和胆固醇为主，并含糖脂。
细胞学术语
细胞质（cytoplasm）：质膜与核被膜之间 的原生质。 细胞器(organelle)：具有特定形态和功能 的显微或亚显微结构称为细胞器。 细胞质基质（cytoplasmic matrix）：细 胞质中除细胞器以外的部分。又称为或胞 质溶胶（cytosol），其体积约占细胞质的一 半。
电镜--细胞的超微结构及功能
结构：
由基体和鞭杆两部分构成。 中轴是由多束平行的微管形成的轴丝。 鞭杆中的微管为9+2结构。 基体的微管组成为9+0。
Cilia from an epithelial cell in cross section (TEM x199,500)
鞭毛和纤毛的超微结构示意图
细胞学术语
细胞质（cytoplasm）：质膜与核被膜之间 的原生质。 细胞器(organelle)：具有特定形态和功能 的显微或亚显微结构称为细胞器。 细胞质基质（cytoplasmic matrix）：细 胞质中除细胞器以外的部分。又称为或胞 质溶胶（cytosol），其体积约占细胞质的一 半。
染色体
细胞器 核糖体
内膜系统
细胞骨架 转录与翻译 细胞分裂
简单
无 出现在同一时间与地点 无丝分裂
复杂
微管、微丝、中间纤维等 时空上是分开的 有丝分裂和减数分裂
第二章
质膜及其表面结构
质膜（plasma membrane）
包在细胞外面的质膜又称细胞膜，围绕 各种细胞器的膜称为细胞内膜。
细胞膜和内膜在起源、结构和化学组成的等方 面具有相似性，故总称为生物膜（biomembrane）。 生物膜是细胞进行生命活动的重要物质基础。
七、质膜的特化结构
质膜常带有许多特化的附属结构，如：微 绒毛、褶皱、纤毛、鞭毛等等。 这些特化结构在细胞执行特定功能方面具 有重要作用。由于其结构细微，多数只能 在电镜下观察到。
质膜的特化结构
A
B
C
D
E
F
G
A 由糖蛋白组成的糖萼； B 微绒毛； C 胞饮作用的通道及小泡； D 皱褶； E 尖形变形虫； F 圆形变形虫； G 内褶
细胞超微结构及电子显微镜技术
细胞超微结构及电子显微镜技术第一章绪论第二章电镜的工作原理及基本结构第三章标本制备方法第四章细胞超微结构及基本病变第五章肿瘤超微结构第一章绪论细胞超微结构是细胞生物学研究的一个组成部分,研究手段是采用电子显微镜技术观察细胞、亚细胞形态结构及其变化规律超微病理学--从细胞、亚细胞的形态结构上阐明疾病的发生、发展及转归规律,从而形成了超微结构病理学(ultrastructural pathology)，简称超微病理学。
发展Giovanni Morgagni 1682-1771 器官病理学Rudolf Virchow 1821-1902 组织病理学Purkinje 1830 切片机Theodor Klebs 1869 石蜡包埋切片Ernst Abbe 1855 光学显微镜20世纪60年代超微病理学/分子病理学德国,M Knoll E Z Ruska 1932 电子显微镜20世纪70年代免疫组织化学20世纪80年代原位杂交病理生物学20世纪90年代PCR技术历史1673-1617年间荷兰Anton van Leeuwenhocklight microscope 细菌肌肉神经血细胞及精子其他结构18世纪纤维解剖镜---光学纤维镜任何显微镜在工作时都需要照明普通光学显微镜所用照明光源或自然光或为灯光—可见光电子显微镜工作时所用光源为电子射束—肉眼不能直接观察的不可见光两类不同显微镜工作原理的根本区别一、超微病理学在疾病研究中的作用有些疾病的病理变化特征并不仅表现于组织水平，而且还表现在细胞及亚细胞水平病因发病机制对细胞内各种细胞器的结构和功能有了深刻的认识超微病理学在疾病研究中的作用广义不仅限于细胞器水平，同时还应涵盖分子水平的内容，既分子病理。
一般意义主要指亚细胞病理学既细胞器病理学。
病因学及发病学美国Blumberg—澳抗—EM----HBsAg Dane颗粒– HBsAg的载体细胞凋亡与肿瘤发生AIDS-HIV细胞器的结构与功能沉积病storage diseaseHBV大球形颗粒(Dane颗粒) 直径42nm小球形颗粒直径22nm管形颗粒直径22nm, 长100-700nm均具有HBsAg的抗原性二、超微病理学在疾病诊断中的作用对横纹肌肉瘤的诊断对黑色素瘤的诊断对内分泌肿瘤的诊断“胺前体摄取和脱羧系统”(amine precursor uptake and decarboxylation system，APUDsystem)。
电镜--细胞的超微结构及功能
线粒体的半自主性
60年代，线粒体基质中分离出DNA (mtDNA)➙具有 独立的遗传体系； 虽能合成蛋白质，但翻译体系都是由核基因编码， 在细胞质中合成后，再定向转运到线粒体； 线粒体的转录和翻译过程完全依赖于细胞核的遗传 装置，即线粒体的半自主性。
细胞色素氧化酶（3）、细胞色素bc1复合体（1）、 ATP酶（4）、核糖体小亚单位（1）。
中间纤维的结构
第七章 病毒的超微结构
病毒是一类非细胞形态的介于生命与非生 命形式之间的物质。 主要特征：
– 个体微小，必须用电镜才能看见； – 仅具有一种类型的核酸，或DNA或RNA，没有 含两种核酸的病毒； – 专营细胞内寄生生活； – 具有受体连结蛋白，与敏感细胞表面的病毒受 体连结，进而感染细胞。
线粒体的超微结构（2）
内膜 （inner membrane）：
– 含100种以上的多肽；
–通透性很低，仅允许不带电荷的小分子物质通 过，大分子和离子需要特殊的转运系统；
–氧化磷酸化的电子传递链位于内膜； –内膜向线粒体基质褶入形成嵴（cristae），扩 大内膜表面积（达5-10倍）；
– 标志酶为细胞色素C氧化酶。
7.流感病毒（丝状有被膜）
谢 谢！
1.病毒的结构
10-30nm之间。 结构简单，由核酸（DNA或RNA）芯和蛋白 质衣壳（capsid）所构成。 衣壳有保护病毒核酸不受酶消化的作用。
核酸和蛋白质的装配形式：
– 二十面体对称 – 螺旋对称 – 复合对称
2.脊髓灰质炎病毒
3.烟草花叶病毒
4.疱疹性口炎病毒
5.人类天花病毒
6.T4噬菌体
微管组织中心：
– 微管进行组装的区域； – 着丝粒、中心体、基体等。
电镜技术与细胞超微结构_三个实验报告
实验一载网的认识和样品支持膜的制备一、载网的认识识别铜网的正反面：正面光滑较亮；反面较粗糙，边框较亮，中间较暗。
二、福尔莫瓦支持膜的制备1．在水槽内盛满蒸馏水将已配好的福尔其瓦溶液倒入立式载玻缸或小烧杯中，另将若干新载玻片浸入装有0.02％中性皂液的载玻缸中。
2．取一载玻片，用白绸布擦净，使之光洁，然后手持载玻片一端，插入福尔莫瓦溶液中，再垂直匀速取出，在空气中稍晾片刻，使其形成一层膜。
用刀片在膜的四周各划一条刻痕，对膜哈气后，将载玻片有膜一端成45度角或垂直慢慢压入水中，使膜缓缓地被剥离并漂浮在水面上，取出裁玻片。
3.根据Formvar膜在水面上呈现的干涉色检查膜的厚度，选取厚度均匀的银灰色的膜。
淡黄色的较厚，浅红色的更厚都不能用。
颜色不均匀、有皱纹和尘埃或破损的不能用，弃去。
4. 将清洁的铜网排列在膜上，然后剪取一块比膜的面积稍大的滤纸片与有铜网的膜贴附，随着滤纸的吸湿逐步与膜、铜网阽附好后，边提边向上翻转离开水面，放置在有滤纸的平皿中，干燥后放于干燥器中保存备用。
实验二透射电镜生物样品的制备一、取材：（1）动物样品：用乙醚麻醉小白鼠进行活体解剖，取出所需组织器官放在预冷的载玻片上，立即滴加预冷的3%戊二醛固定液。
用锋利的刀片将组织先切成宽1mm，长3~4mm的小条，再切成1mm3的标准小块（肌肉组织应该保持截面积为1mm2的长条状），用牙签拨入盛有冷的3%戊二醛固定液的小瓶中。
（2）植物样品：从植株上取下试样立即放在预冷的载玻片上，并滴上数滴预冷的3%戊二醛固定液，用锋利刀片切取1mm宽，3~4mm长的小条，然后用牙签轻轻地拨入盛有冷的3%戊二醛固定液的小瓶中（小瓶置于冰盘中以保持0~4℃）, 叶片需盖紧瓶塞后用注射器或置于真空干燥器中抽气，直至样品沉落瓶底。
二、前固定：更换新鲜的3%戊二醛固定液，固定2～5小时或过夜，在0~4℃进行。
三、漂洗：用吸管吸出戊二醛固定液，加入0.1M的磷酸缓冲液漂洗三次，每次15~20分钟。
细胞超微结构与电镜技术：扫描电子显微镜
16
core 电子探针与样品的交互作用
•一束细聚焦的电子束轰 击样品表面时，入射电子 与样品的原子核和核外电 子将产生弹性或非弹性散 射作用，并激发出反映样 品形貌、结构和组成的各 种信息，如：二次电子、 背散射电子、阴极发光、 特征X 射线、俄歇过程和 俄歇电子、吸收电子、透 射电子等。
2020年10月
6
core
2020年10月
7
core
扫描电镜的特点
2020年10月
8
core 观察表面形貌，富于立体感
• 电子束冲击样品，利用从样品表面发射的二次电 子成像，这样所观察的就不是样品的内部结构， 而是表面的特征。
2020年10月
9
core
景深长，立体感强
•“景深”是用以表达纵深方向层次细节程度的度 量，数值不固定，与放大倍数和分辨率有关。扫 描电镜景深大，图像立体感强。扫描电镜的景深 比光学显微镜大几百倍，比透射电镜大十倍左右 ，并且可不受样品大小和厚度的限制。
• 离子溅射法 真空镀膜法
• 扫描电镜观察
23
几种常见生物扫描电镜样品的取样准备
core
• 组织样本
• 血管腔、肺泡腔等，需将材料进行简单切割，保证腔面表面不受破坏 。样品基底部尽量切割平整，便于样品粘台
• 含水量少的样品
• 花粉、药粉：干燥后，均匀地粘贴在样品台上，直接喷金观察
• 头发、果壳：表面清洗干净，烘干，粘贴、喷金、观察
扫描电镜样品制作步骤
core
• 取材：样品（如血细胞、组织）面积小于样品台，样品编号。
• 清洗：清除样品表面的黏液、油脂、蜡质、杂质等
• 蒸馏水；超声波；蛋白水解酶；磷酸缓冲液、生理盐水；脂溶 剂；（不损伤样品表面细节）
电镜--细胞的超微结构及功能
微管的功能
支架作用：确定膜性细胞器的位置； 细胞内运输： – 驱动蛋白（kinesin） – 动力蛋白（dyenin），两者均需ATP提供能 量。 形成纺锤体：细胞分裂中牵引染色体到达分裂 极。 形成一些特殊结构，如轴突、纤毛、鞭毛等。
（三）中间纤维(intermediate filament)
• A带（暗带）：粗肌丝。
• H区：A带中央色浅部份，此处只有粗肌丝。 • I带（明带）：只含细肌丝。 • Z线：I带中央有一色深的线，每一细肌丝一端游离， 一端附于Z在线。
（二）微管（microtubule）
管状结构，直径22~25nm； 微管蛋白二聚体➙原纤维； 13 条原纤维形成微管。
– 微管蛋白二聚体由结构相似的α和β球蛋白构成。
线粒体的半自主性
60年代，线粒体基质中分离出DNA (mtDNA)➙具有 独立的遗传体系； 虽能合成蛋白质，但翻译体系都是由核基因编码， 在细胞质中合成后，再定向转运到线粒体； 线粒体的转录和翻译过程完全依赖于细胞核的遗传 装置，即线粒体的半自主性。
细胞色素氧化酶（3）、细胞色素bc1复合体（1）、 ATP酶（4）、核糖体小亚单位（1）。
直径10nm左右，介于微丝和微管之间。 最稳定的细胞骨架成分。 使细胞具有张力和抗剪切力，起支撑作用。 中间丝可分为五种，各由不同蛋白质构成。
角蛋白、结蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、 波形纤维蛋白、神经纤丝蛋白 • 具有组织特异性，不同类型细胞含有不同IF。
• 细胞中通常含有一种中间纤维，少数细胞含有2种以上。 • 肿瘤细胞转移后仍保留源细胞的IF。
线粒体的超微结构（2）
内膜 （inner membrane）：
– 含100种以上的多肽；
–通透性很低，仅允许不带电荷的小分子物质通 过，大分子和离子需要特殊的转运系统；
电子显微镜在细胞超微结构研究中的应用
电子显微镜在细胞超微结构研究中的应用细胞是生物体的基本结构单位，其超微结构的研究对于了解生命活动的机制和疾病的发生与发展具有重要的意义。
电子显微镜是细胞学研究中最常用的高分辨率成像技术之一，其应用范围广泛，可以用于观察细胞的超微结构、病原菌、病毒等微生物的结构及其与宿主细胞的相互作用等。
本文将详细介绍电子显微镜在细胞超微结构研究中的应用。
一、电子显微镜技术原理电子显微镜可以使用电磁透镜对电子束进行聚焦，使其成为具有高能量和高分辨率的电子束，然后将电子束照射到样品上，得到被电子束散射的电子图像。
通过摄影和数字成像等技术，电子显微镜可以获得高分辨率的图像。
相比于传统光学显微镜，电子显微镜具有更高的分辨率和更强的穿透能力，能够观察到更小的细胞结构。
二、1. 细胞质骨架的观察细胞质骨架是细胞内重要的结构，由微小管、中间丝和微丝网络组成。
通过电子显微镜观察，可以清晰地看到细胞质骨架的微观结构，例如中间丝有明显的条纹结构和肌动蛋白纤维的排列方式等。
2. 细胞器的观察电子显微镜还可以观察到细胞器的内部结构，如线粒体、内质网和高尔基体等。
通过电子显微镜图像可以清晰地看到线粒体内部的膜结构和内质网上的网状结构等。
3. 原核细胞的研究电子显微镜可以观察到细菌、蓝藻和古细菌等原核生物的结构。
这些微生物的大小相对较小，光学显微镜难以观察到其内部结构。
而电子显微镜可以清晰地看到这些微生物的超微结构，例如细菌的菌体、细胞质和外壳等。
4. 细胞分子的研究除了观察细胞的超微结构，电子显微镜还可以用于观察细胞分子的结构，例如病毒、酶和蛋白质等。
通过电子显微镜图像可以得到这些分子的三维结构和空间分布，为分子生物学研究提供了重要的手段。
三、电子显微镜的局限性和未来发展方向虽然电子显微镜具有高分辨率和强穿透能力，但其存在设备成本高、样品制备难度大、操作要求高等问题。
此外，电子显微镜不能观察到细胞的动态过程，无法提供关于细胞功能及其调控机制的信息。
生物电镜与超微细胞化学
光镜利用样品对光的吸收来形成明暗反差和颜色变化成像，而电镜利用样品对电子的散射和透射来形成明暗反差成像，扫描探针显微镜利用探针与样品表面的相互作用来形成相关信号而成像。
按电子束和样品相互作用方式划分，电镜包括TEM(收集透射电子成像)和SEM（收集从样品表面反射出的电子即次级电子成像），以及扫描透射电镜STEM。
超微细胞化学：细胞中无机及有机物质的定性，定量和定位。
其特点是把细胞超微结构与其原位发生的生化反应有机地结合起来进行研究，以揭示细胞的超微结构和其功能的内在联系。
分辨率：仪器能分辨出的相邻两个质点的最小距离。
肉眼0.2mm；光镜0.2um；电镜0.2nm（透射电镜极限分辨本领晶格为1.4埃，点分辨本领为3埃。
比光镜提高1000倍）。
D/o.=0.612入/n sin a ,D分辨率，入光波长，n介质折射率，a物镜镜口角/入射孔径角的一半。
有效放大倍数M有效=O肉眼/O仪器，超过M有效则图像模糊，称“空放大”。
用数值孔径N.A=n sina表示得出Abbe公式O=0.612入/N.A,则提高分辨率的办法为：增大数值孔径和减小波长。
折射系数香柏油n=1.51，入射孔径角大最为180o则O=0.61入/1.5=1/2 入亚显微结构/细微结构：介于细胞水平和分子水平之间的结构。
超微结构：严格讲指的是分子水平的结构，但往往将普通显微镜分辨界限以下的结构笼统称为超微结构。
电镜制样技术的发展：1.超薄切片:二维超微结构2.扫描电镜样品制备：立体感较强的表面超微结构3.冷冻蚀刻技术：生物膜的断裂面超微结构4.电镜细胞化学技术：细胞内化学成分的定性和定位5.免疫电镜技术：细胞内抗原或抗体的定性和定位6.电镜放射自显影技术：细胞内物质运输和大分子合成的动态过程研究7.负染色：病毒和生物大分子8.X-射线微区分析技术：细胞内多种元素第一章透射电镜TEM的原理结构第一节光学显微镜的分辨本领第二节电子波长第三节电子透镜1..电子V的分量中平行于电场H方向则匀速直线运动，垂直于电场H方向做匀速圆周运动，两种运动之和是电子在均匀磁场中的螺旋运动，运动轨迹为螺旋线。
《电镜技术与细胞超微结构》教学体会
《电镜技术与细胞超微结构》教学体会唐莹【摘要】形态学知识是医学生医学学习的必备知识，而电镜技术是研究细胞组织不可取代的方法。
本文以我校研究生课程《电镜技术与细胞超微结构》课程为例，从四个方面阐述该课程的教学体会。
%The morphology is the basic knowledge of medical postgraduate students, and electron microscopy has irreplaceable advantages in morphology and pathology research. This essay explained the teaching experience for the graduate course named “electron microscopy and ultrastructure of cell” in our school from four aspects.【期刊名称】《中国继续医学教育》【年(卷),期】2016(008)014【总页数】2页(P19-20)【关键词】超微病理学;形态学;电镜技术与细胞超微结构;研究生课程【作者】唐莹【作者单位】昆明医科大学电镜室，云南昆明 650051【正文语种】中文【中图分类】RG434电镜观察是形态学观察的第三个层次。
通过对电子显微镜性能的改进和工作状态的调整，特别是通过一系列生物制样技术的发展和提高，电镜观察不仅可以涉及组织水平、细胞水平和亚细胞水平，也可深入到分子水平，从而成为形态学观察发展的高级阶段和层次。
目前不仅有观察样品内部结构的透射电镜（TEM），观察样品表面的扫描电镜（SEM），还有多种用途的扫描透射电镜（STEM）和分析电镜（AEM）等等。
而针对不同的生物样品类型和观察要求，又有不同的生物样品制备技术。
以与透射电镜有关的生物样品制备技术为例，又有超薄切片技术、负染色技术、免疫电镜技术、复型技术等等。
电子显微镜技术在细胞超微结构研究中的应用
电子显微镜技术在细胞超微结构研究中的应用随着科技的不断进步，细胞超微结构的研究已经逐渐成为了细胞生物学研究中的一个重要领域。
而在这个领域中，电子显微镜技术已经成为了一个不可或缺的工具。
本文将探讨电子显微镜技术在细胞超微结构研究中的应用，并简单介绍一下这个技术的原理及其优势。
一、电子显微镜技术的原理及优势电子显微镜是一种能够直接观察细胞的超微结构的高分辨率显微镜。
与普通的光学显微镜相比，电子显微镜使用电子束而非光线来成像，因此它可以获得比光学显微镜更高的分辨率。
其分辨率通常可以达到纳米级别，甚至更小。
电子显微镜主要分为两种类型：透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）和扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）。
TEM主要用于观察薄样品，可以提供非常详细的细胞内部结构信息。
而SEM则主要用于观察表面结构和形态，可以提供表面特征的高分辨率图像。
相对于光学显微镜，电子显微镜技术具有以下几个优势：1. 高分辨率：电子显微镜的分辨率通常比光学显微镜高几倍甚至几十倍，因此可以更直观地观察细胞的超微结构。
2. 高对比度：电子显微镜所产生的图像对比度非常高，可以显示出很细微的结构差异。
3. 显微镜操控简单：电子显微镜的操作相对简单，只需要进行基本的调焦、对焦、调节亮度等常规操作即可。
4. 显微镜的应用范围广：透射电子显微镜（TEM）可以用于观察细胞内部结构，而扫描电子显微镜（SEM）则可以应用于对细胞表面结构和形态的观察。
二、电子显微镜技术已经成为了研究复杂的细胞超微结构的主要工具之一。
这个技术被广泛地应用在细胞生物学领域中，为研究细胞结构、功能以及生理和疾病的基本原理提供了极其重要的信息。
以下是一些电子显微镜在细胞超微结构研究中的应用：1. 线粒体超微结构的研究线粒体是细胞内能量代谢和呼吸的重要细胞器，其结构是非常复杂的。
细胞超微结构与电镜技术：绪论-电子显微镜与医学发展
Virchow(魏尔箫, 德国病理学家):1858年写成了“cellular pathology” “对疾病的认 识提高了300倍”
3.超微病理学(Ultrastucture pathology)
电镜问世 – 20世纪30年代
超薄切片技术 – 20世纪50年代
细胞超微结构与电镜技术
1. 绪论----- 电子显微镜与医学发展
1. 现代医学的发展简史 分3个阶段
新世纪 冷冻电子显微技术
现代分 子医学
中世纪以前 推测医学
1931年 电镜
20世纪 超微病理 分子病理
18世纪 细胞病理学
16-18世纪 器官病理学
1665年 光镜
1. 疾病研究发展简史
❖ 1. 器官病理学(organ pathology) 18世纪 Benivieni – 报道了15例典型的尸检病例
我国的透射电子显微镜研制始于20世纪50年代，1977年已作出了分辨率为3Å的80万倍的透射电镜 。
目前世界上生产透射电镜的主要是这三家电镜制造商： 日本的日本电子(JEOL)和日立(Hitachi)以及美国的FEI（这家公司把荷兰的菲利浦电镜公司收购了 ）。
第三阶段：从20世纪30年代到70年代，电子显微镜技术出现后，把细 胞学带入了第三大发展时期，这短短40年间不仅发现了细胞的各类超微 结构，而且也认识了细胞膜、线粒体、叶绿体等不同结构的功能，使细 胞 学 发 展 为 细 胞 生 物 学 。 De Robertis 等 人 1924 出 版 的 普 通 细 胞 学 （ General Cytology ） 在 1965 年 第 四 版 的 时 候 定 名 为 细 胞 生 物 学 （ Cell Biology），这是最早的细胞生物学教材之一。
电镜技术和细胞超微结构论文
电镜技术和细胞超微结构论文《电镜技术与细胞超微结构》这门课程要紧讲的是电镜技术，几种常见的电子显微镜及有关方面的知识熟悉，并讲解了运用电镜技术，在各类电子显微镜下观察细胞超微结构，研究细胞超微结构的有关知识。
在课程的学习中，我们也学习到了一些摄影方面的技术。
由于这是一门选修课程，因此我们对此方面的学习没有专门学习这方面的同学学习的深，我们只是学习了一些基本常识，本文要紧讲的就是我在这门课程的学习中得到一些知识。
关键字：电子显微镜、透射电镜、扫描电镜、电镜技术、细胞超微结构正文：电子显微镜，简称电镜，是根据电子光学原理，用电子束与电子透镜代替光束与光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。
电子显微镜由镜筒、真空装置与电源柜三部分构成。
镜筒要紧有电子源、电子透镜、样品架、荧光屏与探测器等部件，这些部件通常是自上而下地装配成一个柱体。
电子显微镜按结构与用途可分为透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜、反射式电子显微镜与发射式电子显微镜等。
透射式电子显微镜常用于观察那些用普通显微镜所不能分辨的细微物质结构；扫描式电子显微镜要紧用于观察固体表面的形貌，也能与X射线衍射仪或者电子能谱仪相结合，构成电子微探针，用于物质成分分析；发射式电子显微镜用于自发射电子表面的研究。
我们经常使用的是透射式电子显微镜与扫描式电子显微镜。
透射电镜是以电子束透过样品通过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或者照相底片上进行观察。
透射电镜是以电子束透过样品通过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或者照相底片上进行观察。
透射电镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。
由於电子易散射或者被物体汲取，故穿透力低，务必制备更薄的超薄切片。
扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示物体。
扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示物体。
细胞超微结构与电镜技术：透射电镜的原理和应用
9．正染色：由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等轻元素组成。这些元素原子对电子
的散射能力很弱，相互之间的差别也很小。尤其生物超薄切片被树脂所包埋，这些 包埋树脂对电子的散射能力与样品本身差别很小。因此生物样品超薄切片观察时像 的反差极弱。为了提高图像的反差，要对超薄切片进行电子染色。 这里所谓电子染色是根本不同于光学显微镜的染色，它是利用重金属盐（如铅盐、铀 盐等）与细胞的某些成分或结构结合，由于重金属对电子散射能力很强，使那些与其 结合的结构或成份对电子散射能力增强，从而达到提高样品本身反差的。目前最常用 的染色剂是醋酸铀和柠檬酸铅染色液。操作流程是： 超薄切片先柠檬酸铅染色10分钟，去二氧化碳的双蒸水清洗3次，再用醋酸铀染色30分 钟，双蒸水清洗3次，等超薄切片干燥后，即可上透射电镜观察。注意事项：①醋酸铀 具有放射性，使用时要特别注意。②柠檬酸铅染液极易和空气中的二氧化碳反应形成 不溶解的黑色颗粒，污染切片。柠檬酸铅染液一定要现用相配，所用的双蒸水一定要 煮沸除去二氧化碳。③由于染色不可控制因素较多，产生污染的几率有40％，所以每 个样品的切片一定要留出铜网作备份。
(2)作用 进行初步成像放大，改变物镜的工作电流，可以起到调节焦距的 作用。电镜操作面板上粗、细调焦旋扭，即为改变物镜工作电流之用。
为满足物镜的前述要求，不仅要将样品台设计在物镜内部，以缩短物镜焦 距；还要配置良好的冷却水管，以降低物镜电流的热飘移；此外，还装有提 高成像反差的可调活动光阑，及其要达到高分辨率的消像散器。对于高性能 的电子显微镜，都通过物镜装有以液氮为媒质的防污染冷阱，给样品降温。
2．漂洗：用1M PBS Buffer Ph 7.2冲洗3次，每次15mins。 3．后固定：加入1％锇酸处理到样品变黑。植物样品一般处理2.5hours，真菌、细菌 一般处理2hours，动物样品处理1hours。注意事项：①锇酸剧毒物质，易挥发，操作 时要在毒品柜中谨慎使用。②锇酸比较昂贵，需特别节约使用。 4．漂洗：用1M PBS Buffer Ph 7.2冲洗3次，每次15mins。 5．脱水：室温下，丙酮0％－50％－70％－80％－90％每级作用30mins， 纯丙酮在作 用3次，每次作用30mins。 6． 渗透：其目的是使包埋剂逐步渗入组织细胞内。植物样品需要的渗透梯度多、渗 透时间长。其他样品可以适当减少或缩短渗透梯度和时间。以 二叶龄水稻叶片为例，其渗透流程如下：无水丙酮/包埋剂＝5：1作用12hours→无水 丙酮/包埋剂＝3：1作用12hours→无水丙酮/包埋剂＝1：1作用12hours→无水丙酮/ 包埋剂＝1：3作用12hours→无水丙酮/包埋剂＝1：5 作用12hours→纯包埋剂作用45℃作用12hours。 注意事项：包埋剂为强致癌剂，特别要注意规范操作！
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2013-5-15
36
1、电镜酶细胞化学术(electron microscopic cytochemistry of enzyme or ultracytochemistry of enzyme)
基本原理及内容:
酶细胞化学术（enzyme cytochemistry）是利用酶催化反应特点，从 亚微结构上研究酶的分布和活性。按其催化反应的性质可分为水解酶、氧 化还原酶、转移酶、裂解酶、合成酶和异构酶六大类，应用较多的有水解 酶和氧化还原酶。现以水解酶为例，介绍此技术的主要过程和基本原理。 初级反应：底物被磷酸水解酶作用后分解产生磷酸。 底物 磷酸水解酶 H3PO4 最终反应：磷酸与金属捕捉剂结合形成反应产物。 H3PO4 捕捉剂（如Pb2+） Pb3(PO4)2↓ 反应产物为电子致密的沉淀物，电镜下易于观察并显示出酶的定位。 近年来常用铈（ Ce3+）作为捕捉剂。
2013-5-15
6
(三)、基本原理、构造及电镜的类型
电镜的基本构造及原理 ①、电子束主要特点： a、由电子组成，真空中直线前进，具波动 特性； b、电子束受电力和磁力作用； c、电子束照射样品时，能透过极薄样品， 得到透射电子，或产生二次电子，特征X射线， 背散射电子等。
2013-5-15 7
2013-5-15 4
2、反差：
被观察物与其背景在亮度（黑白对比度）上有所不同，这种差别称为反 差；透射电镜的反差主要由样品对电子的散射产生。
3、空放大
不能提供更为清晰的图像放大，称为无效放大，也称无效放大。
4、不同分辨率的形态研究
2013-5-15
5
5、亚微结构与超微结构的概念及关系
亚显微结构（submicroscopic structure）：
2013-5-15
37
2013-5-15
38
应用
一般说透射电镜已能分辨出超微结构和某些化学成份，如糖原颗粒、核 糖体、染色质和脂类等。电镜酶细胞化学则着重显示各超微结构的酶特别是 标志酶，研究细胞器的化学、功能及其动态变化，由于电镜方法的限制，迄 今所能显示的酶为数尚少。 酶细胞化学技术主要用于：（1）酶在超微结构上的定位，（2）标记和 鉴定某些细胞和细胞器，（3）通过显示过氧化物酶，定位示踪HRP,（4） 利用免疫酶技术，电镜下显示特异性标记物的定位。 目前应用电镜技术常显示的标志酶有： 各种细胞器的标志酶
2013-5-15
17
2013-5-15
18
扫描电镜的结构示意图：
2013-5-15
19
2013-5-15
20
2013-5-15
21
2013-5-15
22
2013-5-15
23
2013-5-15
24-15
26
(四)、细胞超微结构研究的展望
①、二维 三维，如三维重建技术； ②、从单纯的形态观察,深入到对其功能、代谢、 化学组成、分子结构及元素分布的研究。如X 线显微分析(electron probe x-ray microanalysis)； ③、定性描述 定量测定方向发展，如电镜 形态测量技术（morphometry）； ④、从经化学固定的结构向活细胞整体方向发展， 如超高压电镜技术的应用； ⑤、仪器设备向小型化方向发展。
WDS） II、能谱仪（energy-dispersive spectrometer ，EDS）
⑤、扫描探针显微镜(Scanning probe microscope,SPM): 原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)； 扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope,STM)。
2013-5-15
30
1、取材的基本原则： 快：1min 小：1mm3 利： 静： 冷：4℃ 取材部位要准确； 成批取材，部位一致、； 标本的编号和标签。
2013-5-15
31
2、固定：
①、几种常用的固定剂的理化特性和使用原则： a、四氧化锇（Osmium tetroxide，OsO4）； 又称锇酸，是电镜生物样品使用最广泛的固定剂，兼有电 子染色作用，可作单固定，一般不用于电镜细胞化学实验的固定。 对糖原和核酸的保护作用差。多用于后固定。 b、戊二醛（glutaraldehyde，C5H8O2）； 不能单独作为电镜样品固定液，对脂肪的保护作用差。没有 “电子染色”的作用，通常用于前固定。 c、甲醛（formaldehyde）。 电镜多用多聚甲醛，对酶活性保存好，可与戊二醛混合或单 独用于细胞化学灌流固定或作为前固定液。
2013-5-15 3
(二)、分辨率与形态研究的关系
1、分辨率（Resolution）
又称分辩本领（Resolving power），是将邻近两点清晰区分、辩认 的能力，用能被辨认的邻近两点的距离表示。
肉眼：在明视距离（25cm）时，为0.25mm； LM：可见光的平均波长为500nm，r=λ/2，LM的极限分辨率为
2013-5-15 9
③、超高压电镜（High Voltage Electron Microscope, HVEM）； 常规电镜加速电压一般在200KV以下，如果加速电压在 500KV以上，则称为HVEM。 特点:观察厚切片(0.5-3um)，提高分辨率。观察到原子 水平，期望观察生活标本（含水份） ④、分析电镜（ Electron Microscope Microanalyser， EMMA）； I、波谱仪（wavelength-dispersive spectrometer ，
生物医学电镜技术与细胞及 组织超微结构
Biomedical Electron Microscopy and Cell & Tissue Ultrastructure
重庆医科大学电子显微镜室
2013-5-15 1
绪
论
电子显微镜（Electron Microscope , EM) 简称电镜，它是用电子束代替可见光的显微 装置，一种高放大、高分辨的大型精密仪器。 目前电镜已广泛应用于医学、生物学、农业、 工业、军事等多个领域。 EM在光学显微镜 基础上使细胞学的概念更加完善，对疾病的 认识,特别是对发病机理的研究做出了巨大 贡献。
2013-5-15 28
电镜生物样品制备技术
样品制备是电镜技术中一个很重要的组成
部分，是电镜工作中最繁重的环节。要学习掌
握好细胞超微结构知识及应用电镜技术进行研
究工作，都必须首先了解电镜的标本制备技术，
故属于本课程的重点内容。
2013-5-15 29
（一）、超薄切片及其染色技术
超薄切片（ultrathin-section）制备过程示意图：
②、电镜的基本构造：以透射电镜 为例
2013-5-15
8
电镜的类型
①、透射式电子显微镜(Transmission Electron Microscope, TEM)；
最常用、最典型，主要用于观察超薄切片和负染样品，点分 辨率的理论值可达1.4～2A。
②、扫描式电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）； 具有景深长，视野广，观察样品表面立体图像的特 点，其分辨率和放大倍数都远低于TEM，一般分辨率为 60A左右。 上述两种电镜可综合，兼有功能，是现代电镜发展 的代表（STEM）。
0.25um;
EM：电子波波长短,且波长随加速电压的增高而更短，目前较好
的电镜分辨率为0.2nm左右,比LM提高1000倍,比人眼提高100万倍. (注)：①由于电镜存在各种像差（包括球差、像散等）,限制了分辨率,不 能真正达到其波长的一半; ②分辨率还受到许多因素的影响,如切片的厚度等，超薄切片较薄 时,分辨率可达1～2.5nm,切片较厚时,实际分辨率为5～10nm.
2013-5-15 2
（一）、电镜技术发展简史
⑴、Robert Hooke(1665) & Leeuwenhoek(1674)发现细胞； ⑵、19世纪30年代,Schleiden(1938) & Schwann（1839）提 出 细胞学说(cell theory)； ⑶、1932年，德国Knoll & Ruska建造第一台电镜(Electron Microscope,EM, ×12);1933～1934年,电镜的性能已达 光镜的分辨率0.2um, ×10,000；1938-1939，第一批商 品电镜问世，分辨率达100A； 由于受到样品制备技术的限制，20世纪50年代初， 电镜技术才开始运用于生物医学方面的研究。 ⑷、细胞超微结构的分子细胞生物学的基础。
2013-5-15 10
2013-5-15
11
2013-5-15
12
2013-5-15
13
2013-5-15
14
2013-5-15
15
2013-5-15
16
③、扫描电镜的二次成像原理
扫描电镜一般可分为四个重要的组成部分： a、形成电子探针的电子光学系统； b、探针的电子束打击样品表面形成信息信号； c、检测系统； d、电子偏转系统（是电子探针在样品表面按 一定顺序扫描，并且使这一扫描过程与阴极射 线管的电子束在荧光屏上移动同步）。
2013-5-15 27
本课程的重点内容 ①电镜生物样品制备常规技术及应用范围; ②电镜图片的分析要领; ③正常细胞超微结构理论和超微病理内容的基本掌握。 学习要点 ①重视图像的分析和识别； ②注意LM和EM结合； ③形态与功能的联系； ④正常超微结构与超微病理的联系； ⑤建立整体的细胞结构和功能概念。 主要参考文献 ①电子显微镜术在临床医学的应用,杭振镳 蔡文琴主编,重庆出版 社,1988年8月,第一版； ②医学细胞生物学,宋今丹主编,人民卫生出版社,1997年5月,第一版； ③医用电子显微学，薄爱华主编,人民卫生出版社,2000年11月,第一版； ④超微病理学基础,武忠弼主编,人民卫生出版社,1990年9月,第一版； ⑤Ultrastructural Pathology of the Cell and Matrix . Third Edition Vol.1 Feroce N,Ghadially Butterworths 1988