生物医学电镜技术与细胞及组织超微结构总论

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7、电子染色：利用重金属离子对不同细胞结构的结合
能力不同，使各细胞结构对电子产生不同散射程度，以增 强明暗之比（反差）。
①常用的电子染色剂有以下几种
a、醋酸铀（Uranyl acetate），即醋酸双氧铀，多用于块染； b、枸橼酸铅（Lead citrate），用于片染，易被空气中的CO2污染。
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2、反差：
被观察物与其背景在亮度（黑白对比度）上有所不同，这种差别称为反 差；透射电镜的反差主要由样品对电子的散射产生。
3、空放大
不能提供更为清晰的图像放大，称为无效放大，也称无效放大。
4、不同分辨率的形态研究
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5、亚微结构与超微结构的概念及关系
亚显微结构（submicroscopic structure）：
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本课程的重点内容 ①电镜生物样品制备常规技术及应用范围; ②电镜图片的分析要领; ③正常细胞超微结构理论和超微病理内容的基本掌握。 学习要点 ①重视图像的分析和识别； ②注意LM和EM结合； ③形态与功能的联系； ④正常超微结构与超微病理的联系； ⑤建立整体的细胞结构和功能概念。 主要参考文献 ①电子显微镜术在临床医学的应用,杭振镳 蔡文琴主编,重庆出版 社,1988年8月,第一版； ②医学细胞生物学,宋今丹主编,人民卫生出版社,1997年5月,第一版； ③医用电子显微学，薄爱华主编,人民卫生出版社,2000年11月,第一版； ④超微病理学基础,武忠弼主编,人民卫生出版社,1990年9月,第一版； ⑤Ultrastructural Pathology of the Cell and Matrix . Third Edition Vol.1 Feroce N,Ghadially Butterworths 1988
介于细胞水平和大分子水平之间的结构；简称为 “亚微结构”或“亚细胞结构（subcellullar structure）”，也称“细微结构（fine structure）” 超微结构（ultrastructure）： 严格的讲，是指分子水平的结构，目前一般书刊 对亚显微结构和超微结构无严格的界限，往往将普通 光镜分辩界限以下的结构笼统称为超微结构。
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（一）、电镜技术发展简史
⑴、Robert Hooke(1665) & Leeuwenhoek(1674)发现细胞； ⑵、19世纪30年代,Schleiden(1938) & Schwann（1839）提 出 细胞学说(cell theory)； ⑶、1932年，德国Knoll & Ruska建造第一台电镜(Electron Microscope,EM, ×12);1933～1934年,电镜的性能已达 光镜的分辨率0.2um, ×10,000；1938-1939，第一批商 品电镜问世，分辨率达100A； 由于受到样品制备技术的限制，20世纪50年代初， 电镜技术才开始运用于生物医学方面的研究。 ⑷、细胞超微结构的分子细胞生物学的基础。
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1、取材的基本原则： 快：1min 小：1mm3 利： 静： 冷：4℃ 取材部位要准确； 成批取材，部位一致、； 标本的编号和标签。
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2、固定：
①、几种常用的固定剂的理化特性和使用原则： a、四氧化锇（Osmium tetroxide，OsO4）； 又称锇酸，是电镜生物样品使用最广泛的固定剂，兼有电 子染色作用，可作单固定，一般不用于电镜细胞化学实验的固定。 对糖原和核酸的保护作用差。多用于后固定。 b、戊二醛（glutaraldehyde，C5H8O2）； 不能单独作为电镜样品固定液，对脂肪的保护作用差。没有 “电子染色”的作用，通常用于前固定。 c、甲醛（formaldehyde）。 电镜多用多聚甲醛，对酶活性保存好，可与戊二醛混合或单 独用于细胞化学灌流固定或作为前固定液。
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1、电镜酶细胞化学术(electron microscopic cytochemistry of enzyme or ultracytochemistry of enzyme)
基本原理及内容:
酶细胞化学术（enzyme cytochemistry）是利用酶催化反应特点，从 亚微结构上研究酶的分布和活性。按其催化反应的性质可分为水解酶、氧 化还原酶、转移酶、裂解酶、合成酶和异构酶六大类，应用较多的有水解 酶和氧化还原酶。现以水解酶为例，介绍此技术的主要过程和基本原理。 初级反应：底物被磷酸水解酶作用后分解产生磷酸。 底物 磷酸水解酶 H3PO4 最终反应：磷酸与金属捕捉剂结合形成反应产物。 H3PO4 捕捉剂（如Pb2+） Pb3(PO4)2↓ 反应产物为电子致密的沉淀物，电镜下易于观察并显示出酶的定位。 近年来常用铈（ Ce3+）作为捕捉剂。
0.25um;
EM：电子波波长短,且波长随加速电压的增高而更短，目前较好
的电镜分辨率为0.2nm左右,比LM提高1000倍,比人眼提高100万倍. (注)：①由于电镜存在各种像差（包括球差、像散等）,限制了分辨率,不 能真正达到其波长的一半; ②分辨率还受到许多因素的影响,如切片的厚度等，超薄切片较薄 时,分辨率可达1～2.5nm,切片较厚时,实际分辨率为5～10nm.
WDS） II、能谱仪（energy-dispersive spectrometer ，EDS）
⑤、扫描探针显微镜(Scanning probe microscope,SPM): 原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)； 扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope,STM)。
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③、扫描电镜的二次成像原理
扫描电镜一般可分为四个重要的组成部分： a、形成电子探针的电子光学系统； b、探针的电子束打击样品表面形成信息信号； c、检测系统； d、电子偏转系统（是电子探针在样品表面按 一定顺序扫描，并且使这一扫描过程与阴极射 线管的电子束在荧光屏上移动同步）。
生物医学电镜技术与细胞及 组织超微结构
Biomedical Electron Microscopy and Cell & Tissue Ultrastructure
重庆医科大学电子显微镜室
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绪
论
电子显微镜（Electron Microscope , EM) 简称电镜，它是用电子束代替可见光的显微 装置，一种高放大、高分辨的大型精密仪器。 目前电镜已广泛应用于医学、生物学、农业、 工业、军事等多个领域。 EM在光学显微镜 基础上使细胞学的概念更加完善，对疾病的 认识,特别是对发病机理的研究做出了巨大 贡献。
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(三)、基本原理、构造及电镜的类型
电镜的基本构造及原理 ①、电子束主要特点： a、由电子组成，真空中直线前进，具波动 特性； b、电子束受电力和磁力作用； c、电子束照射样品时，能透过极薄样品， 得到透射电子，或产生二次电子，特征X射线， 背散射电子等。

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(二)、分辨率与形态研究的关系
1、分辨率（Resolution）
又称分辩本领（Resolving power），是将邻近两点清晰区分、辩认 的能力，用能被辨认的邻近两点的距离表示。
肉眼：在明视距离（25cm）时，为0.25mm； LM：可见光的平ห้องสมุดไป่ตู้波长为500nm，r=λ/2，LM的极限分辨率为
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应用
一般说透射电镜已能分辨出超微结构和某些化学成份，如糖原颗粒、核 糖体、染色质和脂类等。电镜酶细胞化学则着重显示各超微结构的酶特别是 标志酶，研究细胞器的化学、功能及其动态变化，由于电镜方法的限制，迄 今所能显示的酶为数尚少。 酶细胞化学技术主要用于：（1）酶在超微结构上的定位，（2）标记和 鉴定某些细胞和细胞器，（3）通过显示过氧化物酶，定位示踪HRP,（4） 利用免疫酶技术，电镜下显示特异性标记物的定位。 目前应用电镜技术常显示的标志酶有： 各种细胞器的标志酶
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③、超高压电镜（High Voltage Electron Microscope, HVEM）； 常规电镜加速电压一般在200KV以下，如果加速电压在 500KV以上，则称为HVEM。 特点:观察厚切片(0.5-3um)，提高分辨率。观察到原子 水平，期望观察生活标本（含水份） ④、分析电镜（ Electron Microscope Microanalyser， EMMA）； I、波谱仪（wavelength-dispersive spectrometer ，
②、固定方法：
a、双重固定法； b、体内原位固定法； c、灌流固定法。
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3、脱水：应递增浓度进行 4、浸透：半浸透 纯浸透 5、包埋、聚合：环氧树脂（epoxy resin）618#，Epon812 6、切片：修块 光切（半薄切片，0.5-1um） 定位
超切(超薄切片,50-70nm) 超薄切片机(ultramicrotome)，玻璃刀，钻石刀，复有支持膜的载 网（grid）（铜、镍、金网）。
②、电镜的基本构造：以透射电镜 为例
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电镜的类型
①、透射式电子显微镜(Transmission Electron Microscope, TEM)；
最常用、最典型，主要用于观察超薄切片和负染样品，点分 辨率的理论值可达1.4～2A。
②、扫描式电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）； 具有景深长，视野广，观察样品表面立体图像的特 点，其分辨率和放大倍数都远低于TEM，一般分辨率为 60A左右。 上述两种电镜可综合，兼有功能，是现代电镜发展 的代表（STEM）。
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扫描电镜的结构示意图：
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(四)、细胞超微结构研究的展望
①、二维 三维，如三维重建技术； ②、从单纯的形态观察,深入到对其功能、代谢、 化学组成、分子结构及元素分布的研究。如X 线显微分析(electron probe x-ray microanalysis)； ③、定性描述 定量测定方向发展，如电镜 形态测量技术（morphometry）； ④、从经化学固定的结构向活细胞整体方向发展， 如超高压电镜技术的应用； ⑤、仪器设备向小型化方向发展。
②电子密度（electron density）的概念：
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（二）、负染技术
利用高密度无结构的重金属物质把生物标本 包绕起来。这种反差是负像（与正染色的超薄 切片相比较）。最常用的染色剂是磷钨酸钠 （phosphotungstic acid，PTA），此法常用于病 毒、蛋白分子或细胞亚单位的分子结构研究， 制样简单，可作快速诊断。
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电镜生物样品制备技术
样品制备是电镜技术中一个很重要的组成
部分，是电镜工作中最繁重的环节。要学习掌
握好细胞超微结构知识及应用电镜技术进行研
究工作，都必须首先了解电镜的标本制备技术，
故属于本课程的重点内容。
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（一）、超薄切片及其染色技术
超薄切片（ultrathin-section）制备过程示意图：
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（三）、电镜细胞化学技术
（electron microscopic cytochemistry） 在保持细胞超微结构完整的条件下，借助细 胞中的化学反应，研究细胞乃至细胞器的结构与 功能的关系，是与化学、生物化学及免疫学有密 切联系的一门学科。广义的电镜细胞化学研究方 法主要有细胞超微标记示踪技术、电镜酶细胞化 学技术和电镜免疫细胞化学技术（简称免疫电镜 技术）等几种。